Recherche appliquée

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intramusculaires sous anesthésie et une mesure de force musculaire, avant d'être tués pour analyses histologiques. Le porteur décrit une dystrophie spontanée avec perte de masse et comportement de "freezing", et présente le rat comme un modèle plus fidèle que la souris. Il situe à long terme l'usage de la protéine testée chez les enfants atteints, en complément de la thérapie génique.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse). Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de la dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire qui favoriserait la croissance musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques utilisant les vecteurs viraux sont confrontées à des limites comme leur disparition consécutive aux cycles répétés de nécrose-régénération des fibres musculaires dystrophiques. La protéine-médicament testée dans ce projet a été décrite comme étant un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Nous avons donc comme objectif d’évaluer le supposé bénéfice de sa supplémentation dans le muscle dystrophique de rats modèles de la DMD, avec pour objectif de renforcer le dossier préclinique préparatoire au montage d’un essai clinique chez les enfants attteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés pour optimiser la restauration fonctionnelle des muscles dystrophiques. La protéine testée joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire en maintenant plus longtemps actif le processus de régénération des fibres musculaires. A court terme, nous attendons chez les rats DMD traités un bénéfice avec une amélioration du phénotype histologique et fonctionnel du muscle dystrophique traité. A moyen terme, nous envisageons en cas de succès de combiner l’utilisation de cette protéine avec une restauration de dystrophine, induite par un vecteur viral codant la microdystrophine, une forme raccourcie de la dystrophine utilisée aujourd’hui dans des essais cliniques. A long terme, nous projetons d’utiliser cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront injectés par voie intramusculaire une fois dans le muscle de la patte gauche puis une fois dans celui de la patte droite. Cette intervention est rapide (moins de 10 minutes). La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Il n'y a pas de chirurgie prévue. Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement sera réalisé pendant l’anesthésie de la mesure de force, le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes). La séquence d'enregistrement de la force musculaire dure au total 1 heure (jusqu'au réveil).

Impact sur les animaux

Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. L’injection intramusculaire pouvant être douloureuse, des analgésiques seront utilisés avant et poursuivis après l’intervention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. Nous avons préalablement contrôlé que les voies de la protéine testée étaient bien activées en utilisant in vitro des cellules stimulées avec cette protéine et nous avons réalisé les premières expériences in vivo chez un modèle de souris de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui, tester son efficacité sur un modèle plus sévère et plus proche de l'affection humaine. L’utilisation du rat DMD nous parait donc indispensable pour évaluer un éventuel bénéfice de cette protéine sur des processus tels que la régénération et le maintien de la masse musculaire pendant plusieurs semaines au cours de la phase active du processus pathologique.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre un maximum de 3 rats par cage. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

60 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée pour analyse et le reste réutilisé ou gardé en vie selon l'avis du vétérinaire. Chaque animal subit sous anesthésie jusqu'à dix injections intradermiques et dix biopsies de peau, après tonte des flancs, pour évaluer la tolérance cutanée de composés candidats médicaments. Le porteur indique que les composés testés peuvent provoquer irritations, inflammations et gonflements. Il rappelle que les dossiers réglementaires exigent au moins deux espèces dont une non-rongeur et retient le mini-porc pour la proximité de sa peau avec celle de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la tolérance de composés au niveau du derme de la peau. Les informations apportées permettent de modéliser le comportement de la molécule dans l’organisme, et contribuent au choix de la voie d’administration et/ou des doses pour les études réglementaires soumises aux autorités de santé pour l’enregistrement de tout nouveau médicament. Elles participent à la sélection de molécules en vue d’une future administration chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les études réalisées dans le cadre de ce projet ont pour but d’évaluer la réaction cutanée suite à l'injection de molécules avant le passage au stade clinique afin d’anticiper les éventuels effets indésirables. Le bénéfice attendu est une meilleure connaissance du comportement biologique des molécules testées, ce qui permettra d’adapter si besoin les conditions d’administration pour permettre d’améliorer la sécurité en vue d’une future administration chez l’Homme.

Procédures

Tonte sous anesthésie : maximum 30 minutes si les 2 flancs sont tondus Injections intradermiques sous anesthésie : maximum 1min pour une injection intra dermique de 100µl Biopsies sous anesthésie et analgésie : environ 5 sec par prélèvement Au total chaque animal recevra au maximum : 10 injections intradermique et sera soumis à 10 biopsies de peau.

Impact sur les animaux

Les tontes, les administrations intradermiques et les biopsies devant être réalisées sur un animal parfaitement immobile, les animaux seront anesthésiés afin d’éviter une contention prolongée, et de limiter au maximum leur stress et d’éviter toutes lésions/irritation après la tonte par exemple. Les prélèvements pouvant potentiellement induire une certaine douleur, une analgésie est prévue. Les composés testés pourront induire des irritations, inflammation, gonflement et feront donc l’objet d’un suivi quotidien des animaux.

Devenir

Les animaux surnuméraires ou les animaux de l’étude pourront être réutilisés dans une autre procédure expérimentale si aucun effet sévère n’est observé à la fin de l’étude, qu’ils ont recouvré leur bien-être général et après avis favorable du vétérinaire désigné. Certains animaux pourront éventuellement être replacés après accord du vétérinaire désigné. D’autres seront euthanasiés afin de prélever des tissus en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Un organisme entier est nécessaire pour caractériser la réaction cutanée de molécules présentant un potentiel thérapeutique, en effet aucun modèle non animal à l’heure actuelle ne peut modéliser la complexité de la réponse immunitaire locale des différentes couches de la peau.

Réduction

Les molécules évaluées auront auparavant été testées dans des tests sur des cellules en laboratoire in vitro afin de n’évaluer que des molécules présentant un potentiel thérapeutique élevé et ainsi réduire le nombre de mini porcs utilisés dans ce projet. Des groupes de 8 animaux au maximum seront utilisés pour évaluer chaque molécule (4 males et 4 femelles). Cependant 4 animaux seront préférentiellement utilisés pour chaque molécule dans le cas où les effets potentiels du produit sont indépendants du sexe de l’animal, ce qui permet d’obtenir des analyses statistiques robustes et une interprétation scientifique des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, un effort sera porté sur la réutilisation d'un même animal, après avis favorable du vétérinaire désigné, pour tester une autre voie d’administration, une autre formulation, ou un autre candidat médicament. Dans ce cas, un délai sera respecté pour que l’animal puisse récupérer et pour garantir l’élimination de la molécule de l’organisme.

Raffinement

A l’arrivée, une période d’acclimatation d’au moins 15 jours sera appliquée afin qu’ils s’habituent à l’environnement, aux conditions d’hébergement et aux interactions avec le personnel. La première semaine, les interactions seront limitées à la présence humaine, y compris dans les box avec possibilité de contact physique (palpation des oreilles, cou, dos, pattes…) et habituation à la pesée. A partir de la semaine2, l’habituation aux situations auxquelles les animaux pourront être soumis dans l’étude pourra commencer avec l’habituation aux techniques de contention (préhension, mise en place dans le hamac, …) afin de limiter le stress des animaux pendant l’étude. Aucun geste invasif ne sera pratiqué pendant cette période. Si cela ne nuit pas à l’expérimentation, un morceau de fruit pourra être donné en récompense, et le milieu environnemental pourra être enrichi par l’apport de jouets adaptés (balles, mordillots…). De la musique peut également être présente dans les salles d’hébergement. Afin de limiter le stress, les animaux pourront être légèrement anesthésiés par anesthésie gazeuse au masque de courte durée avant les tontes, administrations et les prélèvements, à condition que cela n’interfère pas avec les objectifs de l’étude. Cette anesthésie restera de courte durée et sera réalisée en plaçant l’animal sur un tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie. Une analgésie est prévue pour les biopsies de peau. Afin de s’assurer du bien-être animal, les animaux seront observés quotidiennement. En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. Après les biopsies, un pansement sera appliqué sur la plaie, En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude.

Choix des espèces

Les dossiers réglementaires nécessaires à l’enregistrement de nouveaux médicaments requièrent des données d’études sur au moins deux espèces animales mammifères dont une non-rongeur. Le mini porc est une des espèces non-rongeur qui peut être utilisée. En particulier, le mini porc est souvent utilisé pour les études concernant les réactions cutanées en raison des similarités physiologiques et morphologiques avec la peau humaine, décrites dans la littérature. Les mini porcs utilisés sont âgés au minimum de 6 semaines à réception (animaux sevrés) et au maximum de 12 mois. D’une manière générale, le poids est un facteur déterminant pour la quantité de médicament administré à l’animal (souvent en faible quantité à ce stade de développement) mais également en termes de manipulation de l’animal. Aussi l’âge maximal est fixé à 12 mois pour limiter les difficultés de contention qui peuvent être préjudiciables au bien-être animal. Les animaux seront préférentiellement utilisés à partir de 9 semaines. En effet, c’est à cet âge que l’épaisseur des différentes couches de la peau se rapproche de celle de l’Homme adulte.

4 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la listériose, par gavage ou injection intraveineuse, puis pesées quotidiennement, certaines recevant du tamoxifène ou des anticorps, et peuvent développer diarrhées et infections d'organes dont le cerveau. Le porteur situe le projet dans la recherche fondamentale sur les interactions entre la bactérie et son hôte, et indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité d'un "organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Listeria monocytogenes (Lm) est la bactérie responsable de la listériose, maladie humaine d'origine alimentaire. Lm peut atteindre le cerveau et induire des méningites et encéphalites, en particulier chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 %. La listériose peut aussi se traduire par une infection materno-fœtale chez les femmes enceintes, provoquant fausses-couches, accouchements prématurés ou infections néonatales. Les objectifs de ce projet sont de déterminer les rôles des facteurs bactériens et de l’hôte, y compris le microbiote intestinal, dans la listériose. L’étude de la listériose est importante pour comprendre cette pathologie, mais également pour mieux appréhender la réponse de l’hôte à un pathogène intracellulaire facultatif.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses et en particulier sur la listériose. Cette maladie tue chaque année plus de 300 personnes en France. Elle constitue donc un problème de santé publique ainsi que pour l’industrie agro-alimentaire. Elle est également un modèle précieux pour la compréhension des interactions entre une bactérie intracellulaire facultative et son hôte. Une meilleure compréhension du mécanisme de dissémination des bactéries dans l'organisme et de la réponse immunitaire mise en place est en soi importante pour l’évolution des connaissances et constitue un prérequis indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques multi-cibles innovantes et efficaces. Même si nos recherches se focalisent sur Lm, une grande partie de nos approches et résultats pourrait être étendu à l’étude d’autres pathogènes..

Procédures

1128 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), avec un ou des composants du microbiote (ou PBS en contrôle) puis, 30 jours après, à un nouveau gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes, pathogène pour l’homme et l’animal. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement, et les fèces prélevés (durée d’environ 2 minutes dans une boîte individuelle). 600 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 240 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 324 souris seront soumises à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces animaux recevront 10 injections de tamoxifène ou de solvant contrôle (huile d’olive) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). 5 injections avant et 5 injections après inoculation de Listeria. L’injection de tamoxifène pourra être remplacée par l’ajout de tamoxifène dans la nourriture, si ce mode de délivrance est efficace pour notre modèle. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 480 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes. Parmi ces souris, 240 recevront 3 injections d’anticorps anti-Il-10 (ou anticorps contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 2 injections avant et une injection le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 60 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 60 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces 120 souris recevront 3 injections d’inhibiteur d’EVH1 (ou contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 1 injection avant et 2 après le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. Les animaux sont susceptibles de développer des diarrhées, des infections de différents organes y compris le cerveau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude de la physiopathologie de la listériose. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité d’un organisme vivant dans son intégralité, y compris les conditions très spécifiques pour maintenir un microbiote sous conditions physiologique. Seul les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus d’infection dans sa globalité et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. Nous utilisons en parallèle des approches in vitro ou ex vivo (organoïdes) pour répondre à des questions plus spécifiques.

Réduction

Les moyennes de CFU entre les groupes seront comparées à l'aide de tests de comparaison de moyenne (ANOVA ou test non paramétrique). Les effectifs par groupe (n=5) sont associés à des tailles d'effet de 2, pour un test de comparaison de 2 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Lorsque cela est possible, les animaux sont infectés avec un mélange de souches (index de compétition), afin de comparer leur virulence au sein du même animal, ce qui permet de diminuer le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Des points limites incluant la prostration/faciès de souffrance ou Body score 1, la perte de poids>20% du poids initial, ainsi que les signes d'infection du système nerveux central (paralysie partielle) sont appliqués pour ce projet. Les animaux seront mis à mort dès qu'un de ces points limites est atteint. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).

Choix des espèces

La souris n’est pas permissive à une infection orale par Lm du fait d’une spécificité d’espèce de l’interaction entre InlA et la E-cadhérine. La lignée murine permissive à Lm, qui exprime une E-cadhérine reconnue par InlA, sera dont principalement utilisée. L’interaction InlA-E-cadhérine n’étant pas impliquée après le passage de la barrière intestinale, des souris non permissives pour cette interaction, dont des C57BL/6J, pourront être également utilisées pour des infections intraveineuses afin de tester le rôle de facteurs bactériens ou de l’hôte indépendamment de la traversée de la barrière intestinale. Différentes lignées mutantes pourront ainsi être utilisées. Le recours à ces lignées permettra d’identifier et de caractériser les processus d’interactions hôtes / bactéries de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. Selon les procédures, les animaux suivants seront utilisés : Souris adultes (âge > 7 semaines), pour lesquelles le système immunitaire est mis en place. Souris gestantes pour étudier la listériose materno-fœtale et l’infection des fœtus. Souris âgées (plus de 18 mois) pour caractériser l’augmentation de la susceptibilité à la neuro-listériose liée à l’âge et au changement de microbiote.

1 750 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre injections de candidats vaccins contre l'allergie et trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire, une ponction derrière l'oeil que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des douleurs oculaires, un blépharospasme et des écoulements. Il indique que les souris gardent une mémoire immunitaire des vaccinations et ne peuvent donc être réutilisées, d'où leur mise à mort. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" pour remplacer ce type d'évaluation immunitaire.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines (comme l’IL4 et l’IL13) et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s) après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde™’. Ce dernier peut se présenter soit sous forme de proteine mélangé à un adjuvant, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm) encapsulé dans des particules lipidiques. Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin Kinoïde™ est évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de neutraliser l’activité biologique de la cytokine. Dans nos précédentes études, nous avons démontré que le vaccin kinoide (protéique ou ARN) murin induit une réponse immunitaire neutralisante contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s). Nous avons également démontré que le vaccin kinoide protéique humain induit une réponse immunitaire dans une lignée murine humanisée. Dans cette nouvelle étude, nous avons 2 objectifs : -Optimiser la réponse immunitaire induite par le vaccin kinoide protéique humain en testant différentes doses de vaccins -Tester 27 candidats vaccins kinoides ARN humains Pour cela, nous utiliserons la lignée murine humanisée hIL-4/hIL-13KI ; hIL-4RαKI.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d’immunisation du vaccin kinoide protéique, à savoir, la dose de vaccin à injecter. Il permettra également de sélectionner les meilleurs candidats vaccins kinoides ARN ainsi que la meilleure formulation de particules lipidiques. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -900 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (50 à 100 μl). Parmis ces animaux, un groupe de 810 souris recevra 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28 et un groupe de 90 souris recevront 4 injections de vaccin aux jours 0, 7, 28 et 48. -810 animaux seront injectés par voie sous-cutanée avec du vaccin (50 à 100 μl). Ces 810 souris recevront 3 injections aux jours 0, 7 et 28. Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins ARN étaient nécessaires. De plus, des études préliminaires ont montré que chez les souris humanisées triple KI 3 à 4 injections étaient nécessaires pour obtenir une réponse immunitaire efficace. 2)Prèlévement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. L’ensemble des 1710 souris subira 3 prélèvements sanguins aux jours -7, 38 et 58.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. L'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

10 chiennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées dans d'autres projets avant d'être proposées à l'adoption. Elles subissent deux anesthésies générales pour des endoscopies des voies urinaires, des prélèvements de sang et d'urine répétés et l'instillation d'une suspension bactérienne dans la vessie. Le porteur décrit un inconfort léger et n'attend aucune séquelle, l'objectif étant de vérifier l'innocuité d'un probiotique avant un usage clinique. Il justifie le choix de la chienne par la ressemblance de ses infections urinaires avec celles de la femme.

Objectifs

L’infection bactérienne du tractus urinaire est l’une des maladies infectieuses les plus fréquentes aussi bien chez l’Homme que chez le chien et l’une des principales causes de prescription d’antibiotiques. Ces traitements peuvent favoriser la sélection de souches résistantes. Face à l’augmentation croissante de germes résistants, il est nécessaire d’envisager des méthodes alternatives aux antibiotiques. L’utilisation in situ de souches bactériennes (Escherichia coli ) a été décrite et utilisée avec succès pour traiter des infections urinaires récidivantes spontanées. Notre objectif est de démontrer l'innocuité d'une instillation vésicale d'une suspension bactérienne contenant Escherichia coli chez la chienne avant une utilisation en contexte clinique. Notre hypothèse est que cela n'entraîne aucune répercussion sur l'état général et les voies urinaires de l'animal, comme suggéré par les données de la littérature et les études in vitro et qu'elle devrait en revanche présenter des propriétés antimicrobiennes contre plusieurs espèces d'entérobactéries.

Bénéfices attendus

Les souches probiotiques ont pour vocation d'être utilisées pour traiter des infections urinaires entraînant des manifestations cliniques, dues à des bactéries résistantes aux antibiotiques. Si l'expérimentation démontre l'innocuité, ces souches pourront faire l'objet d'essais cliniques chez l'animal de compagnie puis chez l'Homme dans des situations où l'administration d'antibiotiques est impossible ou néfaste pour l'animal ou la santé publique (émergence de résistances).

Procédures

Les chiennes vigiles seront soumises à des prélèvements sanguins (2 prélèvements de 8 mL à la jugulaire à 7 jours d'intervalle) et urinaires (5 prélèvements de 10 mL sur 1 semaine). Elles subiront par ailleurs 2 examens endoscopiques à 15 jours d'intervalle sous anesthésie générale (incluant de l'analgésie) pour une durée de 20-30 min chacune. Une instillation dans la vessie de la solution bactérienne sera également faite sous sédation.

Impact sur les animaux

Les chiennes subiront lors de la phase expérimentale 2 anesthésies générales à 15 jours d'intervalle pour la procédure endoscopique. L'endoscopie des voies urinaires n'est associé qu'à un inconfort léger qui sera traité par l'administration d'un analgésique adapté. La procédure dure environ 20 minutes. Chaque chienne bénéficiera de la pose d'une cathéter veineux périphérique dans la veine céphalique et d'une intubation trachéale pour sécuriser la procédure anesthésique. Les phases d'induction, de maintien et de réveil seront surveillées constamment par un vétérinaire jusqu'au réveil complet de l'animal. Aucune séquelle n'est attendue sur les chiennes. Chaque chienne subira un sondage urétral sous sédation. Le sondage urétral ne présente qu'un inconfort léger et ne dure que quelques minutes. Aucune séquelle n'est attendue. La suspension bactérienne placée dans la vessie n'est ni visqueuse, ni irritante. Durant la phase expérimentale, les chiennes subiront au total 2 prélèvements sanguins veineux de 8 mL à chaque fois (ponction jugulaire), à 1 semaine d'intervalle. La ponction veineuse n'est associée qu'à un inconfort léger. Les chiennes subiront enfin 5 prélèvements urinaires de 10 mL sur une semaine. Ce geste sera pratiqué sous contrôle échographique pour assurer sa réussite et sa rapidité. Aucune séquelle n'est attendue suite à ces prélèvements.

Devenir

Les chiennes utilisées pourront participer à d'autres projets conduits par l'unité de recherche avant d'être proposées à l'adoption.

Remplacement

Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet dont le but est d'étudier l'innocuité chez l'animal de souches probiotiques non pathogènes d'E. coli dans les voies urinaires du chien. Par ailleurs, le choix de ce modèle est justifié par la volonté de se rapprocher d'une future utilisation dans un contexte clinique chez l'animal de compagnie, puis chez l'Homme, la chienne présentant des infections urinaires dont la physiopathologie et l'expression clinique sont similaires à ce qui est rencontrée en médecine humaine, particulièrement chez la femme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé en anticipant l'apparition d'effets indésirables chez moins de 10% des individus. Il n’existe que peu de données sur l’innocuité d’une telle procédure. La seule publication récente fait état de l’absence complète d’effets indésirables identifiables à partir de 6 chiennes. Cette étude a été réalisée dans des conditions très similaires : même race, même sexe, même âge. Avec ce résultat (seul disponible) il n’est pas possible d’utiliser un test statistique de calcul d’effectif. Dans l’optique d’une utilisation clinique future, pour augmenter la puissance statistique et améliorer la sensibilité, un effectif de 10 chiennes recevant la suspension bactérienne est considérée pertinente. Ce nombre s'avère être le minimum requis pour atteindre notre objectif de démontrer l'absence d'effet néfaste d'une instillation vésicale de notre solution bactérienne.

Raffinement

Les chiennes seront hébergées dans des conditions compatibles avec leurs besoins (logement en binôme dans des chenils suffisamment grands sur litière adaptée). Elles auront accès à l'extérieur au moins une fois par jour et auront constamment accès à l'eau. A l'exception des journées où les chiennes seront anesthésiées ou sédatées, elles seront nourries une fois par jour, le matin. Lors des anesthésies/sédations, elles ne seront nourries qu'après réveil complet. A l'occasion des endoscopies, un protocole d'analgésie adapté est mis en place pendant et dans les heures qui suivent afin de garantir l'absence de douleur. Les prélèvements sanguins et urinaires seront réalisés par du personnel formé à ces actes, après un entraînement préalables des animaux à la contention pour minimiser le stress lors de la procédure expérimentale. Les chiennes sont a minima visitées deux fois par jour. Après chaque procédure sous anesthésie, elles font l’objet d’une surveillance accrue (toutes les heures) dans les 4h post-examen puis 2 fois par jour pendant la semaine qui suit. Sont alors notés : le comportement général, la prise alimentaire, les signes d’atteinte du bas appareil urinaire (douleur à la miction, sang dans les urines, difficulté à uriner, mictions répétées, léchage génital excessif), signes de douleur abdominale. Quotidiennement, un examen clinique est réalisé incluant notamment la prise des constantes vitales. Ces informations sont consignées dans un tableau de scoring et gradé de 0 (absent/normal) à 4 (très marqué/modifié). Toute modification pouvant trahir la présence de douleur (score ≥1) sera utilisée comme point limite. L'animal concerné sera examiné immédiatement par l'un des vétérinaires impliqués dans l'étude et, selon le contexte, des examens complémentaires pourront être réalisés pour déterminer l'origine de ces signes (bilan sanguin/urinaire, imagerie). Autant que de besoin, un traitement analgésique sera mis en place immédiatement (méloxicam 0,1 mg/kg). La réponse inadéquate à l’ administration du traitement analgésique et/ou la mise en évidence d’une complication inattendue constitueront un critère d’arrêt. La chienne atteinte ne suivra pas la fin de la procédure expérimentale. Un traitement antibiotique visant la bactérie utilisée (amoxicilline 10 mg/kg matin et soir) sera utilisée en première intention, une culture urinaire avec antibiogramme sera réalisée pour ajuster éventuellement le traitement.

Choix des espèces

La chienne est une espèce particulièrement concernée par les infections urinaires, il s'agit de l'une des maladies infectieuses les plus fréquentes dans cette espèce. L'expérimentation doit se placer le plus proche possible du contexte clinique de l'utilisation de EcN2.0. Cliniquement, l'infection urinaire de la chienne est proche de celle de la femme. Ainsi nos résultats pourront être en partie extrapolés dans l'optique d'une utilisation en médecine humaine. Les chiennes seront âgées de 1.5 an, les infections urinaires étant davantage fréquentes chez les adultes.

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, puis des injections répétées d'un candidat médicament sous contention, avant d'être tuées par rupture des vertèbres cervicales. Le porteur signale une possible cachexie et une gêne à la marche liée au volume de la tumeur. Il affirme n'avoir "pas d'autre choix" que la souris pour reproduire un "organisme entier", l'étude constituant une étape vers un dossier réglementaire commercial.

Objectifs

Depuis plus de 10 ans, le cancer est la première cause de mortalité en France. Or il a été démontré qu'une molécule est exprimée, voire fortement surexprimée, au sein du microenvironnement tumoral (humain et murin). Ainsi, cette protéine est considérée comme un marqueur de mauvais pronostic et de récurrence dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, principal cancer retrouvé chez les femmes en France. Il y a donc une nécessité de développer de nouveaux traitements à l’heure actuelle afin d’améliorer la survie des patientes. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel anti-tumoral d’un candidat médicament qui en plus d’inhiber la vascularisation tumorale, a d’ores et déjà démontré des effets anti-tumoraux dans différents modèles murins de cancer tels que le cancer de la peau, cancer cérébral et le cancer ovarien. Il a également été montré dans ce dernier modèle la capacité du candidat médicament à activer l’immunité anti-tumorale. L’objectif de notre projet sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique et la pharmacologie du candidat médicament. Pour cela, un effet dose sera évalué en analysant la croissance tumorale au sein d'un modèle de cancer mammaire ainsi que la vascularisation grâce à la technique dite de "matrigel plug". Ces deux premières procédures permettront la détermination des paramètres pharmacologiques et pharmacocinétiques. Une fois la dose efficace déterminée à l'aide de ces deux premières études, nous analyserons l’effet de la dose efficace sur la réponse immunitaire dans les tumeurs. Pour cela, le modèle de tumeur mammaire est un modèle intéressant pour étudier les relations entre la tumeur et le système immunitaire en respectant la physiologie de développement tumoral. Enfin, le 3e volet de l’étude consistera à comparer quatre formulations du candidat médicament afin de déterminer celle qui pourrait améliorer l'efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus par le candidat médicament sont une diminution de la croissance tumorale liée à une augmentation de la réponse immunitaire ainsi qu’une diminution de la vascularisation tumorale selon un effet dose. La réalisation de ce projet d’expérimentation animale permettrait de valider les résultats obtenus in vitro et ex vivo et confirmerait la pertinence de la stratégie thérapeutique associée au candidat médicament dans un modèle complexe de progression tumorale in vivo (tumeurs vascularisées et système immuno-compétent). Cette étape, associée à la détermination d’une dose efficace de traitement et d’une formulation adaptée, constitue un prérequis à la constitution de dossier réglementaire lors du developpement pharmaceutique.

Procédures

Pour toutes les procédures (toutes les souris) : identification des souris par tatoo au niveau des oreilles (durée: moins d'1min) sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois). Procédures 1, 3 et 4 (pour toutes les souris) : - Injection de cellules tumorales au niveau de la glande mammaire sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min) 3 fois par semaine pendant 3 semaines Procédure 2 (pour toutes les souris) : - Injection d’une solution de protéines matricielles, contenant un facteur favorisant la vascularisation, dans le flanc des animaux, sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (1 fois, durée: moins de 5min) - Injection de traitement par voie intraveineuse, dans la veine de la queue, sur animaux vigiles placés dans un tube de contention (durée: 5min), 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Procédure 1 (souris du groupe satellite) : - Prélèvements sanguins sous anesthésie générale par inhalation de gaz anesthésique (5 fois : submandibulaire gauche, submandibulaire droite (durée: 1min), rétoorbital gauche, rétroorbital droit (durée: moins d'1min), ponction intracardiaque après euthanasie) répartis au cours du temps jusqu'au sacrifice des animaux.

Impact sur les animaux

Une cachexie : d'après la bibliographie, la cachexie apparaît principalement au stade métastatique du développement tumoral environ 5 à 6 semaines suivant l’inoculation des cellules tumorales. Il est donc peu probable que la cachexie apparaisse après les 3 semaines de traitements néanmoins le risque que quelques animaux en présente n’est pas totalement exclu. Une gêne à la locomotion due au volume tumoral en raison de la localisation de la tumeur. Un stress des animaux lors des injections sur animaux vigiles ainsi que préalablement à l'imagerie. Une douleur transitoire lors de l'injection intraveineuse. Une inflammation et/ou une dépilation dans de rare cas à l'emplacement de la tumeur croissante ou de la solution matricielle.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés par rupture des vertèbres cervicales sous anesthésie générale (isoflurane 4%).

Remplacement

Une étude in vitro seule ne peut suffire pour représenter les mécanismes physiologiques d’un organisme entier et les approches informatiques ne permettent pas à ce jour de mimer la fonction d’un organisme et sa réaction face aux traitements. En effet, il est notamment très difficile de recréer exactement, in vitro, l’environnement tumoral. Ainsi, nous n’avons pas d’autres choix que d’utiliser le modèle animal pour apporter la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du candidat médicament et de définir sa dose efficace et la formulation adaptée avant l’éventuelle réalisation d’essais cliniques.

Réduction

Afin d’être adapté au modèle de cancer mammaire, uniquement des souris femelles seront considérées dans les procédures comportant ce modèle. Pour le modèle in vivo de vascularisation, il s’agira de souris mâles et femelles afin de pouvoir identifier, si nécessaire, une réponse différentielle liée à la synthèse hormonale. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé de manière à réduire au maximum la quantité d’animaux tout en permettant une interprétation fiable des résultats basée sur des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Une observation quotidienne des souris sera réalisée afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et d’antalgiques permettra de prévenir et/ou traiter toute douleur éventuelle. Une attention particulière sera portée à l’observation des points limites fixés tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance non soulagée par les soins apportés, auquel cas l’animal sera mis à mort. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne) Des outils d’imagerie non invasifs seront utilisés.

Choix des espèces

Souris Balb/c, syngéniques de la lignée de carcinome mammaire 4T1 Travaux antérieurs justifiant de la pertinence de ce modèle murin dans le cadre de l’évaluation de nouveaux agents thérapeutiques dans le traitement de différents cancers. Homologie de la protéine cible Animalerie agréée pour l’espèce souris Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique, les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à un stade adulte (jusque environ 1 an chez la souris).