Recherche appliquée
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Evaluation d’une activité analgésique dans le test au formol chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de formol sous la peau de la patte, qui provoque une douleur classée sévère, pour tester des molécules candidates contre la douleur. Le porteur décrit ce test comme un outil de screening intégré à l'offre de service commerciale du laboratoire, vendue à ses clients. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la seule option, les modèles in vitro ne mesurant selon lui que la nociception.
Objectifs
L’objectif de ce projet s’inscrit dans une activité de screening de molécules. Le laboratoire réalise de la prestation de service pour le développement de candidats médicaments. Le domaine d’application est la douleur. La littérature a documenté depuis des années un test de douleur en deux phases permettant le screening de molécule : le test au formol. L’injection sous cutanée d’une solution aqueuse de formaldéhyde (formol) induit chez l’animal une douleur modérée, diffuse et prolongée selon un schéma bi-phasique. Une phase précoce ou aiguë (0 à 10 minutes) correspondant à l’activation directe des fibres nociceptives par le formol est d’abord observée, suivie après une phase de quiescence (5 min), d’une phase tardive (15 à 35 minutes) résultant du développement de l’inflammation. L'évaluation de la douleur s'effectue par l'observation du comportement spontané (léchage de la patte injectée) de la souris isolée dans un box. L’avantage principal de ce test est qu’il permet d’analyser l’action de différents composés sur la douleur aiguë et persistante au sein d’un seul et même test.
Bénéfices attendus
Ce modèle sera intégré à l’offre de service de l’entreprise. L’entreprise peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés qui permet de proposer de tester ces candidats médicaments chez la souris. De plus, ce modèle étant rapide et simple à mettre en place, il s’inscrit dans l’outil de screening.
Procédures
Les souris reçoivent une injection sous-cutanée plantaire de formol pour l’induction du modèle (environ 30secondes). Ils sont soumis à une seule administration de composés (candidats médicaments à potentiel anti-douleur, véhicule ou référence) par voie p.o., ip., sc., i.v. ou i.m (environ 30secondes). Les souris peuvent aussi être soumises à un prélèvement de sang afin de surveiller la pharmacocinétique d’un composé. (environ 1minute)
Impact sur les animaux
L’animal reçoit une injection en sous-cutanée plantaire au niveau de la patte arrière. L’aiguille est introduite au niveau du talon. Le formol injecté va induire une douleur locale. La patte va présenter un gonflement plus ou moins important en fonction de la réponse inflammatoire de l’animal. Les animaux vont recevoir un traitement par voie p.o., i.p., s.c, i.v., Intrarectale. Des points limites/nuisances associés à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, sédation …). Dans le cadre de certaines études, un prélèvement de sang peut être réalisé sous anesthésie (Intracardiaque, caudale, jugulaire, retro-orbital). En prélèvement unique, 1.2ml de sang peuvent être prélever sans réveil de l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. Le but de ce projet est de réaliser des études de screening dans un modèle de douleur lié à l’injection de formol dans la patte. Cette injection reste douloureuse et implique la mobilisation de différentes voies de signalisation de la douleur. On ne peut donc pas être sûr de retrouver un animal sain plusieurs jours après. De plus, cette procédure est classée en sévère car la douleur est importante. Ce projet a pour but de tester des molécules en cours de développement. Leur potentielle toxicité à long terme n’est pas toujours connue à ce stade du développement. De plus, des interactions avec ces composés pourraient être possibles, si les animaux étaient gardés pour d’autres études. Garder les animaux ne nous permet pas non plus de rester dans des conditions standard or le stade de développement des animaux est important dans l’installation des pathologies sur lesquels le laboratoire travaille.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par la société. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. Ce test permet également de mesurer deux types de douleur. La première phase d’observation suite à l’injection de formol va engendrer une douleur aigue sensible aux anti-inflammatoires. Puis 17-27min après l’injection, une douleur de type neuropathique est testée (pas excès de nociception). Ceci permet donc de limiter le nombre de modèle à tester en screening.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation aux compartiments de tests). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de la société. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade nous permet d’avoir une maturation de l’ensemble des systèmes/ réseaux de douleur (nerveux, immunitaire…). Ceci semble être la meilleure solution pour des études de screening de molécules.
STEROHD Effets protecteurs de CYP46A1 et implication des astrocytes dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie de Huntington, elles subissent des injections intracérébrales sous anesthésie, des gavages répétés sur quatre mois, de l'imagerie cérébrale et une batterie de tests comportementaux évaluant motricité, sociabilité, vocalisation, anxiété et anhédonie, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur n'attend que peu d'effets indésirables hormis la douleur des chirurgies et le stress de la contention. Il affirme que les interactions entre neurones et astrocytes ne sont pas reproduites in vitro ou in silico et qu'un modèle murin est nécessaire pour tester cette thérapie génique.
Objectifs
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative d’origine génétique sans traitement curatif. Elle se caractérise par la mort de neurones du système nerveux central, ce qui provoque d’importants troubles moteurs, cognitifs et comportementaux chez les patients. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la maladie de Huntington. La production et l’élimination du cholestérol, qui est essentiel pour le cerveau, est altéré dans la maladie de Huntington. Le métabolisme du cholestérol implique un dialogue finement régulé encore mal compris entre les neurones mais aussi leurs partenaires, les astrocytes. Les études pilotes montrent que la thérapie génique avec CYP46A1, qui vise à rétablir le métabolisme du cholestérol, impacte aussi les astrocytes et les rend réactifs. Nous faisons l’hypothèse que les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets bénéfiques de cette stratégie thérapeutique. L’objectif de ce projet est de mieux définir le potentiel thérapeutique de CYP46A1 dans un modèle murin pertinent de la maladie de Huntington et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. D’une part, il s’agit d’établir si les astrocytes réactifs sont impliqués dans les effets thérapeutiques de la CYP46A1 : une approche préclinique complète évaluera les effets thérapeutiques au niveau moléculaire, histologique, biochimique, métabolique, comportemental et de la connectivité cérébrale. Il s’agit également de comprendre quels sont les effets de CYP46A1 sur la morphologie des astrocytes du striatum et leur transcriptome (ensemble des gènes exprimés par une cellule). Pour cela, les souris anesthésiées recevront des injections intracérébrales de vecteurs viraux dans le striatum ou un traitement pharmacologique oral qui mime les effets d’une surexpression de CYP46A1. Ces souris seront analysées par un panel d’approches précliniques (analyse des performances motrices et des altérations comportementales par des tests du comportement, de l’imagerie cérébrale non invasive sur souris anesthésiée, par résonance magnétique nucléaire pour identifier des altérations morphologiques et du métabolisme cérébral et enfin par des techniques d’analyses post-mortem variées).
Bénéfices attendus
Cette analyse préclinique va permettre de confirmer les effets bénéfiques d’une thérapie génique et pharmacologique sur les altérations comportementales typiques de la maladie de Huntington mais rarement étudiées dans les protocoles précliniques. De plus, l’analyse par une méthode non-invasive par imagerie cérébrale va permettre d’évaluer l’effet de ces approches thérapeutiques sur un ensemble de paramètres fonctionnels pertinents pour une future étude clinique. Enfin une meilleure compréhension du rôle des astrocytes, des partenaires essentiels aux neurones, permettra de mieux comprendre les effets intracérébraux de ces thérapies et d’affiner leur utilisation clinique.
Procédures
Certaines souris seront soumises à une injection unique intracérébrales sous anesthésie et analgésie pendant environ 30 min, puis à des tests comportementaux étalés sur plusieurs jours avec au moins 2 jours de repos entre chaque tests, qui visent à évaluer les capacités motrices, la sociabilité, la vocalisation, l’anxiété et l’anhédonie des souris. Chacun de ces tests durent moins de 30 min par souris, sauf la cage d’activité qui permet de suivre le comportement spontané de la souris dans une cage dédiée pendant 24h. Certaines souris auront aussi deux sessions d’imagerie cérébrale sous anesthésie (moins de 2h30/souris). Certaines souris recevront à des injections intracérébrales sous anesthésie et analgésie de 30 min, puis une injection retro-orbitaire 6 mois plus tard, sous anesthésie gazeuse, pendant 5 min. D’autres souris recevront des gavages en contention pendant 1 min, 3 fois par semaine pendant 4 mois. souris seront habituées à l’expérimentateur et à la contention avant de démarrer les gavages.
Impact sur les animaux
Très peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux utilisés dans ce protocole à part la douleur lors des chirurgies intracérébrales, le stress lié à la contention lors du gavage et à la manipulation lors des tests comportementaux.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.
Remplacement
Ce projet est basé sur des résultats obtenus in vitro qui ont mis en évidence les effets bénéfiques de la modulation du métabolisme du cholestérol dans le contexte de la maladie de Huntington. Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules, dont les astrocytes. Ces interactions qui sont très probablement à la base des effets thérapeutiques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. En particulier, il existe des souris transgéniques modèles de la maladie de Huntington qui ont la mutation génétique responsable de cette maladie et permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques très importants de la maladie de Huntington : les altérations comportementales (ex. atteintes motrices, anxiété), les déficits métaboliques et les altérations des connections cérébrales, ainsi que leur potentielle restauration par nos stratégies thérapeutiques.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 370 souris. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux sera réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple, les mêmes souris auront une évaluation extensive de leur comportement ainsi qu’une analyse de plusieurs paramètres par imagerie et pour finir une analyse histologique complète du cerveau avec quantification d’une dizaine de paramètres/souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant les sessions de tests comportementaux et l’habituation à la contention permet de réduire le stress des souris. Un soutien thermique sera mis en place lors des chirurgies et sessions d’imagerie.
Choix des espèces
Les souris modèles de la maladie de Huntington permettent d’étudier les cellules cérébrales (neurones, astrocytes…) in situ, dans un contexte génétique permettant le développement de la maladie de Huntington. Ces souris présentent des altérations moléculaires, cellulaires et comportementales caractéristiques de la maladie de Huntington. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés. La MH est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les souris seront injectées à l’âge de 4 mois et seront analysées entre 7 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.
Modification spécifique du microbiote intestinal pour lutter contre l’inflammation du myocarde
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
4 307 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent par gavage des bactéries intestinales et des injections de cellules immunitaires, avec des prélèvements répétés de sang et de fèces, pour tester une technique visant à bloquer un mimétisme moléculaire lié à une myocardite. Le porteur indique que le modèle de myocardite devient progressivement mortel et que, sur vingt semaines, jusqu'à la moitié des souris succomberaient ou seraient mises à mort, période qu'il prévoit de ramener à douze semaines. Il affirme que la complexité du microbiote et du système immunitaire ne peut être reproduite in vitro et qu'un modèle murin est "nécessaire".
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont des maladies chroniques déclenchées par la perte de tolérance immunologique de l’organisme face à ses propres constituants. Dans leur grande majorité, ces dysfonctionnements du système immunitaire sont multifactoriels, compliquant de fait la détermination de l’origine exacte. Différents facteurs, tels que les facteurs génétiques, endogènes, exogènes et/ou environnementaux peuvent ainsi conduire ce dernier à s’attaquer aux constituants du soi. Notre susceptibilité à développer des maladies auto-immunes découlerait de l’exposition de notre système immunitaire aux micro-organismes viraux ou bactériens. L’une des théories est celle du mimétisme moléculaire. Celle-ci repose sur l’idée que les antigènes exposés par des micro-organismes puissent présenter des similitudes structurelles avec les antigènes du soi, ce qui induirait une réaction immunitaire chronique. Dans ce projet, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire impliqué chez certains patients souffrant d’une myocardite inflammatoire. Une étude récente a démontré l’existence d’un mimétisme moléculaire entre un peptide de la myosine et celui d’une bactérie commensale du tractus gastro intestinal. Ce mimétisme peut causer ou aggraver la situation chez les patients souffrant de myocardite. Cette bactérie est une bactérie commensale retrouvée chez environ 80% de la population mondiale. Cette bactérie occupe de nombreuses fonctions indispensables pour notre santé, telle que l’absorption des fibres non digestibles de l’alimentation. Dans ce projet, nous avons pour ambition de développer une technologie nous permettant d’inhiber le mimétisme moléculaire de notre bactérie d’intérêt sans pour autant altérer sa présence dans l’intestin. En effet, au contraire des antibiotiques, notre technologie nous permettra de soulager les patients souffrant de myocardite sans pour autant impacter l’intégrité du microbiote intestinal. La réussite de ce projet ouvrira de nombreuses portes dans le développement thérapeutique de demain avec notamment le développement de traitements spécifiques contre toutes les pathologies auto-immunes déclenchées ou aggravées par ce phénomène de mimétisme bactérien.
Bénéfices attendus
Le mimétisme bactérien fait l’état d’une attention toute particulière ces dernières années. En effet, de nombreux laboratoires se sont lancés dans la compréhension des intéractions entre les maladies auto-immunes et le mimétisme bactérien de résidents du microbiote intestinal, afin de cibler spécifiquement cette communication dynamique pour le développement de nouvelle stratégie thérapeutique. Dans notre étude, nous nous intéressons au mimétisme moléculaire d’une espèce commensale du microbiote intestinal, présente chez environ 80% de la population humaine mondiale et qui pourrait avoir un impact important sur le développement et l’aggravation de la myocardite inflammatoire. À notre connaissance, aucun traitement efficace n’a été développé pour soigner ces patients. Ce projet servira non seulement à démontrer la puissance et la spécificité des stratégies développées dans un environnement aussi complexe que l’intestin de mammifère, mais permettra également de mieux appréhender les intéractions entre les bactéries de l’espèce B. theta et le système immunitaire de l'hôte. Par ailleurs, nous développerons un modèle de transfert de matériel fécal humain chez la souris. Notre étude permettra également d’en apprendre plus sur ce nouveau modèle au vu d’un développement futur. En effet, ce modèle murin à flore humanisée correspond aux conditions les plus proches de celles retrouvées chez l’Homme. Pour finir, le bénéfice ultime de ce projet concerne les patients souffrant de myocardite inflammatoire. A l'issue des 5 ans d’expérimentation, nous espérons acquérir des connaissances solides sur le développement d’une stratégie de traitement efficace pour lutter contre la survenue et l’évolution de cette maladie en forme grave. Cette preuve de principe ouvrira le chemin à de nombreuses applications de traitement contre d‘autres maladies auto-immunes liées au mimétisme bactérien.
Procédures
Dans ce protocole, les animaux recevront un gavage oral de quelques secondes avec des souches bactériennes. Celui-ci sera effectué à l’aide d’une canule souple adaptée à une utilisation chez la souris par un manipulateur expérimenté à cette technique. Des prélèvements de sang de quelques secondes seront effectués sur certains animaux de ce protocole à la fréquence d’une fois par mois pendant 3 mois. Des prélèvements de fèces seront également réalisés de façon non invasive sur nos animaux durant toute la durée des procédures de ce protocole (maximum 5 fois par semaine pendant 1 mois, puis 1 fois par semaine pendant 2 mois). L’injection intraveineuse de cellules immunitaires sera effectuée une fois dans la vie de certains animaux, pendant quelques secondes. L’ensemble de ces gestes seront effectués par des manipulateurs expérimentés à ces techniques.
Impact sur les animaux
Nos souches bactériennes d’intérêt ne sont pas des pathogènes murins et ne devraient déclencher aucun symptôme à elles seules dans le modèle d’intérêt. Un léger stress est attendu lors du gavage des animaux, mais la présence de praticiens expérimentés réduira ce stress au minimum. Les souris génétiquement modifiées d’intérêt vont-elles développer des symptômes d'inflammation après injection des cellules immunitaires reconnaissant la bactérie d’intérêt. Aucun symptôme n’est attendu en l’absence de cette bactérie. D’après la littérature, l’inflammation attendue se limitera à une augmentation des cytokines inflammatoires dans le sang, et une infiltration de cellules immunitaires sans avoir d’atteintes physiques sur les animaux. Enfin, le modèle de myocardite inflammatoire devrait entrainer une activation de ces cellules immunitaires et une inflammation chronique, en particulier au niveau du cœur. Après 6-8 semaines de colonisation, ce phénotype devient progressivement létal; après 20 semaines de colonisation, jusqu’à 50% des animaux succomberont ou seront mis à morts (données issues de la littérature). Nous prévoyons de réduire la période d’observation à 12 semaines, ce qui est le minimum requis pour obtenir des données exploitables. Dans tous les cas, ces souris seront surveillées de très près, et les points limites décrits dans les procédures correspondantes seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux étant soit génétiquement modifiés soit colonisés par une bactérie (ou les deux), ils seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Dans un but de remplacement, une partie de notre étude se base sur des expériences préliminaires avec des cellules immunitaires en culture que l’on a stimulées en présence de différents peptides candidats pour être ‘non immunogènes'. Cependant, les résultats obtenus avec des cellules isolées ne sont pas représentatifs de la complexité du système immunitaire et des interactions qui peuvent avoir lieu dans un milieu structuré tel qu'un organisme vivant. De plus, les interactions entre membres du microbiote intestinal ne peuvent pas être totalement reproduites in vitro; or ces interactions sont primordiales pour évaluer l’efficacité de nos approches thérapeutiques, qui doivent pouvoir atteindre les bactéries cibles dans un contexte anatomique précis (survie des traitements dans le tractus gastro-intestinal, bactéries dans le lumen vs mucus du côlon, etc).
Réduction
Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés, une même expérience pourra être mise en place de manière à pouvoir répondre à plus d'une question scientifique en utilisant un même lot d’animaux. En amont de la phase d'expérimentation animale, nous avons comparé une collection de peptides candidats pour leur capacité à ne pas déclencher une activité dans des lymphocytes T répondants . Basés sur cette expérience, nous avons pré-sélectionné les meilleurs candidats pour ne pas avoir à comparer un trop grand nombre de peptides chez l’animal. De plus, nous allons vérifier la colonisation bactérienne dans l’intestin des animaux au cours de l’expérience à partir du matériel fécal; ce type de stratégie non invasive, que nous avons déjà mis en place dans le passé, nous permettra de réduire le nombre d’animaux à sacrifier sans perte de connaissance essentielle pour le développement et l'interprétation de nos expérimentations. En outre, pour investiguer la réduction de symptômes après traitement, nous avons choisi un modèle qui présente une très haute pénétrance dans le développement de la pathologie, afin d’optimiserle condtions expérimentales en réduisant le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation de tests statistiques (t-test, Mann Whitney et ANOVA), et la consultation au besoin de biostatisticiens tout au long des séries d’expérimentation nous permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux à utiliser tout en garantissant la qualité et la reproductibilité des résultats.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, les animaux ne seront jamais laissés seuls dans une cage pour faciliter les intéractions sociales. Les souris seront manipulées avant le début des expériences afin de les habituer et leur enlever un maximum de stress en début d’expérimentation. Les modèles animaux sont choisis avec soin en fonction de l’état actuel des connaissances ainsi que la finalité recherchée. Les procédures sélectionnées ont été préalablement étudiées pour réduire au maximum la souffrance animale. Ainsi, nous donnons une préférence aux procédures non invasives. Certaines mises seront effectuées autant que possible sur des animaux/modèles ne présentant pas de symptômes de pathologie, afin de minimiser le nombre d’animaux concernés par une procédure sévère. Les points limites établis préalablement seront bien évidemment respectés, et raffinés en fonction des résultats des premières expériences. Des tests statistiques seront utilisés tout au long du projet pour réajuster le nombre d’animaux en fonction des résultats obtenus. Dans le but de vérifier le niveau d’anxiété des animaux axéniques inoculés avec un microbiote, nous réaliserons un contrôle des expressions faciales. Aussi, dans le cadre de la seule procédure sévère de ce protocole, les animaux souffrant de déshydratation recevront une injection sous-cutanée d’une solution saline à 37°C.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous effectuerons au préalable des tests d’activités in vitro en conditions reflétant au maximum la réponse immunitaire des cellules T aux peptides candidats afin de sélectionner uniquement les meilleurs pour nos expériences chez l’animal. Cependant, un modèle qui mime les symptômes et qui nous permettra de quantifier l'efficacité de notre traitement est nécessaire; un tel modèle n’existe à notre connaissance que chez la souris, où il a déjà été développé par un chercheur expert de ce champ de recherche. De plus, il existe une version de ce modèle avec des symptômes beaucoup moins sévères, également en souris, ce qui nous permettra de répondre à de nombreuses questions scientifiques avant l’utilisation du modèle le plus symptomatique en fin de projet. Nous utiliserons dans ce projet des animaux jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines, afin de laisser la flore intestinale se stabiliser post-sevrage avant notre intervention.
Evaluation chez le rongeur, de la dose maximale tolérée (MTD) de composés biologiques ou chimiques d’intérêt.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 500
Gerbilles de Mongolie : 200
25 700 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée, 20 gerbilles placées et la grande majorité tuée. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques par toutes les voies possibles, jusqu'à des administrations intracérébrales et par minipompe implantée, sur une période pouvant aller jusqu'à un an, pour déterminer la dose maximale tolérée. Le porteur décrit perte de poids, posture voûtée, cyanose et détérioration de l'état général, avec mise à mort dès 20 % de perte de poids ou lorsque 20 % des animaux d'un groupe ont dû être euthanasiés. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire la toxicité réelle et que la vérification chez le rongeur reste nécessaire.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un composé biologique ou chimique après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale aprés une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer toxicité et la tolérabilité in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 1 an . Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Afin d’évaluer la tolérabilité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 1 an. Des effets secondaires des traitements (toxicité) pourront être observés et une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés.. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Les animaux ayant subi une administration unique de produit n’ayant pas présenté d’effets secondaires ou de signes cliniques et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine pourront être gardés en vies sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection pour la première fois d’un composé les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie… Pour certaines administrations intravésicales, il pourra être nécessaire de priver les animaux d’eau au maximum 4h, cela pourra engendrer une sensation de soif. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la toxicité et la tolérabilité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. La toxicité et la tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal recevra des doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigüe avec différents groupes pour les différentes doses, dans la mesure du possible, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes qui auraient dû recevoir une dose supérieure à celle du premier groupe dans lequel des effets secondaires seront observés. En pratique, si 20% c ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.
Raffinement
Une grille de scoring clinique a été mise en place (voir procédure). Les animaux seront pesés tous les jours dès l’administration de composés. Une perte de poids de plus de 20% constituera un point limite. Dans le contexte de première administration de composé non testé in vivo, les animaux sont scorés toutes les deux heures pendant les 6 premières heures post-administration. Un scoring clinique sera réalisé quotidiennement dès l’administration des composés. Si 20% iou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernaent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie, une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la toxicité/tolérabilité des composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Pour certaines études pré-réglementaires le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Alimentation des chiots en croissance
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
125 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie. Des chiots reçoivent des aliments à tester et subissent des prises de sang hebdomadaires et des collectes d'urine, pour évaluer l'appétence et la tolérance digestive de formulations commerciales. Le porteur affirme que le protocole "n'entraîne ni douleur ni souffrance" et suit un standard américain de l'industrie (AAFCO). Il conclut qu'aucun modèle ne peut approcher la digestion d'un aliment complet chez le chien et que des essais in vivo restent "nécessaires".
Objectifs
Pour évaluer la bonne prise alimentaire et la tolérance des aliments chiots il est nécessaire de procéder à des évaluations. Pour être complets, ces tests doivent comprendre le suivi clinique, pondéral et alimentaire des animaux, ainsi qu’une évaluation de la tolérance digestive, des mesures d'odeur de selles, des analyses d'urines et des paramètres sanguins.
Bénéfices attendus
Connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chiots en croissance. Formulation de produits au plus près des besoin des chiots pour leur garantir une appétence et une tolérance digestive optimales. Identification de nouvelles solutions nutritionnelles.
Procédures
La recolte d'urine et prise de sang seront faites avec les animaux vigiles. Une analyse de la biochimie sanguine au maximum une fois par semaine et par animal. Les paramètres pour les prises de sang incluent les mesures de la fonction rénale et hépatiques (urée, créatinine, phosphatase alcaline, albumine, gamma glutamyl transférase, glutamate-pyruvate transaminase, protéine totale, cholestérol, globuline, et bilirubine totale). L’hématologie inclura la numération des hématies et le dosage de l’hémoglobine, numération des globules blancs et plaquettes. Une analyse d’urines (couleur, turbidité, pH, protéine totale, glucose, cétones, bilirubine et sang, densité spécifique et sédiment) pourra être réalisée à la discrétion du vétérinaire. La collection d’urine se fera par collecte libre (free-catch): les urines émises par mictions spontanées sont collectées grâce à des boxes spécialement aménagés munis de plans inclinés, et récoltées dans des collas. Pendant les sorties d'exercice, les urines sont collectées directement lors de la miction. La récolte des urines se fait sur un maximum de 3 jours, seulement sur des chiots en fin de croissance (> 8 mois), et au maximum 1 fois par quinzaine (3 jours d'urines collectées tous les 15 jours). Lors de prises de sang, le volume minimum nécessaire (comme spécifié par les laboratoires d’analyses) pour analyse les marqueurs sera prélevé : 4ml/prise (sans exceder 15 % du volume sanguin sur une période de 28 jours). La prise de sang sera fait par un vétérinaire et si l’animal ne se débat pas: -sur la phase de prélèvement uniquement : 15 secondes (maximum 30 secondes) -En incluant la phase de contention, de tonte, de désinfection et de prélèvement 2 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. Le stress éventuel lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé.
Remplacement
Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards définis par l'AAFCO ( Association of American Feeding Control Officials) et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place. Le protocole a pour objectif d'évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments destinés aux chiots en croissance. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse approcher la digestion, absorption et métabolisation d’un aliment complet dans cette espèce. Il est donc nécessaire de passer par des essais in vivo au cours desquels les chiens reçoivent la formulation d’aliment à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux inclus pour chaque étude est issu de la recommandation américaine lors de la réalisation d’un protocole dit "AAFCO" (Association of American Feeding Control Officials) utilisé par l’intégralité de la profession, soit 1 lot de 10 chiots ou chatons issus au minimum de 3 différentes mères. 10 chiots inclus au début de l’étude pour avoir au moins 8 retenus à la fin.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. L'état d'anxiété lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.
Choix des espèces
Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives , ainsi que ses propres préférences alimentaires et facteurs d’appétence pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. Il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la tolérance digestive ainsi que de prédire l’appétence d’un aliment complet chez le chien. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chiots reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Stade chiots : de 2 à 12 mois pour les chiens de moins de 25 kg à l'age adulte et de 2 à 18 mois pour les chiens de plus de 25 kg à l'age adulte, la croissance étant plus longue chez les chiens de grandes races. Indépendemment de l'âge, les chiots devront peser plus de 500g pour être inclus dans ce projet.
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires de la mémoire associée au contexte de consommation d’alcool et cibler ces mécanismes avec la psilocybine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 802
320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.
Bénéfices attendus
L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).
Choix des espèces
Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.
Nouvelle procédure d’anesthésie : mise en place et formation du personnel utilisateur chez le porc.
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
3 porcs vont être utilisés dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés. Chaque animal est placé sous anesthésie générale profonde pendant deux heures, non pour produire des connaissances mais pour tester une nouvelle technique d'anesthésie et y former le personnel. Le porteur présente ce projet comme un raffinement destiné à améliorer le "bien-être" des animaux non-humains et la récupération après opération. Il décrit le porc comme un sujet "indispensable" de ses expérimentations, dont le personnel doit maîtriser les spécificités.
Objectifs
L’objectif premier est l’amélioration du bien-être animal en raffinant la procédure d’anesthésie utilisée dans le cadre de la chirurgie expérimentale. Celui-ci intègre l’utilisation de molécules halogénées plus récentes, avec moins d’effets secondaires en particulier au moment du réveil. L’objectif second s’intègre dans la formation continue et du maintien des compétences des personnels utilisateurs dans le cadre de la mise en place de cette nouvelle procédure. Ceci constituant des éléments indispensables et réglementaires dans le cadre européen et français de la recherche animale (directive européenne 2010/63/UE).
Bénéfices attendus
La finalité de ce projet est l’amélioration du bien-être animal et du respect de la règle des 3R en particulier sur le raffinement des procédures d’anesthésie profonde. Celui-ci a pour but de permettre un réveil plus rapide et une meilleure récupération post-opératoire des animaux.
Procédures
Procédure unique sous anesthésie générale profonde-Durée maximale 2 heures
Impact sur les animaux
Procédure sous anesthésie générale longue de 2h pouvant causer un stress
Devenir
Cette procédure expérimentale est classée en classe modérée permettant une potentielle réutilisation des animaux.
Remplacement
Préalablement à la mise en pratique des acquis sur modèle porcin, une session de mise à jour des connaissances théoriques en anesthésie et de formation au nouveau matériel anesthésique sera réalisée pour l’ensemble du personnel.
Réduction
Le nombre maximum estimé d’animaux nécessaire à cette mise en place et cet enseignement est de 3. De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires, une mise en pratique anesthésique sera suivie par plusieurs membres du personnel. En l’absence d’événement anesthésique secondaire au cours de la procédure et cas d’une acquisition des compétences par l’ensemble du personnel, l’ensemble des animaux ne seront pas inclus.
Raffinement
Ce nouveau protocole d’anesthésie constitue un raffinement et une amélioration du bien-être des animaux puisqu’il permet un réveil plus rapide et améliore ainsi la récupération post-opératoire de l’animal quelque soit la procédure chirurgicale réalisée et sa durée. Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale. La fréquence d'observation des animaux est doublée au réveil, passant de 3 à 6 fois par jours, et consiste en des examens cliniques de l’animal vigile, permettant une prise en charge individuelle et adaptée. Les animaux seront hébergés avant protocole expérimental en groupe en box (par 1, 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce), de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités seront hébergés en box séparés, mais au sein d'une même pièce permettant la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire.
Choix des espèces
Notre laboratoire travaille sur le grand animal dont le porc. Il nous semble donc indispensable de pouvoir adapter cette nouvelle procédure à cette espèce et proposer sa formation au personnel pour appréhender les spécificités de l'espèce et améliorer leur bien-être.. Porcs : Jeune adultes, 6-8 mois, 80Kg. Principaux sujets utilisés dans nos expérimentations.
Étude du rôle du récepteur immunitaire LILRB2 in vivo au cours de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne chez le macaque cynomolgus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
68 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 4 étant réutilisés et les autres tués. Ils sont infectés par le SIV, l'équivalent simien du VIH, reçoivent un anticorps et un traitement antirétroviral quotidien pendant dix-sept à vingt-trois semaines, avec des prélèvements répétés de sang, de ganglions, de moelle osseuse et des biopsies rectales sous anesthésie. Le porteur indique une phase aiguë avec fièvre et baisse des lymphocytes, et justifie la mise à mort par la mesure de la charge virale dans les tissus profonds. Il affirme que le primate est "le seul modèle" permettant d'étudier cette infection et qu'aucune méthode alternative n'est possible.
Objectifs
A ce jour, il n’y a aucun vaccin efficace contre le Sida, principalement en raison d’un manque de compréhension des mécanismes utilisés par le VIH pour échapper au système immunitaire. La reconnaissance d’un pathogène par une population cellulaire appelée cellules dendritiques, est une étape clé pour initier une réponse immunitaire efficace. Or l’infection par le VIH induit des dysfonctions des cellules dendritiques. Des expériences in vitro montrent qu’un récepteur immunitaire (LILRB2), qui est exprimé à la surface des cellules dendritiques, est responsable de ces dysfonctions. Ce récepteur peut intéragir avec les molécules de présentation et ainsi induire un contrôle de la réponse immune... Le VIH utiliserait les propriétés de ce récepteur pour déréguler les fonctions des cellules dendritiques. Néanmoins la démonstration du rôle de l’interaction de LILRB2 avec ses ligands in vivo au cours de l’infection par le VIH n’a jamais été faite. L’objectif de ce projet vise à caractériser, in vivo, le lien entre le récepteur LILRB2 et les dysfonctions des cellules dendritiques induite par le VIH. Aucun dispositif cellulaire ne pouvant reproduire la complexité d’une réponse immunitaire in vivo, il est nécessaire de recourir à des modèles animaux. Le primate non humain (PNH) a été choisi pour ce projet puisque c’est le seul modèle animal permettant l'étude de la physiopathologie de l'infection par le SIV, virus responsable du SIDA dans le modèle macaque. A cet égard, nous avons développé un anticorps à visée thérapeutique capable de bloquer la fixation du récepteur LILRB2 sur les moléculesde CMH-I. Cet anticorps a été développé pour fonctionner dans le modèle macaque et l’Homme afin de faciliter son transfert vers une application clinique. Différents protocoles seront appliqués. Ceux-ci incluront l’injection de l’anticorps seul ou en combinaison avec des antirétroviraux en phase précoce ou chronique de l’infection. Les résultats de cette étude pourraient ouvrir la voie vers la mise en place de nouveaux protocoles cliniques visant une rémission des patients infectés par le VIH.
Bénéfices attendus
Le suivi de l’évolution de la charge virale SIV, virus responsable du Sida chez le modèle macaque, permettra de comprendre si un anticorps monoclonal dirigé contre un récepteur présent sur les cellules immunitaires (LILRB2) à visée thérapeutique peut améliorer les réponses immunitaires et conduire à un contrôle de du virus.
Procédures
procédures sous anesthésies: - Injection unique d’anticorps. (entre 5 et 10 min) - Infection SIV (une occurrence). - Anesthésie des animaux lors des prélèvements. La durée d’anesthésie pour les prélèvements est inférieure à une heure - Différents Prélèvements sanguins,de ganglions, lavages broncho-alvéolaires, biopsies rectales et moelle osseuse seront effectués à 4 reprise chacun. La durée du prélèvement peut aller de 2 min (LBA) à 20 min (biopsies ganglions). Procédure sans anesthésie : - Traitement anti-rétroviral injecté quotidiennement du début de traitement à l’euthanasie (moins d’une minute par injection). Cette période durera entre 17 et 23 semaines, en fonction de si le traitement commencera en phase précoce ou en chronique
Impact sur les animaux
Dans les premiers jours de l’infection (phase aiguë), des effets cliniques transitoires comme de la fièvre ou une baisse du nombre de lymphocytes T CD4, peuvent apparaitre pendant quelques jours.
Devenir
Nécessité d’euthanasier les animaux exposés au SIV pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus profonds.
Remplacement
Aucune méthode alternative n’est possible pour étudier les effets de l’anticorps monoclonal sur les réponses immunitaires contre le SIV in vivo. Cette étude sur le long terme ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.
Réduction
Quatre macaques pour l’étude pharmacodynamique et huit macaques par groupe d’animaux infectés par le SIV sont les nombres d’animaux minimum nécessaires pour déterminer si les variations observées sont bien dues aux conditions expérimentales et non à des variations biologiques inter-animal. Comme mentionné précédemment, ce nombre permet d’avoir des résultats statistiques en utilisant des tests non paramétriques adaptés à des petits échantillons.
Raffinement
- Les injections d’anticorps seront réalisées sous anesthésie. De même les prélèvements de sang, de ganglion, de moelle osseuse et les lavages broncho alvéolaires seront également réalisés sous anesthésie. Les animaux recevront 1 à 2 fois par semaine des dispositifs d’alimentation supplémentaire type pebble toy ou minibrik popcorn et une fois par mois des sachets surprises contenant des friandises et des morceaux de fruits. Des jouets à ronger et à manipuler seront mis à disposition. Enfin, un dispositif de renforcement de contact positif est mis en place via la distribution de fruits sec et/ou de graines. Les animaux qui recevront des traitements antirétroviraux journaliers par voie sous cutanée, seront entrainées préalablement (training) à la contention afin de réduire le stress et les mouvements de l’animal lors de l’injection sous cuntanée. Suite à l’injection, du renforcement de contact positif sera réalisé par l’expérimentateur. Une rotation des sites d’injection sera opérée (haut, milieu, basn droite, gauche) permettant ainsi d’avoir 6 sites en rotation quotidienne.
Choix des espèces
Pour cette étude sur le long terme, le choix s’est porté sur le modèle PNH (Primate non humain) macaque pour plusieurs raisons : 1/ les PNH sont physiologiquement plus proches de l’Homme 2/ les PNH sont l’un des seuls modèles animaux permettant la caractérisation de la réponse immune au SIV: les réponses immunitaires sont similaires à celles de l’Homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés. 3/ le gène LILRB2 est conservé chez les primates et Il n’existe pas de récepteur immunitaire équivalent chez les rongeurs. 4/ l’étude se fera sur des animaux adultes qui possèdent un système immunitaire mature.
Vers le développement d’une nouvelle stratégie vaccinale anti-tumorale: étude de l’induction de réponses immunitaires efficaces par des nanoparticules dérivées de virus de plantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à deux injections de nanoparticules dérivées d'un virus de plante et des injections de cellules, ainsi que jusqu'à dix prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique une réaction inflammatoire locale de courte durée au point d'injection. Les retombées annoncées, une nouvelle stratégie de vaccination contre le cancer, sont renvoyées à un projet ultérieur, et il affirme qu'un "organisme animal" est "nécessaire" pour démontrer l'initiation d'une réponse immunitaire.
Objectifs
Depuis plusieurs années de nouvelles innovations révolutionnent et complètent l’arsenal de thérapies anti-tumorales. En effet, si les thérapies classiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie peuvent être efficaces elles affectent aussi les cellules saines non cancéreuses et sont responsables de lourds effets secondaires. De plus, certaines tumeurs développent même une résistance aux traitements. C’est pourquoi la recherche de stratégies thérapeutiques se poursuit en s’appuyant sur la compréhension des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules cancéreuses. En particulier, il existe une population de cellules immunitaires qui sont de véritables chefs d’orchestre car elles sont capables d’induire et de contrôler une réponse immunitaire conduisant à la destruction des cellules tumorales mais pas des cellules saines. Alors développer des traitements qui ciblent ces cellules d’intérêt essentielles à la réponse immunitaire anti-tumorale est une stratégie thérapeutique prometteuse. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Les nanoparticules suscitent donc un grand intérêt pour des applications en vaccination antitumorale. Ce projet vise à étudier le potentiel thérapeutique d’une nouvelle nanoparticule protéique non-toxique dérivée d’un virus de plante qui peut renfermer à l’intérieur et/ou exposer à sa surface des molécules permettant son ciblage aux cellules d’intérêt et son activité anti-tumorale. Les molécules internalisées et exposées par cette nanoparticule peuvent être facilement remplacées par d’autres molécules ce qui permet de moduler la composition de la nanoparticule pour l’adapter au mieux à chaque type de cancer. Ici, nous souhaitons, en amont d’études sur des modèles de tumeurs, étudier si cette nanoparticule est capable de cibler les cellules d’intérêt et d’induire correctement une réponse immunitaire spécifique et robuste. Si les résultats sont concluants, nous mettrons en place un autre projet qui aura pour objectif d’étudier la capacité de cette nanoparticule à induire la destruction des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
La nanoparticule plateforme de vaccination anti-tumorale de cette étude constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la fonctionnalisation de la nanoparticule utilisée dans cette étude est facilement modulable ce qui est un atout pour envisager des applications dans différentes pathologies tumorales.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. Ils recevront : une ou deux injections de nanoparticules par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc ainsi qu’une ou deux injections de cellules par voie intraveineuse. Par ailleurs, jusqu’à 10 prélèvements sanguins seront effectués. Ces trois types d’interventions (injections de nanoparticules ou de cellules et prélèvements de sang) seront tous réalisés sous anesthésie générale par un personnel compétent, habitué et formé au bien-être animal. L’anesthésie générale sera réalisée par induction gazeuse et durera 10 minutes pour les injections de nanoparticules, 1 minute pour les injections de cellules et 10 minutes pour les prélèvements sanguins. Par ailleurs pour les injections intraveineuses, l’anesthésié générale gazeuse sera complété d’une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Les animaux se réveilleront rapidement (2 à 3 minutes) et en douceur de leur anesthésie. Les transferts de cellules se basent sur des protocoles largement décrits dans la littérature et sont des outils pour l’étude des caractéristiques de la réponse immunitaire provoquée par l’injection des nanoparticules. Les prélèvements sanguins quant à eux permettront de suivre au cours du temps dans le sang des animaux des marqueurs d’activation du système immunitaire comme par exemple, la production d’anticorps. Ils seront d’un volume adapté à la fréquence des prélèvements pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant.
Impact sur les animaux
Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles-mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables. Les injections intraveineuses de cellules peuvent être la source du même genre de nuisance. Les cellules injectées proviendront d’animaux compatibles donc aucune réaction de rejet n’est à prévoir. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 10) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en sacrifice terminal en vue de récupérer les organes afin d’analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la réponse immunitaire.
Remplacement
Lors d’études préliminaires in vitro nous avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules fonctionnalisées sont des outils prometteurs pour adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Si ce type d’étude in vitro est une première étape pour la validation du potentiel thérapeutique des nanoparticules, il ne permet pas de démontrer qu’une réponse immunitaire est correctement initiée. Pour ces études, le recours à un organisme animal, dans lequel les cellules immunitaires interagissent entre elles de façon complexe au sein d’organes, est nécessaire. Nous pourrons alors étudier à l’aide de différents paramètres ou marqueurs la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à favoriser l’initiation et le maintien d’une réponse immunitaire spécifique et robuste.
Réduction
Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris (par exemple entre la nanoparticule d’intérêt et la nanoparticule contrôle ou entre la voie intradermique et la voie sous-cutanée pour les injections de nanoparticules).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Nous utiliserons des souris adultes jeunes (2 à 7 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.
Etude de l’inflammation dépendante des mastocytes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, cutanée aux oreilles par application d'acide arachidonique, rénale et arthritique, avec des injections répétées et des prélèvements de sang et d'urine, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique attendre gonflement, douleur articulaire et mobilité réduite, une buprénorphine étant prévue en analgésie. Il affirme avoir déjà caractérisé l'enzyme visée in vitro mais conclut que le remplacement complet par des méthodes sans animaux est "impossible", l'inflammation étant décrite comme un processus trop complexe.
Objectifs
L'inflammation est un mécanisme clé dans la réponse immunitaire. Néanmoins, une inflammation excessive, par exemple suite à des infections ou d'origine auto-immunitaire présente un risque sanitaire sérieux. Des traitements anti-inflammatoires existent mais ont des effets secondaires potentiellement importants. Une meilleure compréhension des acteurs cellulaires et moléculaires est donc requise pour une prise en charge optimale et un développement thérapeutique ciblé contre les acteurs de l’inflammation. Les mastocytes représentent un type de cellules immunes primordial dans l'orchestration de l'inflammation, mais dont le rôle précis reste à découvrir. Afin de limiter l’expérimentation sur l’animal, nous avons préalablement mené des études in vitro, qui nous ont permis d’identifier et de caractériser une enzyme présente dans les mastocytes. Nous avons démontré que cette enzyme est nécessaire à la libération de médiateurs pro-inflammatoires in vitro. En effet, les mastocytes dépourvus de cette enzyme présentent une diminution significative de la sécrétion des molécules pro-inflammatoires. De plus, des molécules bloquant l’enzyme étudiée sont disponibles. C’est pour cela que nous émettons l’hypothèse que l’enzyme d’intérêt est un nouveau candidat pour le traitement ciblé de l’inflammation indésirable. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques, son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que l’utilisation de modèles inflammatoires in vivo chez la souris est indispensable. Nous prévoyons d’étudier le rôle de l’enzyme d’intérêt dans trois modèles inflammatoires in vivo. Dans chacun de ces modèles la gravité de l’inflammation de sera comparé entre les souris génétiquement invalidées pour l’enzyme étudiée, des souris traitées avec l’inhibiteur spécifique et des souris contrôles. Nous allons également reconstituer des souris dépourvues de mastocytes avec des mastocytes génétiquement invalidés pour l’enzyme étudiée ou contrôles. Ceci nous permettra d’évaluer la participation des molécules inflammatoires issues des mastocytes dans les pathologies étudiées. Ce projet aura donc pour objectif de consolider le rôle de l’enzyme en question dans l’inflammation dépendante des mastocytes et de la valider comme nouvelle cible thérapeutique potentielle.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus répondront à la fois à des questions de la recherche fondamentale en apportant une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’inflammation dépendante du mastocyte et également aux besoins de la recherche translationelle en permettant de valider la protéine d'intérêt comme nouvelle cible pour le développement de médicaments anti-inflammatoires à long terme.
Procédures
Modèle d’inflammation cutanée des oreilles: sur animaux vigiles: injection sous-cutanée d’un analgésique (1x, durée du geste
Impact sur les animaux
Les nuisances infligées aux animaux dans ce projet comprennent le stress et la douleur induits par la manipulation et l’injection des produits (i.p. et i.v.). L’application d’acide arachidonique déclenche une réaction allergique locale, caractérisée par un gonflement, de la chaleur et l’hypersensibilité cutanée. La douleur est attendue également suite au déclenchement de l’arthrite et l’inflammation rénale. Pour l’arthrite, la douleur dans les articulations des membres peut entrainer une mobilité réduite. Dans tous les cas, les protocoles expérimentaux prévoient la mise à mort à l’issue de la procédure. Les durées des procédures après déclenchement de l’inflammation sont variables en fonction de la pathologie declenchée (1 heure, 4 jours et 8 jours), ainsi limitant les nuisances potentielles, même légères, dans le temps. Une mise à mort anticipée aura lieu dès qu’un animal atteindra les points limites détaillés plus bas.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement et analyse des paramètres biochimiques des organes ciblés.
Remplacement
Les mastocytes dépourvus de la protéine d’intérêt ont été étudiés et caractérisés in vitro. Le mode d’action d’une molécule bloquant spécifiquement cette protéine a également été validé sur des cellules de cultures. Ces travaux préalables nous ont permis d’avoir recours à l’expérimentation animale de manière très ciblée en choisissant des modèles d’inflammation qui impliquent les mécanismes mis en évidence in vitro, notamment la sécrétion des médiateurs inflammatoires par les mastocytes. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques; son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que le remplacement complet des modèles in vivo par des techniques in vitro dans le contexte de notre étude est impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux est justifié par la nécessité d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant des test statistiques adéquats. Le nombre a été calculé avec l’aide de l’assistant de conception expérimentale (NC3RS) et confirmé avec le logiciel invivostat, utilisant un calcul basé sur la puissance statistique 90% et signification à 5%. Ce nombre sera davantage réduit si les premières expériences effectuées avec les souris génétiquement modifiées ne montrent pas de différence comparable aux souris contrôles. Dans ce cas, les procédures ne seront pas appliquées sur les souris déficientes en mastocytes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de limiter la souffrance due aux injections sous-cutanées, i.p. et i.v., les injections seront réalisées avec des seringues à insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Les prélèvements sanguins par ponction à partir de la veine faciale seront réalisés avec une lancette pour animaux (traumatisme minime à l'encontre de l'animal). L’accès à l’eau pour une bonne hydratation des animaux sera contrôlé quotidiennement. Un traitement analgésique par injection sous-cutanée de buprénorphine à 0,1mg/kg est prévu pour tous les modèles d’inflammation. Si un animal démontre ressentir une douleur basée sur une expression modérée ou sévère, un renouvellement du traitement analgésique sera réalisée immédiatement. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Pour toutes les procédures, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Le modèle murin permet également l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus de nombreux outils expérimentaux et analytiques ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. De surcroît, le modèle d’inflammation rénale murin partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Souris adultes âgées de 8 à 12 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé pour l'étude de l'inflammation dépendante des mastocytes. De plus, le nombre de mastocytes augmente avec l'âge ainsi augmentant le phénotype dans les modèles choisis. L'age de 8 semaines est indiqué dans la littérature spécifique sur ce modèle d'arthrite auto-inflammatoire.
Etude du rôle du microbiote dans le processus cancéreux de tumeurs digestives
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur greffe un tissu tumoral sous la peau, puis on leur administre une bactérie par voie orale ou par injection dans la tumeur trois fois par semaine pendant six semaines, certaines étant réopérées pour retirer la tumeur avant deux mois d'observation, avant la mise à mort. Le porteur décrit un retentissement qu'il présente comme limité, avec une faible perte de poids. Il indique s'appuyer sur des données cliniques de patients pour réduire le recours aux souris, mais retient la souris greffée comme "modèle préclinique pertinent" pour le processus cancéreux.
Objectifs
Le cancer de l’anus est une tumeur rare encore peu étudiée mais très invalidante et dont la fréquence augmente. Sa prise en charge thérapeutique conduit encore à des conditions de vie dégradées et à des échecs thérapeutiques chez de nombreux patients. Une meilleure compréhension de ce cancer est donc nécessaire pour améliorer in fine cette prise en charge. Nos travaux portent sur des analyses, non pas uniquement des cellules tumorales elles-mêmes, mais également de leur environnement afin de mieux comprendre ces cancers. Ainsi, nous étudierons plus particulièrement l’impact du microbiote intestinal. Le microbiote (ensemble des micro-organismes - bactéries, virus, parasites, champignons non pathogènes, dits commensaux - qui vivent dans un environnement spécifique) et son équilibre sont maintenant bien connus pour jouer un rôle prépondérant pour notre Santé. Ainsi, un germe majeur de ce microbiote intestinal a été analysé dans les tumeurs de la tête et du cou et dans les tumeurs du rectum. Sa présence a été associée pour les premiers (tête et cou) à un bon pronostic, contrairement aux tumeurs du rectum. Le cancer de l’anus est proche à la fois des tumeurs tête et cou par la nature de l’épithélium et de celui du rectum par sa localisation. Notre étude a pour but, à la fois d’acquérir une meilleure connaissance biologique des cancers de l’anus et d’aider à déterminer s’il existe un intérêt à cibler cette bactérie dans la prise en charge thérapeutique des patients.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux a pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la pathologie de ce cancer invalidant afin d’améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
Un premier groupe de souris sera greffé en sous-cutané avec du tissu tumoral sous anesthésie (20 minutes d’anesthésie pour la greffe qui nécessite une intervention chirurgicale très courte elle-même d’une durée de 2 min max). Ces souris recevront la bactérie d’intérêt par oral (animaux vigiles) ou bien par injection dans la tumeur (animaux anesthésiés) 3 fois par semaine (durée du geste < 30 secondes), pendant les 6 semaines de suivi de croissance tumorale avant d’être euthanasiées pour analyse post-mortem. Un deuxième groupe de souris sera greffé avec la tumeur (sous anesthésie : durée 20 min) et traité avec la bactérie de la même façon (injections intratumorales sur animaux anesthésiés ou gavage sur animaux vigiles : durée du geste
Impact sur les animaux
Ce travail porte sur des cancers qui se développeront chez des souris greffées. Selon la localisation de la greffe, la tumeur peut ne pas avoir de retentissement sur l’état général (croissance uniquement locale en sous-cutané) ou bien avec un retentissement général qui reste limité dans notre expérience (faible perte de poids, traitement antalgique permettant la prise en charge de la douleur induite par l’intervention chirurgicale). La durée est celle de l’expérience, de 6 à 14 semaines maximum. De plus, les nuisances attendues lors de l’administration de la bactérie seront celles liées à l’injection intra-tumorale ou par le gavage de produits non toxiques et non irritants.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les données cliniques de tumeurs de patients ont été largement utilisées afin d’obtenir un maximum d’information sans avoir recours à l’animal. Elles permettent aussi de définir au mieux le plan expérimental ayant recours aux souris dans le but de réduire le nombre d’animaux. De même, des analyses sur du matériel congelé nous permettent de remplacer des approches chez l’animal pour sélectionner le modèle tumoral le plus susceptible d’être colonisé par la bactérie.
Réduction
Les analyses moléculaires préliminaires portent sur des tissus déjà congelés (pas de recours à de nouveaux animaux pour cette analyse) et permettront de ne greffer sur l’animal que les tumeurs de la collection présentant un intérêt pour l’étude. Une première expérience pilote sur un nombre faible d’animaux permettra de choisir le modèle d’infection le plus efficace qui sera utilisé dans la suite du projet. Le test de Mann-Whitney sera utilisé pour comparer le développement de métastases dans les différentes conditions.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et avec l’administration d’analgésique pour couvrir la période per et post-anesthésie. Les souris seront suivies au minimum 3 fois par semaine. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective, l’état des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de souris greffé avec des tumeurs dérivées de tumeur de patient est reconnu comme un modèle préclinique pertinent pour étudier le processus cancéreux. Souris nudes adultes afin de pouvoir réaliser une greffe en sous-cutané de tumeur.
Etudes courtes d’évaluation de la toxicité aiguë chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1500
4 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent par gavage une dose unique d'un produit dont la toxicité est inconnue, puis des prélèvements sanguins, pour classer les substances selon leur toxicité aiguë. Le porteur reconnaît des effets pouvant aller de l'hypersalivation aux tremblements, à la prostration et aux convulsions imposant la mise à mort. Il présente les modèles in silico et in vitro comme complémentaires, mais qualifie l'animal d'"incontournable" pour évaluer un produit sur un "organisme entier".
Objectifs
Ces premières études courtes d’évaluation de la toxicité aiguë in vivo permettent de confirmer la toxicité éventuelle du produit et d’éliminer du processus de développement des produits dont la toxicité est trop élevée et que les données provenant d’essais in vitro ou in silico n’auraient pas révélées. La toxicité aiguë désigne des effets nocifs résultant de l’administration d'une seule dose d'un produit ou d'une seule exposition à celui-ci. On évite ainsi d’utiliser des animaux de laboratoire pour des produits dont le développement ne pourrait arriver à son terme. Les études d’évaluation de la toxicité aiguë par voie orale chez la souris ou chez le rat : Acute Rat or Mouse Oral Screen (AROS or AMOS) ont pour objectifs de tester une dose de référence établie sur la base de la connaissance des produits déjà développés et de la famille chimique testée.
Bénéfices attendus
Les données générées permettent de caractériser le potentiel toxique d’un produit suite à une administration unique et ainsi de différencier et classer les produits en fonction de leur toxicité après une exposition aiguë (risque accidentel). Ceci permet d'éliminer, très rapidement et en utilisant peu d'animaux du processus de développement, des produits trop toxiques, d'éviter des études plus longues et donc l'utilisation d'un plus grand nombre d'animaux. Ces études sont nécessaires pour permettre le transport du produit testé vers d’autres installations d’essai en conformité avec la réglementation et garantir la sécurité des utilisateurs.
Procédures
Les animaux vigiles seront exposés oralement par gavage aux produits par une administration unique. Cette procédure est réalisée en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins, de volumes très faibles pourront être pratiqués sans anesthésie au cours de l'étude. Chaque prélèvement prend moins de 2 minutes et sera réalisé au maximum 3 fois au cours de l'étude.
Impact sur les animaux
Les effets toxiques attendus sur ce projet peuvent être sévères car ce sont les premières études réalisées sur l'animal. Les signes cliniques les plus communs sont des augmentations de salivation, les signes cliniques les plus sévères qui nécessitent l'euthanasie de l'animal sont des baisses de température corporelle, des tremblements, de la prostration ou des convulsions. Les produits sont administrés une fois par gavage à l'aide de sondes souples (procédure qui peut induire un stress inférieur à 15 sec). En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits à la veine caudale ou saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes, qui disparaissent rapidement. Avant traitement, les rats sont soumis à un jeûne de 20h maximum pouvant engendrer une perte de poids inférieure à 10% du poids corporel et réversible après la réintroduction de la nourriture.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort en fin d'étude. La réutilisation de ces animaux n'est pas possible car les effets induits par l'administration de substances chimiques pourraient affecter les résultats de toute étude ultérieure.
Remplacement
Pour évaluer la sécurité des produits chimiques sur la santé humaine, des études combinant des modélisations mathématiques par ordinateurs (études in silico) ainsi que des modèles cellulaires (tests in vitro) sont réalisées. Des modèles animaux (études in vivo) sont cependant incontournables pour appréhender les effets d’un produit chimique sur un organisme entier.
Réduction
La taille des groupes est réduite au minimum pour permettre une évaluation de la toxicité : 3 animaux par groupe, un seul sexe et pas de groupe témoin.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu pour leur bien-être. Les procédures (surveillance clinique, administration des substances chimiques, l'anesthésie, les prélèvements...) seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté pour éviter le stress et l'inconfort inutiles. Les animaux sont observés quotidiennement y compris le week-end, avec une attention plus particulière le jour du traitement. Des points limites appropriés et validés par le Comité d'éthique et la SBEA ont été mis en place, ainsi qu'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la SBEA sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées : la dose maximale utilisée est en général 300 mg/kg. On utilise donc des doses inférieures aux doses limites préconisées dans les lignes directrices pour le calcul de la toxicité aiguë (Dose létale 50%). En fonction de la toxicité connue d'une famille, une dose inferieure sera testée en première intention et le choix de la 2eme dose dépendra des signes observés.
Choix des espèces
Ces études sont réalisées chez le rongeur car ce sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur utilisation fréquente dans les études toxicologiques et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les études décrites dans ce projet utilisent de jeunes rongeurs adultes à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines, conformément aux études constitutives du dossier de mise sur le marché des produits.