Recherche appliquée

104 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés seuls pendant dix-sept jours, reçoivent des administrations orales quotidiennes puis un composé anti-obésité, et passent en cage à calorimétrie avant d'être tués pour prélever le foie et le tissu adipeux. Le porteur qualifie l'isolement d'"incontournable" au nom de la "nécessité" de mesurer individuellement les dépenses énergétiques, alors que le rat est un animal social. Les composés testés relèvent d'un développement commercial visant une éventuelle mise sur le marché.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de composés développés en tant que traitements anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez le rat sauvage.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les dépenses énergétiques, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux recevront des administrations quotidiennes de véhicule pendant 7 jours avant traitement pour les habituer à la procédure d'administration. Le traitement en lui-même est aigu et donc limité à une seule administration. Le poids corporel des animaux sera mesuré 7 fois au cours de l'étude. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d'un système de mesure par calorimétrie indirecte pendant 72h (24h d'habituation suivies de 48h de mesure).

Impact sur les animaux

L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les rats qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer les dépenses énergétiques, l'activité locomotrice et la prise alimentaire individuels lors du passage dans les cages métaboliques. Si les animaux n’étaient isolés que pendant les mesures en cages métaboliques, cet isolement soudain pourraient induire un stress sur les animaux et perturber la validité des mesures. C’est pourquoi nous préférons isoler les animaux dès réception, et les laisser s’habituer à cet état pendant ls 14 jours que précèdent la mesure en cages métaboliques. . Il est à noter que pour ces dernières, les méthodes d'enregistrement employées sont totalement non-invasives. Les traitements par voie orale et les mesures de poids corporel à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances. Enfin, à l'issue de l'étude, les rats seront mis à mort par administration d'Euthasol (Virbac).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes prélevés (tissus adipeux, foie) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur les dépenses énergétiques, le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant les 17 jours de l'étde du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes spécifiques pour rongeurs. Les expérimentateurs en charge de la manipulation des animaux et des administrations orales sont rodés à ce type de pratique. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Dans ce cadre, en cas de besoin, une analgésie sera mise en place par administration de buprénorphine.

Choix des espèces

Le modèle rat Sprague Dawley a été choisi afin de conserver le même modèle que celui employé dans des études précédentes réalisées par le client, notamment des études préalables de pharmacocinétiques. Les animaux seront utilisés à l'âge jeune adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

100 moutons vont être utilisés, brebis gestantes et agneaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et une partie des brebis réutilisée dans d'autres projets. Chaque brebis subit trois laparotomies sous anesthésie générale, tandis qu'une malformation de la moelle épinière est créée chirurgicalement chez son fœtus à mi-gestation, puis réparée, avant une naissance par césarienne et six mois de vie suivis de la mise à mort. Le porteur indique un taux de fausse couche d'environ 40 %, imposant d'opérer 50 fœtus pour obtenir 30 agneaux vivants. L'objectif est de tester une thérapie cellulaire avant un éventuel passage chez le fœtus humain, les bénéfices annoncés restant au conditionnel.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer le bénéfice de l’utilisation de la thérapie cellulaire comme traitement adjuvant de la chirurgie in utero (pendant la grossesse) des myéloméningocèles (MMC) dans le modèle ovin, avant les essais chez le fœtus humain. La MMC est une malformation congénitale ayant des conséquences neurologiques sévères. Les lésions cérébrales associées peuvent entraîner une déficience intellectuelle en général modérée. Les personnes atteintes peuvent présenter un handicap moteur (déficit moteur et angle anormal des jambes, raideur) nécessitant une assistance orthopédique, des anomalies de la colonne vertébrale, de l’incontinence urinaire et/ou anale nécessitant des auto-sondages, un traitement par laxatifs et des lavements rectaux. Il est démontré que la chirurgie des MMC in utero apporte un bénéfice pour les enfants, comparée à une chirurgie réalisée après la naissance, en améliorant leurs fonctions motrices (capacité à marcher) et les potentielles complications cérébrales liées à cette malformation. Cependant ce bénéfice reste moindre puisque 71% des enfants restent dans l’incapacité de marcher sans orthèses à l’âge scolaire et 62% d’entre eux sont contraints à réaliser des sondages urinaires quotidiens. Depuis 2 ans la thérapie cellulaire est expérimentée comme traitement adjuvant de la chirurgie in utero à ciel ouvert des myéloméningocèles chez le fœtus ovin. Les derniers résultats sont extrêmement prometteurs avec une nette amélioration des capacités de déambulation à la naissance chez les agneaux. Il existe deux techniques de chirurgie in utero des MMC chez le fœtus humain : la chirurgie “à ciel ouvert”(c’est-à-dire avec ouverture de l'utérus) et une chirurgie moins invasive dite foetoscopie impliquant la réalisation de mini-incisions pour le passage des instruments, ce qui permet de limiter le risque d’accouchement prématuré et qui permet un accouchement par les voies naturelles. À ce jour, les expérimentations de la thérapie cellulaire n’ont eu lieu que lors de chirurgies à ciel ouvert. Il est maintenant nécessaire d’expérimenter l’utilisation de ces cellules en utilisant la fœtoscopie, avec l’utilisation d’une solution liquide de cellules plutôt qu’un patch pour pouvoir l’introduire par ces mini-incisions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer une amélioration du pronostic des agneaux ayant eu une greffe de cellules au cours de la chirurgie in utero par fœtoscopie, sans induction de tumeurs: - bénéfices cliniques à court et moyen terme (6 mois de vie) : amélioration du score de motricité des agneaux, score SLR (Sheep Locomotor Rating) - bénéfices histologiques : augmentation de la densité neuronale au niveau de la moelle épinière et diminution de la fibrose entre la moelle et le tissu cutané pour les agneaux ayant reçus les cellules souches - absence de tumeur 8 mois après la greffe des cellules (53 jours de vie prénatale + 6 mois de vie postnatale)

Procédures

Chaque brebis sera soumise aux procédures chirurgicales suivantes, toutes réalisées sous anesthésie générale : 1/ temps n°1 au 75e jour de gestation : laparotomie et ouverture de l’utérus sous anesthésie générale Durée : environ 30 minutes 2/ temps n°2 au 90e jour de gestation : laparotomie et mise en place de trois trocarts intra-utérins pour fœtoscopie sous anesthésie générale (passage de trois tubes au travers de la paroi utérine pour passe une caméra et des instruments) Durée : environ 90 minutes 3/ temps n°3 au 143e jour de gestation : laparotomie et ouverture de l’utérus sous anesthésie générale Durée : environ 15 minutes Chaque agneau (n= 50) sera soumis aux procédures chirurgicales suivantes, toutes réalisées sous anesthésie générale : 1/ création chirurgicale de la myéloméningocèle au 75e jour de gestation sous anesthésie générale : Durée : environ 20 minutes 2/ réparation chirurgicale de la myéloméningocèle à 90 jours de gestation Durée : environ 30 minutes 3/ Naissance par césarienne à 143 jours de gestation Après la naissance, les agneaux sont maintenus en vie pendant 6 mois. Aucun prélèvement n’est prévu pendant ces 6 mois. 4/ Mise à mort à 6 mois de vie Chaque agneau sera mis à mort après 6 mois de vie pour dissection anatomique et analyse histologique afin de rechercher une amélioration de la réparation de la moelle épinière ainsi que l’absence de tumeurs chez les agneaux ayant bénéficié de la thérapie cellulaire lors de la chirurgie in utero de leur myéloméningocèle.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes Pour les brebis : - mobilité réduite de J70 de gestation à J143 de gestation (temps pendant lequel elles sont hébergées en vue des chirurgies) : effet indésirable diminué par la possibilité de sortir les animaux des cages afin de favoriser une déambulation plus libre - douleurs post opératoires : effet indésirable prévenu par une surveillance très rapprochée et un protocole précis de prise en charge de la douleur. Pour les agneaux au cours de la vie prénatale : - Douleurs per opératoires : effet indésirable prévenu par un protocole d'anesthésie/analgésie passant la barrière placentaire (similaire à ce qui est réalisé chez le fœtus humain) Pour les agneaux au cours de la vie postnatale : - mobilité réduite : effet indésirable diminué par la possibilité de sortir les animaux des cages afin de favoriser une déambulation plus libre - potentiels troubles locomoteurs secondaires à la création de la malformation : il est possible que les agneaux présentent des troubles de la déambulation à l’instar des symptômes observés chez les enfants présentant une MMC. - potentiels troubles sphinctériens secondaires à la création de la malformation : il est possible que les agneaux présentent une incontinence urinaire à l’instar des symptômes parfois observés chez les enfants présentant une MMC.

Devenir

Les brebis gestantes seront maintenues en vie après la chirurgie de création et après la chirurgie de réparation. Elles seront mises à mort au cours de la césarienne, après clampage du cordon ombilical. Les brebis ne peuvent être réhabilitées car elles auront eu trois laparotomies. En revanche, 40% de l’effectif des brebis seront réutilisées dans d’autres projets de recherche au cours de procédures sans réveil, à l’issue des césariennes. Les agneaux seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 6 mois, après avoir été opérés in utero à deux reprises et être nés par césarienne. Leur maintien en vie permettra de rechercher un effet pérenne de la thérapie cellulaire ainsi que de l’absence de formation tumorale 8 mois après la greffe des cellules. La mise à mort à 6 mois permettra une analyse histologique pour comprendre le potentiel bénéfice clinique observé (amélioration des capacités de déambulation) en examinant la moelle épinière et les muscles des pattes postérieures. Cette analyse histologique permettra également de s’assurer de l’absence de développement de tumeur avec certitude.

Remplacement

Les expérimentations in vitro préliminaires aux expérimentations in vivo ont permis de s’assurer en amont de la vitalité des cellules greffées, de leurs fonctions neuroprotectrices ainsi que de déterminer le nombre de cellules à greffer. Ce projet de recherche a pour objectif l’expérimentation d’une thérapie à visée humaine. Bien qu’une activité paracrine ayant un effet neuroprotecteur ait été démontré in vitro, l’expérimentation de cette thérapie chez des modèles chirurgicaux animaux est indispensable pour pouvoir étudier la réelle efficacité de ces cellules in vivo et l’absence d’effets secondaires néfastes.

Réduction

Des expérimentations in vitro menées en amont ont permis de potentialiser les expérimentations in vivo, notamment en déterminant le nombre de cellules à inclure dans les patchs. Des brebis présentant une gestation singleton (un seul agneau) seront dans le mesure du possible sélectionner afin de limiter le nombre d’agneaux jumeaux. Des résultats préliminaires nous ont permis de calculer le nombre minimal d’animaux à inclure pour permettre une analyse statistique et de tirer des conclusions pertinentes. Le critère de jugement principal sera le score de motricité validé chez le modèle ovin. Les autres paramètres statistiques étudiés seront : la présence de mouvements de la queue, la miction spontanée, l’amyotrophie des pattes postérieures, l’aire de la moelle épinière, la densité neuronale, l’épaisseur de la fibrose. Les variables quantitatives seront comparées en utilisant un test de Mann-Whitney et les variables qualitatives en utilisant un test du Chi2. Le taux de fausses couches après réalisation de deux chirurgies in utero est élevé, atteignant environ 40 %. Il est donc nécessaire d’opérer 50 agneaux pour obtenir 30 agneaux vivants à la naissance (15 dans chaque groupe). Il est malheureusement difficile d’imaginer une réhabilitation des brebis car elles auront subi trois laparotomies. Cependant, il est prévu de réutiliser les brebis sur des procédures de recherche sans réveil.

Raffinement

Les animaux sont pris en charge dans des locaux adaptés pour l’accueil des brebis et des agneaux avec la possibilité de sortir les animaux. Le personnel est qualifié et diplômé et a une grande expertise en expérimentation animale. Un habitat adapté et enrichi sera mis en place, en limitant l’isolement des brebis à 5 jours après chaque chirurgie et en leur permettant de voir et d’entendre les autres brebis pendant cette période. Chaque intervention sera réalisée sous anesthésie générale maternelle avec une analgésie fœtale complémentaire si nécessaire. Un traitement antalgique sera administré de manière systématique durant les 5 jours qui suivent chaque chirurgie. La surveillance des agneaux sera réalisée toutes les trois heures pendant les 48 premières heures de vie, puis au minimum trois fois par jour au-delà. Plusieurs fonctions seront évaluées (locomotion continence anale et uriniare, capacité à se nourrir) et seront la base des points limites, avec des scores. En fonction des scores obtenus, une réponse graduée sera effectuée avec mise en place de traitement de physiothérapie, laxatifs, aide à la miction et biberonnage. En cas de non réponse aux traitements mis en place ou en cas de score trop sévère, les décisions d’arrêt seont prises de façon conjointe entre vétérinaires expérimentés.

Choix des espèces

Le modèle ovin de MMC représente le modèle animal le plus proche de la malformation observée dans l’espèce humaine. Ce modèle permet de retrouver les anomalies cérébrales présentes dans l’espèce humaine en cas de MMC (malformation de Chiari de type 2). Il a été validé par de nombreuses équipes dont la nôtre. En plus de mimer la pathologie humaine, le modèle ovin présente de nombreux avantages pour la réalisation de notre projet. Premièrement, ces animaux sont porteurs de grossesses gémellaires ou singletons ce qui facilite le parallèle avec l’espèce humaine. Deuxièmement, la taille de l’animal permet aisément de réaliser une chirurgie sur les fœtus. Enfin, le temps de gestation (145 jours) permet l’organisation de deux chirurgies successives tout en étant suffisamment court pour limiter la durée de l’étude dans des délais tolérables. Il s’agit de brebis sexuellement matures. La création chirurgicale de la MMC aura lieu au 75e jour de gestation (soit à la moitié de la gestation) : cet âge gestationnel est celui validé par les nombreux auteurs ayant travaillé sur ce sujet. Le terme de 75 jours a été choisi car il paraissait difficile d’intervenir chirurgicalement sur les fœtus plus précocement du fait de leur fragilité. La réparation de la MMC aura lieu 90e jour de gestation (0,6 gestation): ce délai a été choisi entre les deux interventions car il est est nécessaire à la survenue de la malformation deChiari. Un délai plus court ne permettrait pas de conclure au succès de la technique chirurgicale en cas de correction de la hernie cérébelleuse. La naissance des agneaux est prévue à 143 jours afin de n’induire aucune prématurité qui pourrait mettre en péril la survie des agneaux et nuire à l’obtention des critères de jugements, notamment cliniques.

4 725 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie des os de verre, elles présentent des fractures spontanées et subissent biopsies de l'oreille, prélèvements sanguins, injections répétées et jusqu'à dix scanners sous anesthésie, pour tester une biothérapie. Le porteur décrit les fractures comme seul symptôme et affirme n'attendre aucun effet indésirable des gestes techniques. Il conclut que le recours à des souris malades reste "inévitable" et renvoie l'effet pour les patients à un "bénéfice probable à long terme".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer un traitement pour la maladie des os de verre. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif pour cette maladie. Les seules approches thérapeutiques actuellement utilisées sont des approches palliatives et seulement pour certains symptômes de la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour la maladie des os de verres. Il s’agit d’une maladie rare de fragilité osseuse responsable de fractures spontanées pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice probable à long terme pour ces patients.

Procédures

Biopsie d'oreille sur animal vigile 2-3mm durée 10 sec Prélèvements de sang 10-20 sec, 1 par semaine maximum sur animal vigile ou anesthésié Injection IntraPéritonéale (animal vigile) et IntraVeineuse (animal anesthésié) 10-30 sec, 1 à 3 par semaines maximum, Scanner avec anesthésie gazeuse d'une durée maximum de 10 min par scanner et au maximum 10 scanners dans la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris utilisé est un modèle de la maladie des os de verres qui présentent les memes symtomes que les patients soit des fractures spontanées. Cependant, les animaux ne présentent pas de problèmes pour se mouvoir ou s’alimenter aux âges où nous les utiliserons. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les gestes techniques réalisés sur ces animaux, il n'y a pas d'effets indésirables prévues. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés dans le but de prélever des organes pour réaliser une caractérisation histologique des tissus.

Remplacement

Globalement, la construction des molécules et l’optimisation de ces dernieres se sont faites et continuent à se faire en se basant sur des publications scientifiques, et sur un certain nombre de tests in vitro réalisés. Seules les molécules efficaces in vitro vont être testées in vivo. Une importante recherche bibliographique a été effectuée afin d’identifier les cellules atteintes lors de la pathologie et ainsi développer un traitement le plus ciblé possible. Cependant l’utilisation de souris malades est inévitable afin de déterminer le bénéfice thérapeutique ainsi que d’évaluer les potentiels effets toxiques du traitement.

Réduction

Le juste nombre d’animaux a été calculé de manière à utiliser le nombre minimum d’animaux par lot, tout en produisant des résultats statistiquement significatifs et robustes. De manière à répondre aux exigences de réduction, nous allons utiliser des groupes contrôles en commun chaque fois que cela est possible. Globalement, un ensemble de 10-12 animaux par groupe sera suffisant pour valider l’efficacité d’un traitement. Ce modèle étant un nouveau modèle de souris, il est possible que ce nombre soit amené à changer au cours des études et des différents résultats obtenus.

Raffinement

Chaque cage contient une tige en papier, un igloo et une buchette de peuplier afin de satisfaire l’instinct naturel des souris à ronger et éviter les problèmes dentaires. Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. Les procédures mises en place dans ce projet ne nécessitent aucune analgésie particulière. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et euthanasiés dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant d’Ostéogénèse imparfaite, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie, et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs. Ce modèle de souris est pertinent car il est connu pour mimer les principales caractéristiques de la pathologie. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu’à environ 52 semaines maximum afin de pouvoir caractériser chacune des étapes du développement de la pathologie.

Un rongeur qui perd plus de 15 % de son poids, ou plus de 10 % pendant plus de trois jours, atteint le point limite de ce projet. 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie. Pour suivre l'absorption et l'élimination de composés chimiques ou biologiques, parfois radioactifs, l'équipe administre ces composés par toutes les voies possibles, jusque dans le cerveau ou la vessie, ou par minipompe posée en chirurgie, avec des jeûnes jusqu'à 16 heures, une privation d'eau jusqu'à quatre heures, un hébergement individuel sans enrichissement pour recueillir urines et fèces, et des phases in vivo jusqu'à douze mois. Le porteur annonce pourtant "pas d'effets indésirables particuliers", avant d'admettre que les composés peuvent se révéler toxiques. 10 220 rongeurs sont déclarés réutilisés, une possibilité que le porteur réserve à ceux restés moins d'une semaine après une dose unique non radioactive, et les autres sont tués pour récupérer organes et grands volumes de sang.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. La deuxième procédure aura le même objectif mais avec recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Afin d’évaluer la pharmacocinétique de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h, Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vis sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.

Devenir

Après la procédure numéro 2, et dans une grande partie des cas pour la procédure 1, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux de la procédure 1 ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids , les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales, intravésicales, les prélèvements de liquide cérébrospinal et les poses de mini-pompes osmotiques ou d’un implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (buprénorphine au moins 30 minutes avant). Pour les pompes et implants, les animaux seront hébergés individuellement et suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie suturée (en général 3-4 jours) et des soins locaux seront apportés si nécessaire. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique (buprénorphine).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Les cellules injectées dans le cerveau des souris et des rats de ce projet sont fournies par un client, et les effets indésirables à prévoir seront anticipés d'après les informations que transmettront les donneurs d'ordre. 2 250 rongeurs, 1 125 souris et 1 125 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue puis autopsiés pour prélever leurs organes. Nourris chaque jour d'un aliment contenant 0,2 % de cuprizone pour provoquer une maladie démyélinisante, ils reçoivent selon les groupes une injection unique de cellules par stéréotaxie sous anesthésie, pour des protocoles de deux jours à six mois. Le porteur évoque des phases de douleur aiguë puis chronique, des points limites et un suivi de la locomotion et de la sensibilité mécanique deux ou trois fois par semaine. Sur le remplacement, il recopie mot pour mot son paragraphe sur les effets indésirables, sans citer aucune méthode de substitution.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)

Procédures

L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.

Remplacement

Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.

Choix des espèces

Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

Greffées de cellules cancéreuses du foie, sous la peau ou directement dans le foie sous échographie selon les groupes, 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent un anticorps deux fois par semaine pendant quatre semaines, injecté sans anesthésie, certaines passent deux échographies hebdomadaires de 20 à 30 minutes sous anesthésie générale, et toutes sont mises à mort après un prélèvement de sang terminal pour récupérer tumeurs et foies. L'équipe veut confirmer chez des souris au système immunitaire fonctionnel l'effet de son anticorps, déjà entré en essai clinique pour d'autres maladies du foie, seul ou associé aux immunothérapies existantes. Le porteur qualifie les effets indésirables de "très limités", puis décrit des ulcérations possibles de la peau sur les tumeurs sous-cutanées, une gêne et des douleurs quand la tumeur du foie grossit, et des douleurs aux points d'injection répétés.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Une autre partie des animaux recevra une injection unique de cellules cancéreuses directement dans le foie grâce à un système échographique, réalisée sous anesthésie générale, sans subir de procédure chirurgicale. Cette procédure prend environ 15 minutes à être réaliser. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Certains animaux subiront une échographie de 20-30 minutes, sous anesthésie générale, 2 fois par semaine, afin de suivre la croissance tumorale dans le foie des animaux. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Pour les souris injectées sous la peau, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée. Pour les souris injectées dans le foie, la tumeur peut entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées intrapéritonéales peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement

45 souris immunodéprimées NOD Scid vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le ventre ouvert sur 5 à 6 millimètres, chacune reçoit dans la prostate une greffe de cellules tumorales prostatiques humaines, puis un traitement de 120 secondes à la torche à plasma froid par la même voie, le protocole durant une semaine. L'équipe veut savoir si ce plasma pourrait éliminer les cellules tumorales restées en bordure de l'ablation chirurgicale de la prostate chez l'homme, et reconnaît que la réaction du site greffé au plasma "reste inconnue", d'où un suivi renforcé d'une possible réponse inflammatoire. Sur le remplacement, le porteur indique avoir mis au point la torche sur lignées cellulaires, et présente la souris comme correspondant "au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines".

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

a procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque réduit à 1 semaine. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, celle-ci reste inconnue. Ainsi comme indiqué pour cette procédure, un suivi renforcé des animaux sera mis en place, notamment pour évaluer une potentielle réponse inflammatoire qui pourrais dégrader l'état général de l'animal.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés.

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrit dans la présnte demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

Les femelles sont achetées déjà gestantes chez un fournisseur, et les mâles employés pour la défaite sociale sont d'anciens reproducteurs de plus de quatre mois. 510 souris C57Bl/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe met au point un protocole de stress précoce dérivé de la défaite sociale, comparé à une séparation maternelle couplée à un sevrage précoce, pour faire apparaître chez les petits devenus adultes des comportements apparentés à l'anxiété et à la dépression. Une partie des souris subit jusqu'à deux prises de sang à la queue, éveillée, et des séances de comportement cinq jours sur sept pendant trois à quatre semaines, sous une restriction alimentaire qui maintient leur poids à 90 % de la normale, sans que les tests soient nommés. Les petits sont tués pour prélever leur cerveau, et les mâles et les mères sont tués ou réutilisés dans d'autres expériences du laboratoire "à chaque fois que ce sera possible", soit 150 souris déclarées réutilisées.

Objectifs

L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.

Procédures

Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure.

Impact sur les animaux

- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).

Devenir

Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.

Réduction

Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.