Recherche appliquée

360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une injection de vecteur viral et, chaque semaine, une injection sous la peau d'une substance luminescente pour suivre le virus par imagerie. La moitié est injectée dans l'abdomen dès le premier jour de vie, l'autre moitié dans la veine de la queue à six semaines, éveillée. L'équipe compare plusieurs dérivés du virus AAV9 pour retenir celui qui cible le mieux le muscle, une étape en amont de futures thérapies géniques des maladies musculaires. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes, et le porteur ne dit pas combien de semaines dure le suivi, donc combien d'injections chaque souris subit.

Objectifs

Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.

Bénéfices attendus

L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.

Procédures

Les 180 souris de la cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. Les 180 souris de la cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence

Impact sur les animaux

L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.

Devenir

Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.

Raffinement

Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative.

7500 rongeurs, 3750 souris et 3750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une mise à jeun de quatorze heures sur grille, ils reçoivent par gavage ou injection les composés testés ou des agents ulcérogènes comme l'éthanol ou des anti-inflammatoires, avant le prélèvement de l'estomac après la mise à mort. Ces études réglementaires évaluent le potentiel de nouvelles molécules à provoquer ou atténuer des ulcères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative validée n'existe pour étudier un système digestif "intègre".

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer : - les effets potentiels ulcérogènes gastriques de nouveaux composés, - la capacité de modulation par de nouveaux composés des effets ulcérogènes gastriques de composés comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine), les acides (HCl). Les modèles expérimentaux développés chez le rongeur (principalement chez le rat) sont très largement décrits.

Bénéfices attendus

Dans le cadre d'étude de type pharmacologie de sécurité, ces études vont permettre de déterminer d'éventuels effets délétères sur la muqueuse gastrique de candidats médicament et fournir ainsi des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament. Dans le cadre d'étude d'efficacité/pharmacologie de sécurité de candidat médicament, ces études vont permettre de déterminer le potentiel de modulations par le candidat médicament des ulcères gastriques induits par des agents comme l’éthanol, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (acide acétylsalicylique, indométacine). Cela apportera des indications réglementaires dans le champ de la pharmacologie de sécurité de nouveau candidat médicament ou en terme d'efficacité thérapeutique.

Procédures

Mise à jeun avec hébergement sur grille de 14h pour éviter les phénomènes de coprophagie (1 fois) avant traitements par gavage ou administration intra péritonéale (maximum deux traitements à 1h d'intervalle, durée d'un gavage ou d'une injection intrapéritonale de 15 secondes environ) suivi 6 heures au plus tard après le premier traitement d'une anesthésie pour prélèvement sanguin et prélèvement de l'estomac (et éventuellement d'autres tissus) après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à l'administration du produit à tester et à son éventuelle toxicité. Les nouvelles molécules ont déjà passé une batterie de tests in vitro qui permet de déterminer les molécules les plus sélectives et sans effet sur certaines cibles pouvant être à l'origine d'effet non désiré. Des nuisances peuvent être liées aux administrations (infection au site d’injection, lésion œsophagienne liée au gavage ou erreur de gavage). Les effets indésirables liés aux produits testés pourront être des troubles du comportement ou les nuisances consécutives de l'ulcération qui peuvent in vivo être objectivées par la présence de traces de sang dans la région périanale. Enfin, la mise à jeun sur grille est également source de nuisance pour les animaux, mais est requise pour éviter les phénomènes de coprophagie.

Devenir

Mise à mort selon les procédures réglementaires pour prélèvements terminaux post mortem requis

Remplacement

L’utilisation de souris ou de rats pour l'évaluation d'effet sur la muqueuse gastrique est justifiée par la nécessité de pouvoir déterminer les effets de nouvelles molécules sur un système gastrointestinal intègre, y compris dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative connue et validée à ce jour.

Réduction

Les tests de plusieurs molécules pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un groupe testant les effets de molécule(s) de référence. Une prise en compte des données de pharmacocinétique et de pharmacodynamie dans le choix de doses sera effectuée. L'analyse statistique évaluera les scores d'ulcérations comparant les effets des traitements.

Raffinement

La mise à mort des animaux est réalisée dans une pièce séparée de la pièce de traitement afin de minimiser le stress pour les animaux en attente. Lors du change des animaux (une fois par semaine) une feuille de Suivi Bien Être Animal est remplie en fonction d’une grille de 30 critères. Si nous constatons une déviation concernant au moins 3 critères sans qu’une action puisse corriger ces déviations, alors la mise à mort de l’animal est envisagée. Ces grilles de critères bien-être animal sont archivées. Les animaux resteront hébergés en groupe et des tunnels seront utilisés comme enrichissement.

Choix des espèces

L’évaluation de l’efficacité thérapeutique et de la sécurité pharmacologique des molécules destinées à devenir des médicaments est requise par les autorités. La 1ère évaluation préclinique des effets sur la sphère gastrique est généralement conduite chez les rongeurs (rats, souris). Le stade adulte sera généralement utilisé pour tester l’efficacité de nouvelles entités pharmacologiques, les applications thérapeutiques visant la population adulte. Néanmoins, des investigations pourront être réalisées sur des animaux après sevrage pour répondre à des besoins relatifs au plan d’investigation pédiatrique le cas échéant.

6500 rongeurs, 6200 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une induction tumorale, parfois une irradiation et un implant, puis des traitements répétés et des prélèvements de sang et de moelle osseuse, pour évaluer des composés contre des leucémies et des métastases. Le développement tumoral provoque une perte de poids et des difficultés à se déplacer. Le porteur reprend mot pour mot son argumentaire de remplacement pour justifier le nombre d'animaux, et affirme qu'aucune méthode alternative ne prédit l'efficacité in vivo.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : -Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

80 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la grippe par voie nasale, puis subissent des lavages nasaux jusqu'à trois fois par semaine et des prélèvements sanguins sous anesthésie, pour tester des produits antiviraux. L'infection provoque fièvre, écoulement nasal et apathie, et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur annonce comme bénéfice la "mise sur le marché de nouveaux produits antiviraux" et affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'efficacité dans un "organisme entier".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de développer et caractériser des modèles d’infection par le virus de la grippe (virus Influenza) et d’évaluer l’efficacité de différents produits antiviraux. Plusieurs études pourront être réalisées pour répondre à ces objectifs. Lors de celles-ci, des furets (mustela putorius furo) seront infectés avec une suspension virale du virus de la grippe et traités avec les produits à tester.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits antiviraux.

Procédures

Les animaux seront infectés par une dose unique de virus et recevront une ou plusieurs fois l'administration des produits antiviraux. Des lavages nasaux seront réalisés (jusqu’à 3 fois par semaine à 2 jours d’intervalle) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 2 fois en 1 semaine + avant euthanasie) sur animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés avec le virus de la Grippe, à une dose d’environ 10^5 PFU/mL, entrainant l’apparition de signes cliniques des animaux reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, éternuement, écoulement nasal et apathie). Les animaux seront également manipulés régulièrement pour différents actes (administration des vaccins, pesées, scoring clinique, prélèvements, etc.). Ces actes peuvent stresser les animaux, aussi, pour palier à cela, des mesures de raffinement ont été prévues notamment des anesthésies systmétique pour tous actes nécessitant une contention importante des animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les organes pertinents à la mesure d’efficacité des produits antiviraux en vues d’analyses des charges virales.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable l’efficacité de produits antiviraux dans un organisme entier vivant. Le furet a été choisi car il s’agit d’un modèle classiquement utilisé dans les études sur la grippe.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion afin que les effectifs de chaque groupe soient déterminés de façon à pouvoir analyser les résultats avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée. Les animaux seront hébergés en groupe tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leur besoin (balles et autres jouets avec une alternance des jouets tous les 15 jours, paniers de repos…). L’infection des animaux par administration intranasale sera réalisée sous anesthésie, ainsi que tous les actes techniques nécessitant une contention importante afin d’éviter tout stress aux animaux. Tout au long de l’étude, un suivi clinique quotidien sera réalisé. Le poids des animaux et la température seront mesurés régulièrement et un suivi clinique avec grille de scoring sera réalisé (a minima quotidiennement après l’infection). Tout score total supérieur ou égal à 12, témoignant d’un état de santé considérablement dégradé de l’animal et sans possible rétablissement conduira à une euthanasie étique des animaux concernés. De façon similaire, toute perte de poids supérieure ou égale à 10% du poids initial de l’animal au cours de l’étude ou durant les 15 derniers jours conduira à une euthanasie éthique.

Choix des espèces

Le furet est un modèle animal dont l’infection grippale mime le mieux la physio-pathogénie humaine (signes cliniques et transmission entre animaux) permettant de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés de 3 à 4 mois (stade de jeune adulte) au moment de l’infection. Ce stage de développement est celui habituellement utilisé pour ce type d’étude (pas de contrainte spécifique lié à l’age).

785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de cellules de glioblastome issues de patients, puis jusqu'à cinq types d'interventions, imagerie de fluorescence, injections répétées sur cinq semaines, gavages sur cinq cycles et perfusion cardiaque. Le sang et les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme que le passage par un modèle animal est "indispensable" avant de tester ces molécules sur des patients.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde. Le traitement standard actuel (extraction chirurgicale, radiothérapie et chimiothérapie) n’est malheureusement pas curatif et la survie médiane des patients est de 14 mois. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies contre ce cancer. Le projet compte évaluer des molécules capables de cibler et d’éliminer les cellules de GBM, seules ou en combinaison avec des nanotechnologies. Le développement pharmaceutique de ces formulations a permis de formuler ces médicaments pour une utilisation clinique (formulations validées sur des lignées cellulaires de GBM humain). Il est maintenant important d’évaluer l’intérêt thérapeutique de ces nouvelles molécules sur différents modèles animaux, avant d’envisager un essai clinique chez l’Homme. Le projet consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients, dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats médicaments après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées).

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux consiste à développer des modèles murins de GBM sous-cutanés à partir de cellules dérivées de patients (PDX), dans le but d’évaluer l’intérêt thérapeutique de plusieurs candidats-médicament après administrations répétées (intraveineuses ou sous-cutanées). Si l’intérêt thérapeutique est attesté et les doses maximales tolérées et efficaces déterminées, ces travaux pourront servir pour réduire le nombre de souris utilisées lors d’une future étude sur des modèles PDX où les cellules tumorales seront injectées au niveau du cerveau (= modèle orthotopique), modèle plus proche de l’Homme. La combinaison des résultats sur ces modèles sous-cutanés et orthotopiques de PDX serviront de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 2 types d'intervention : l’implantation tumorale sous-cutanée et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, un suivi de la biodistribution des molécules par imagerie de fluorescence (3 sessions au maximum sur une semaine qui durent plusieurs dizaines de minutes chacune), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) et une perfusion cardiaque. Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront jusqu’à 4 types d’intervention : l’implantation sous-cutanée tumorale et le suivi de la croissante tumorale qui durent quelques minutes, des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Certains candidats médicaments pouvant être composés d’un anticancéreux, des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études de biodistribution et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur intérêt thérapeutique avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur efficacité chez les deux sexes. Des travaux in vitro sur cultures cellulaires vont être menés sur les cellules tumorales utilisées dans ce projet préalablement à son démarrage pour valider les formulations testées. Il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ces types de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacés par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du GBM, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité que nous allons effectuer dans un autre projet (n° APAFIS 38113) va nous permettre de raffiner la dose administrée. Le nombre d’animaux d'un sexe sera également réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez l'autre sexe. Un seul modèle tumoral sera testé chez le deuxième sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il est préférable de ne pas utiliser moins d’animaux, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffinée la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administré jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisées ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle sous-cutané de GBM chez la souris.

6300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et l'administration de composés une à deux fois par jour pendant jusqu'à 42 jours, pour tester des traitements anticancéreux. Les organes sont prélevés après la mise à mort pour mesurer l'efficacité des molécules. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité d'une tumeur et conclut à la nécessité du recours à la souris.

Objectifs

Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutique mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de traiter 100% des patients atteint d’un cancer et l’on observe de plus en plus d’échappement aux thérapies déjà existantes. Ces études permettront à la fois d’expliquer le mécanisme d’échappement à ces traitements mais aussi d’expliquer le mécanisme d’action de certains traitements. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus in vitro au préalable mais également avec ce que l’on attend des différents traitements observés lors des phases clinique chez l’homme. De plus, ces études permettront de tester de nouvelles thérapies plus innovantes et donc de proposer de nouveaux traitements plus efficaces aux patients atteint de cancer.

Procédures

1) Injection de cellules tumorales en moins de 3 minutes sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) l'imagerie de la tumeur une fois par semaine pendant 6 semaines se fera sous anesthésie pendant 5 min apres une injection de sonde bioluminscente, 3) Prélèvements sanguins une fois par semaine pendant 6 semaines: prelevement en moins d'une minute avec anesthésie pas plus de 2 fois dans l'etudes ou intraveineux sans anesthesie ou en moins d'une minute, 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant un maximum de 42 jours

Impact sur les animaux

L’injection en sous cutané de cellules tumorales chez la souris va induire le développement d’une tumeur qui va grossir au fur et à mesure. Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, une diminution de l’activité. Les animaux seront également manipulés délicatement mais rapidement afin d'eviter au maximum le stress de la manipulation, des administrations et du gavage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur où son échappement à une thérapie. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro. Et ne seront testés les traitements, les molécules ou anticorps, ayant montré le plus d’efficacité dans ces modèles.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne seront testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisé dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d'analgésie ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionel et de critére d'arret de souffrance sont mis en place.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.