Recherche appliquée

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.

Procédures

En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.

Les 70 rats de ce projet portent un gène ABCA4 non fonctionnel, une lignée de la maladie de Stargardt, et les 6 macaques à longue queue, des primates, sont sains. Ces 76 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Outre une injection de vecteurs viraux sous la rétine des deux yeux, chaque macaque peut subir en six mois jusqu'à 15 séances d'imagerie sous anesthésie, avec prise de sang, et jusqu'à 8 tests de la fonction rétinienne, eux aussi sous anesthésie, et le porteur indique que ces anesthésies répétées peuvent stresser rats et macaques. Il affirme qu'une toxicité immunitaire liée aux intéines ne peut être mise en évidence chez les rongeurs, et qu'il est donc "nécessaire de passer au modèle macaque". Tous sont tués pour prélever sang, yeux, foie, rate, nerf optique et cerveau.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique liée à des mutations sur le gène ABCA4. Elle a une prévalence de 1 pour 8000 à 10000 personnes, et se traduit par une dégénérescence rétinienne avec une cécite diurne, qui impacte à la fois les hommes et les femmes à partir de l’adolescence. La protéine ABCA4 est un transporteur essentiel pour le métabolisme des photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. En absence d’ABCA4, on observe une accumulation de déchets métaboliques dans les photorécepteurs, qui finissent par dégénérer. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace pour cette maladie. La thérapie génique, qui consisterait à venir ramener une copie fonctionnelle du gène ABCA4 dans les cellules rétiennes, est une approche prometteuse. Mais une limite de cette approche est que le gène ABCA4 est trop grand pour être intégré dans les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV), vecteurs de choix pour transférer un gène dans la rétine. Une approche alternative consiste à délivrer deux vecteurs rAAVs, chacun porteur d’une moitié du gène ABCA4, associé à des structures spécifiques appelées ‘intéines’. Les deux moitiés de la protéine ABCA4 sont produites dans les cellules transduites, et une ligation s’effectue grâce aux intéines pour reconstruire une protéine ABCA4 entière. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité et la potentielle toxicité d’un traitement de thérapie génique basé sur l’utilisation de vecteurs recombinants «AAV-ABCA4-intéine» pour la maladie de Stargardt. L’évaluation de l’efficacité de ces vecteurs sera réalisée après injection sous-rétinienne chez le rat ABCA4-/-, modèle de la maladie de Stargardt dans lequel le gène ABCA4 est non fonctionnel. L’objectif sera de réduire le taux de déchets métaboliques dans la rétine, après expression de la protéine complète d’ABCA4, tout en vérifiant qu’une structure correcte de la rétine est maintenue. En parallèle de cette étude d’efficacité chez ce modèle de rat, nous évaluerons le risque de toxicité des «AAV-ABCA4-intéine» chez le macaque sain. En effet, les intéines étant des éléments protéiques exogènes, étrangers au système immunitaire, elles pourraient induire une toxicité immunitaire. Une telle toxicité ne pouvant pas être mise en évidence chez les rongeurs (connus pour tolérer un certain nombre de protéines exogènes, après transfert avec un vecteur AAV), il est donc nécessaire de passer au modèle macaque pour répondre à cette question.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’évaluer l’effet thérapeutique des vecteurs les vecteurs «AAV-ABCA4-intéine» après injection sous rétinienne chez des rats pour lesquels le gène ABCA4 n’est pas fonctionnel et de valider l’absence de toxicité de cette approche thérapeutique chez le macaque. L’évaluation in vivo des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. De plus, si cette approche est validée pour le gène ABCA4, elle pourra potentiellement être transposée pour soigner d’autres maladies génétiques ayant un gène trop grand pour être inséré dans un seul vecteur AAV.

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne des vecteurs «AAV-ABCA4-intéine » dans les 2 yeux : Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 2h maximum pour les macaques. (ii) Imagerie rétinienne : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 4 fois le premier mois puis maximum deux fois par mois, soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 20 minutes maximum pour les rats et 1h pour les macaques. (iii) Test de fonctionnalité de la rétine : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois par mois, soit au maximum 3 fois pour les animaux gardés 3 mois, pour les macaques une fois avant l’injection des vecteurs, 2 fois le premier mois puis maximum une fois par mois, soit un maximum de 8 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée de l’anesthésie 30 minutes maximum pour les rats et 1h30 pour les macaques. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, pour les rats une fois avant l’injection des vecteurs puis une fois par mois post-injection, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Pour les macaques lors des mêmes anesthésies que les imageries rétiniennes soit un maximum de 15 fois pour les animaux gardés 6 mois. Durée du geste 10 minutes maximum pour les deux espèces.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection sous rétinienne. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les animaux peuvent être stressés par les anesthésies répétées mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur. La récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

La rétine, structure complexe composée de multiples couches de neurones et cellules nourricières, ne peut être reconstituée parfaitement in vitro. Il existe aujourd’hui des protocoles modélisant la rétine à partir de cellules souches différentiées, mais l’interaction complexe du cycle visuel ne peut pas être testée in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la pathophysiologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme. D’autre part, la pathologie de Stargardt est induite par une toxicité liée au métabolisme de la vitamine A présent dans l’œil à la naissance et supplémenté via la circulation choroidale. Cet effet systémique de la vitamine A ne peut pas être reproduit in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience précédente de précédents projets, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de ces tailles, que ce soit avec le modèle de rat ABCA4-/- ou le macaque sain. Pour les rats ABCA4-/-, nous nous laissons la possibilité d’inclure entre 1 et 3 animaux supplémentaires par groupe, en cas d’échec des injections sous-rétiniennes. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi pour les analyses quantitatives et généré par une analyse de puissance (puissance de 80% et significativité de 5%). Le nombre d’animaux inclus dans les groupes injectés avec le vecteur thérapeutique est plus important que le nombre d’animaux inclus dans les groupes non injectés ou injectés avec un tampon, pour tenir compte du fait d’une certaine variabilité de l’efficacité thérapeutique. Avec 10 animaux (20 yeux) maximum par groupe nous pourrons réaliser un certain nombre d’analyses post-mortem avec des analyses statistiques pertinentes. Le suivi longitudinal non invasif par imagerie de la rétine permettra aussi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour les analyses chez le macaque le nombre d'animaux utilisés est réduit à son strict minimum (n= 4 animaux injectés avec le vecteur, et n=2 animaux injectés avec un tampon, avec injections bilatérales). Malgré tout, nous savons que ce nombre permettra d'apporter les réponses aux questions posées dans cette étude. Les facteurs d’évaluation principaux seront la quantification de l’expression du gène ABCA4, la présence ou non s’il y a une réponse immunogénique contre ABCA4 et une analyse statistique sur les amplitudes des résultats d’électrorétinogrammes (analyse de la réponse électrique de la rétine). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales.

Raffinement

Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels pour les rats, et dans un milieu enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés pour les macaques. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L'application de critères d'arrêts et un suivi des animaux à l’aide de grilles de score, d’un arbre décisionnel nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés voir de décider d'une mise à mort prématurés.

Choix des espèces

Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique avec un œil suffisamment large pour permettre une distribution uniforme du fluide sous la rétine. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt. Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. Mais les études menées chez les rongeurs ne peuvent être translatées de façon sûre et efficace à l’homme sans passer par une étude intermédiaire dans une espèce présentant une organisation de l’œil comparable à celle de l’homme, comme c’est le cas chez les cercopithécidés. Le choix de macaca fascicularis se trouve pleinement justifié par le fait que l’on trouve dans cette espèce une organisation du système visuel, une dimension et une structure du globe oculaire mais également de la rétine, avec la présence d’une macula (absente chez les rongeurs) ainsi qu’un système immunitaire comparable à ceux de l’homme.

2 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent l'ablation des cinq sixièmes de leurs reins en deux opérations chirurgicales, puis une exsanguination terminale, tandis que les souris reçoivent une injection de glycérol provoquant une destruction musculaire avant d'être décapitées sous sédation. Le porteur reconnaît une douleur modérée et continue liée à la chirurgie rénale. Il teste des molécules contre la maladie rénale chronique et présente les modèles in vivo comme "les plus adaptés et les plus prédictifs", écartant les cultures cellulaires limitées à un seul type de cellule.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une détérioration lente et progressive de la capacité des reins à filtrer les déchets métaboliques du sang. Les causes majeures sont le diabète et l’hypertension artérielle. Les conséquences sont une acidification du sang, le développement d’une anémie, l’endommagement des nerfs, une détérioration du tissu osseux et un risque augmenté d’athérosclérose. De plus, une atteinte rénale aiguë peut devenir une maladie rénale chronique si la fonction rénale n’est pas rétablie après le traitement et dure plus de trois mois. Les traitements actuels visent à limiter les liquides, le sodium et le potassium dans l’alimentation ; la prise de médicaments destinés au traitement d’autres pathologies (telles que le diabète, l’hypertension artérielle, l’anémie et les déséquilibres électrolytiques) et, le cas échéant, à faire appel à la dialyse ou à une greffe de rein. Il existe un ensemble de données concordantes révélant que l’existence d’une atrophie continue et la diminution de la masse musculaire constituent des facteurs de risque indépendants de la mortalité chez les patients ayant une maladie rénale chronique. La lutte contre l’atrophie musculaire apparait donc comme une composante majeure pour améliorer le pronostic des patients ayant une altération de la fonction rénale. L’objet de ce projet est d’évaluer chez l’animal le potentiel de nouvelles molécules sur les fonctions musculaires et rénales, molécules dont on a démontré préalablement des effets bénéfiques sur le muscle squelettique in vitro. Deux modèles animaux ont été retenus ; le premier est un modèle aigu comparable à la rhabdomyolyse chez l’homme et le deuxième un modèle chronique avec une forte altération métabolique. • Quel est l’impact du muscle squelettique sur le bon fonctionnement du rein ? • Des molécules actives sur la fonction musculaire peuvent-elles préserver la fonction rénale ? • L’ensemble des données collectées permettront-elles de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans les maladies rénales afin de retarder et/ou diminuer le nombre de personnes dialysées ?

Bénéfices attendus

- Amélioration de la fonction musculaire - Amélioration de la fonction rénale - Retardement du moment de dialyse - Amélioration de la fonction d’autres organes. Pour l’homme, les molécules actives permettraient d’envisager une nouvelle stratégie thérapeutique pour les maladies rénales. La protection du muscle et du rein permettrait d’envisager un retardement du moment de la dialyse et de meilleures conditions de vie.

Procédures

Sur rats néphrectomisés, la procédure chirurgicale consiste à réaliser une résection au 5/6ème des 2 reins du rat. Elle est réalisée en 2 fois à une semaine d'intervalle; le rein droit est enlevé au cours de la 1ère opération, les 2/3 du rein gauche au cours de la 2nde opération. Chacune des opérations réalisées sous anesthésie a une durée moyenne par animal de 30 minutes. 2 prélèvements de sang de 500µl seront réalisés à l'extrémité caudale sur animaux vigiles (extrémité caudale après anesthésie locale) 2 semaines avant et 6 semaines après l'opération chirurgicale. Chaque prélèvement sanguin a une durée de 2 à 3 minutes. Une exsanguination terminale des rats et un prélèvement d'organes d'intérêt sont réalisés 10 à 12 semaines suivant l'opération après sédation à l'isoflurane 4%. Pour le modèle de souris présentant une atteinte rénale aigue, l'animal reçoit une injection (10 secondes) intramusculaire unique de glycérol sous anesthésie. 48 ou 72h après, chaque souris sera décapitée après sédation à l'isoflurane 4% pour permettre le recueil du sang terminal et des organes.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales entrainent une douleur modérée et continue. La chirurgie sous anesthésie générale et l'analgésie appropriée permettent d'atténuer cette douleur, la souffrance postopératoire et le trouble de l'état général. Aucune perte pondérale significative n'est attendue dans le modèle 5/6Nx ni aucun effet sur les paramètres comportementaux (activité motrice, anxiété, exploration, altération de la mémoire) malgré une forte variabilité et une fluctuation dans le temps de ces paramètres. Les différents travaux déjà réalisés sur ce modèle ne montre pas de lien entre l’aggravation des fonctions rénales et une baisse de l’activité motrice, de la cognition ou des émotions.

Devenir

Tous les rats ayant subi la procédure expérimentale de néphrectomie seront traités avec les molécules d'intérêt pendant 12 semaines minimum puis euthanasiés (prélèvement de sang + organes) Toutes les souris utilisée dans la procédure d'atteinte rénale aigue seront euthansiées au plus tard 72h après l'induction de la rhabdomyolyse (prélèvement de sang + organes)

Remplacement

Pour tester les molécules dans le cadre des pathologies rénales, les modèles vivo sont les plus adaptés et les plus prédictifs. En effet, le rein est un organe dont la structure tri-dimensionnelle est importante pour sa fonction de filtration et formé de plusieurs types cellulaires (podocytes, cellules mésangiales, cellules épithéliales). Les modèles in vitro sont restreints à l’observation d’un seul type cellulaire, sans prise en compte des interactions intercellulaires et environnementales caractéristiques d’un tissu dans son milieu d'origine. Il existe des organoïdes, cependant les structures obtenues ne sont pas organisées comme dans un rein et l’absence de l’uretère dans ces modèles empêche l’évaluation de l’ensemble des fonctions rénales. De plus, le but de ce projet est d’évaluer l’influence des muscles sur cette fonction rénale et les nouvelles thérapies envisagées sont de traiter le muscle. Ce but ne peut être atteint qu'en utilisant un modèle animal qui présente cette intégrité physique.

Réduction

Modèle de pathologie aigue (rhabdomyolyse) Une à deux études pilotes seront réalisées pour confirmer l’obtention du modèle avec un taux de réussite estimé proche de 100%. Il est donc envisagé d’injecter 10 souris par lot sur les 2 premières cohortes pour lesquelles les paramètres d’atteinte rénale et musculaire seront mesurés afin d’évaluer la robustesse du modèle obtenu (48 à 72h après induction) Les 2 lots de chacune de ces 2 premières cohortes seront des animaux contrôles injectés en intramusculaire avec du sérum physiologique (sham) et des animaux pathologiques injectés avec du glycérol 50%. Par la suite, si la mise au point est conforme aux attentes, les cohortes seront constituées de 5 à 6 lots de 10 souris pour permettre le test de 2 à 3 molécules. Il est prévu de réduire le nombre d’animaux induits à n=6 dans les lots sham et référence (quinacrine) en consolidant les données obtenues avec celles générées à l’occasion des études pilotes. Seules les molécules présentant une activité sur le modèle de rhabdomyolyse (pathologie rénale aiguë) seront évaluées sur un modèle de pathologie rénale chronique. Modèle de pathologie chronique (néphrectomie) Une à deux études pilotes seront réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires dans chaque lot test. L’induction de la pathologie rénale par néphrectomie pouvant présenter une légère variabilité, il est estimé nécessaire d’opérer 12 rats/lot pour obtenir 8 à 10 animaux présentant les signes cliniques de la maladie rénale chronique. A l’issue de la mise au point, les lots envisagés dans chaque cohorte d’étude d’un composé sont Contrôle Sham, Contrôle pathologique, référence (MnTBAP), molécules à tester. Chaque lot sera constitué de 8 à 10 animaux pour mettre en évidence des effets statistiques interprétables. Les molécules seront évaluées sur une période de 12 semaines et les cohortes seront constituées au minimum de 5 à 6 lots d’animaux pour permettre de tester 2 à 3 molécules. L’objectif est de réduire le recours à l’opération systématique d’animaux pour les lots sham, contrôle pathologique et référence. A l’issue des 2 premières études, il est prévu de ramener entre 6 et 8 le nombre d’animaux affectés au groupe sham et référence, les résultats sur ces 2 groupes seront consolidés avec les données obtenues lors des tests pilotes.

Raffinement

Pour le modèle de néphrectomie 5/6Nx, 48h avant l’opération, une analgésie pré-opératoire sera réalisée par voie orale L'anesthésie et l'analgésie pour l'opération chirurgicale seront obtenues avec l'association d'un sédatif, d'un analgésique et d'un anesthésique. Pendant l’opération, la température corporelle sera suivie et les animaux maintenus sous lampe chauffante. En fin de chirurgie, les rats recevront 2 fois/jour une dose d'antalgique pendant 3 jours. Les rats seront mis en boite individuelle jusqu'à cicatrisation complète. L'aliment dans la mangeoire sera également disposé dans la cage et un enrichissement type sizzle dry sera disposé avec la litière. La surveillance post opératoire sera quotidienne avec une grille de score associée à une feuille d'observation individuelle.

Choix des espèces

Les espèces choisies, souris pour l'atteinte rénale aigue (rhabdomyolyse), rat pour l'atteinte rénale chronique (néphrectomie) sont celles les plus couramment utilisées pour étudier ces pathologies et l'effet de nouvelles molécules permettant un traitement potentiel. Ces modèles permettent l’étude conjointe de l’atteinte musculaire et rénale. Les animaux sont des rats adultes (6-7 semaines) pour la néphrectomie et des souris adultes (7-8 semaines) pour le modèle de rhabdomyolyse. Pour ces 2 modèles, l'âge retenu permet d'inclure des animaux n'ayant pas une atteinte rénale spontanée et d'éviter une variabilité des paramètres biochimiques rénaux et plasmatiques liée à l'âge qui pourrait interférer avec l’effet attendu du traitement.

350 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort prévue, une partie devant être réutilisée dans d'autres projets et une trentaine proposée à l'adoption vers six à huit ans. On leur provoque une otite externe, infectieuse ou non, puis on les soumet à des prélèvements sanguins à la jugulaire et à des écouvillonnages du conduit auditif pour tester des produits destinés au marché vétérinaire. Le porteur décrit les symptômes attendus, exsudat, rougeurs, démangeaisons et douleur de l'oreille, et une contention légère. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'otite du chien et justifie l'espèce par l'obligation de tester les produits dans l'"espèce de destination".

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place un modèle d’otite externe infectieuse ou non chez le chien et d’utiliser ce modèle pour la sélection de solutions thérapeutiques et/ou préventives pour la prise en charge de l’otite chez le chien. La maîtrise des ces modèles permettra d’évaluer la tolérance et/ou l’efficacité de produits thérapeutiques destinés à une mise sur le marché.

Bénéfices attendus

Ce projet de modèle d’otite expérimentale présente plusieurs avantages par rapport aux modèles d’otites terrain. Les oreilles du chien sont extrêmement sensibles et sont par conséquent prédisposées à des troubles tels que l’otite. Une otite est une inflammation du pavillon ou du conduit auditif en réponse à un traumatisme infectieux ou physique. Il existe plusieurs origines aux otites chez le chien, les otites infectieuses dues à des bactéries ou des champignons, les otites parasitaires et les otites allergiques. Lors d’une infection expérimentale de l’oreille, la dose inoculée (nombre de bactéries / champignons / parasites ou agent allergène ou irritant) est connue et maitrisée et les caractéristiques de l’infection/inflammation sont suivies et maitrisées dès la phase précoce de la maladie. La mise en place et la maîtrise de modèles d’otite induisant des signes cliniques significatifs permettent d’évaluer la tolérance et l’efficacité d’un traitement de l’otite dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de molécules/produits et de sélectionner rapidement et de façon plus sure, des molécules/produits présentant une probabilité importante de succès de guérison sur un nombre optimisé d’animaux.

Procédures

Des prélèvements sanguins et / ou microbiologiques seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention légère ne visant qu’à restreindre ses mouvements pour sa sécurité et celle des manipulateurs, selon les procédures en vigueur sur le site et selon les recommandations de la réglementation en vigueur. Avant et éventuellement après induction de l’otite, des prises de sang pourront être réalisées afin de suivre l’état de santé des chiens. Ils seront généralement réalisés à la veine jugulaire (ponctuellement un autre site : veine céphalique) et effectués en environ 3 minutes par chien, au maximum une fois par jour. Durant la phase d’induction de l’otite et au cours du suivi de la régression (efficacité) de l’infection, des prélèvements microbiologiques par écouvillonnage pourront être réalisés dans le conduit auditif externe du chien, sous le contrôle d’un vétérinaire. L'intervention prend moins de 5 minutes par chien et sera réalisée au maximum une fois par jour. La fréquence des prélèvements sera définie et justifiée dans le plan d’étude.

Impact sur les animaux

La mise au point des modèles otite et les études de tolérance / efficacité pharmacologiques, requièrent une contention légère des animaux, pendant des temps très courts, à quelques reprises, durant l’induction de la pathologie et/ou l’administration des produits ou encore lors d’éventuels prélèvements (ex. sang, microbiologiques…). Les symptômes de l’otite externe sont, présence d’exsudat, rougeurs, démangeaisons et gène / douleur à l’extérieur de l’oreille, sur le pavillon et le conduit auditif externe. Il est donc important d’établir un diagnostic rapide et apporter un traitement adapté.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, les euthanasies ne sont pas prévues. Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans l'animalerie ou adoptés lorsqu'ils atteignent l'âge de 6 à 8 ans. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire l’otite infectieuse ou non infectieuse chez le chien. Il n’existe également pas de méthode alternative pour déterminer la tolérance locale et/ou l’efficacité pharmacologique d’un produit testé dans ce type de pathologie. Ceprendant, un certain nombre d’études in vitro peuvent être déroulées avant la mise en place du modèle : - Des études de microbiologie permettront d’évaluer la pathogénicité des germes utilisés lors du modèle et de sélectionner des souches adaptées au modèle. - Des études de toxicité des molécules et produits testés permettront d’écarter les produits toxiques ou mal tolérés.

Réduction

Dans le plan d’étude, le nombre d’animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié de manière à optimiser l’utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s’assurant que ce nombre d’animaux permette d’atteindre l’objectif de l’étude, c'est-à-dire que les résultats de l’étude permettent de prendre une décision sur l’induction de l’otite et/ou l’efficacité du produit ou des produits évalués. Il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Le modèle sera induit dans une oreille par chien et aucune intervention ne sera réalisée sur la 2ème oreille qui servira de témoin sain. L’unité statistique d’évaluation des résultats est selon les cas, l’animal ou l’oreille.

Raffinement

La mise au point des modèles otite et les études de tolérance et d’efficacité pharmacologiques ne requièrent qu’une contention légère des animaux pour l’induction de la pathologie et/ou l’administration des produits et pour les éventuels prélèvements (ex. sang, microbiologiques …). Les volumes sanguins prélevés et les temps de récupération des animaux seront déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être animal ne sera pas altéré. Depuis leur inclusion dans l’étude jusqu’à la dernière observation, les animaux sont observés au moins 2 fois par jour par le personnel dédié aux soins des animaux. Des observations plus fréquentes sont prévues, particulièrement après l’induction de la pathologie et/ou l’administration des produits, pour s’assurer qu’aucune réaction non attendue n’est observée. Le suivi du comportement des animaux par le personnel dédié aux soins des animaux peut être doublé le cas échéant par une surveillance vidéo en continu. Toute observation d’un état de santé ou d’un comportement anormal d’un animal fait l’objet d’un examen par un vétérinaire qui proposera les mesures adéquates pour protéger l’animal en lui administrant un traitement si nécessaire.

Choix des espèces

Les produits vétérinaires doivent obligatoirement être testés dans l’espèce de destination. Les modèles expérimentaux qui permettent d’évaluer les produits vétérinaires doivent être développés dans la même espèce pour plus de pertinence. L’espèce canine a été retenue comme correspondant à l’application clinique future des produits visant à traiter les otites externes infectieuses et non infectieuses. Selon les objectifs de l’étude, les modèles seront à mettre en place chez des chiens sains jeunes adultes de plus de 1 an.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la myopathie de Duchenne, elles reçoivent des injections répétées de lymphocytes T génétiquement modifiés, des prélèvements sanguins, des échocardiographies sous anesthésie et une mesure de force par stimulation du nerf sciatique, avant la mise à mort pour prélever le cœur et les muscles. Le porteur décrit un affaiblissement musculaire et une baisse modérée de la fonction cardiaque liés au modèle lui-même. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés à une utilisation future, et le porteur revendique la souris comme une source "unique et indispensable" faute de système in vitro reproduisant la maladie.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie neuromusculaire grave. Elle est causée par des mutations du gène de la dystrophine qui assure la stabilité structurelle des muscles squelettiques et cardiaque. Chez les patients DMD, les fibres musculaires sont progressivement endommagées et remplacées par du tissu fibreux et adipeux. La présence d’une quantité importante de tissus fibreux (fibrose) dans le muscle des patients est l’une des causes communes aux échecs des thérapies géniques et cellulaires en développement. Pour cette raison, il est cliniquement pertinent de réduire la quantité de tissus fibreux comme une nouvelle piste dans la prise en charge de la DMD. L’une de ces pistes consiste à cibler et dégrader une protéine présente en grande quantité au niveau des tissus fibreux et ceci à l’aide de lymphocytes T génétiquement modifiés ou de nanoparticules lipidiques permettant de cibler spécifiquement cette protéine. Une étude de preuve de concept que ces stratégies étaient capables de limiter la fibrose cardiaque dans un modèle murin de cardiopathie a été préalablement réalisée. Cette pathologie diffère toutefois de la DMD, il est donc important d’établir si les conclusions initiales positives sont extrapolables à la DMD. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer les effets thérapeutiques de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des modèles murins de DMD. A l’issue de ces expériences, nous pourrons déterminer si cette thérapie est efficace pour réduire la fibrose musculaire et cardiaque induite par la DMD.

Bénéfices attendus

La mise en évidence d'une réduction de la fibrose et d'une amélioration de la fonction cardiaque et musculaire par une approche d'immunothérapie basés sur l’administration de lymphocytes-T spécifiques dans des modèles murins de la dystrophie de Duchenne constitue un préalable important pour une utilisation future et sûre chez l’homme. L’objectif de ce projet est de développer un médicament biologique susceptible d’améliorer le pronostic de la dystrophie de Duchenne à travers une réduction de la fibrose et l'amélioration des fonctions cardiaques et musculaires dont souffrent les patients. Ce projet permet également d’ouvrir la piste d'une utilisation des approches d'immunothérapie dans le contexte des maladies génétiques rares et ceci en combinaison avec une thérapie génique à visée curative.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1- Injection intra-péritonéale en solution saline (150 microlitres, réalisée en quelques secondes) -2 Injections intra-veineuse caudale espacées d'une semaine (solution isotonique saline contenant ou pas des lymphocytes) réalisés sous anesthésie avec un volume de 150 microlitres, avec une durée d'environ 5 minutes - 3 Prélèvements sanguins (une goutte, environ 50microlitre) espacés d'une semaine pour les deux premiers et 3 mois plus tard pour le dernier avec une durée d'une minute -Echocardiographie réalisé sous anethésie (fréquence 3, durée 20 minutes). -Test de préhension (Fréquence 5; Durée 2 minutes) qui consiste à mesurer la capacité de la souris à s'agripper sur une grille et de ce fait nécessite que l'animal soit éveillé. Cet examen n'est pas invasif et ne provoque donc aucune douleur chez l’animal. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal. -Mesure de la force musculaire suite à une stimulation du nerf sciatique réalisée sous anesthésie générale et analgésie (Fréquence 1; durée 15 minutes). A l'issue de ce test la procédure sera achevée pour procéder à l’analyse histologique des tissus afin de récolter les données. Ainsi, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et si nécessaire analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci à l’exception du test de préhension et du prélèvement sanguin. Une grille d’évaluation des points limites sera établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint les points limites seront sortis de protocole précocement.

Impact sur les animaux

Ici, les souches de souris étudiées ont été choisies pour mimer la pathologie humaine. Les effets indésirables consistent en l'affaiblissement musculaire et une réduction modérée de la fonction cardiaque. La contention pour l'injection intra-péritonéale et le prélèvement sanguin pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne. Le prélèvement de sang (une goutte) peut occasionner un léger stress chez l'animal, ce niveau de stress est équivalent à l'effet d'une piqure. Le test de préhension n’occasionne pas de souffrance chez l’animal.

Devenir

A l'issue de cette procédure, l'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et receuillir ainsi les donnés indispensables pour évaluer l'efficacité de l'approche thérapeutique mise en place.

Remplacement

En amont de l’administration de cette thérapie dans le modèle murin, une évaluation de la fonctionnalité des CAR-T cells est mise en place in vitro via des tests cytotoxiques sur des modèles cellulaires musculaire et cardiaque. Ainsi, ne sont administrés aux animaux que des traitements ayant fait la preuve de leur fonctionnalité in vitro. Cependant, les modèles murins restent une source unique et indispensable pour évaluer une amélioration histologique et fonctionnelle induite par le traitement testé. De plus, ces modèles nous permettront d’obtenir des informations sur le profil de sécurité de ce traitement grâce à la détection d’un potentiel syndrome de relargage des cytokines, effet indésirable communément observé en clinique humaine.

Réduction

Nous allons dans un premier temps vérifier grâce à des coupes histologiques issues de travaux précédents la présence des protéine d’intérêt chez des animaux d’âge et sexe différents. Le but est de sélectionner le moment optimal de l’administration de CAR-T cells pour observer un effet thérapeutique. Lors du passage à la phase in vivo, les mêmes animaux sont utilisés pour les évaluations fonctionnelles, les tests de contraction musculaire ainsi que les études d’histologie et de transcriptomique à la suite de la mise à mort. Les procédures expérimentales sont donc conçues pour réduire le nombre d’animaux utilisés au maximum, sans compromettre la puissance statistique de l’étude. Les calculs d’effectifs, assurés par une statisticienne, se fondent sur les données de la littérature et l’expérience déjà acquise par l’équipe. Ce nombre devrait permettre de valider le concept et tient compte de l’exclusion du protocole de certains animaux (due à l’atteinte de points limites ou de décès prématuré). Toutes les interventions sur les souris seront réalisées dans des conditions de reproductibilité maximale afin de minimiser la variabilité et donc le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de souris utilisé sera de 300 souris. L’effectif de 25 souris par groupe a été établi grâce à un calcul de puissance. Suite à l'analyse des données, des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures, à l’exception des mesures de la force musculaire (test de préhension) l'injection intra-péritonéale et le prélèvement d'une goutte de sang, seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Nous avons opté pour l'injection intraveineuse de CAR-T cells étant donné qu’elle est simple et non invasive. L'injection sera réalisée sous anésthésie et avec l'utilisation d'une source de chaleur pour dialter la veine ce qui facilitera l'injection. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, les prélèvements sanguins correspondant en terme de douleur et stress à une piqure seront réalisés sans anethésie. Des antalgiques sont prévus pour la mesure de la force musculaire qui intervient en étape finale. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité . Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser des modèles murins car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la DMD. Nous utiliserons ici un modèle préclinique pertinent de la Dystrophie de Duchenne. Ces modèles développent une fibrose du myocarde et des muscles squelettiques, ainsi qu'une altération fonctionnelle et récapitule ainsi la chronologie de la progression et les altérations observées chez les patients. Les contrôles seront des souris contrôle saines avec le même fond génétique. Ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application potentielle chez l’homme de ces approches thérapeutiques. La souris constituant le modèle sera étudiée entre 3 mois à 6 mois d'âge car à partir de 3 mois, les souris sont considérées comme ayant accompli leurs croissances musculaires et cardiaques. Il est aussi prouvé dans la littérature que la fibrose se met en place dans ces modèles à partir de 5 mois. Cette fourchette sera affinée en fonction de l’analyse histologique en cours de coupes issues d’études antérieures.