Recherche appliquée

568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéficientes, elles sont irradiées, reçoivent des greffes de cellules souches et de cellules leucémiques humaines, puis des injections, des prélèvements sanguins et un prélèvement de moelle osseuse, l'envahissement leucémique pouvant provoquer un amaigrissement. Le projet, mené avec une entreprise de biotechnologies, teste une thérapie cellulaire dérivée des CAR-T contre les leucémies. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne produit des lymphocytes T humains matures et que seule la xénotransplantation le permet.

Objectifs

Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T modifiés génétiquement dans le but de reconnaître puis éliminer les cellules cancéreuses. Elles sont la base d’une toute nouvelle approche de traitement contre le cancer, consistant à prélever des cellules immunitaires d’un patient ou d’un donneur sain (ici, les lymphocytes T), pour les modifier génétiquement et les réinjecter chez le patient. Cette nouvelle approche est un espoir dans le traitement des cancers. Des obstacles d'efficacité, de longévité et de spécificité des lymphocytes T génétiquement modifiés restent à résoudre dans cette thérapie et malgré un taux important de réponse complète aux traitements après thérapie, la rechute de la maladie reste un défi. La perte précoce des cellules liée à leur demi-vie courte et une inefficacité est une des raisons qui expliquent les échecs de cette thérapie. Notre stratégie est une approche cellulaire par l'utilisation de cellules progénitrices de lymphocytes T exprimant un récepteur CAR, génétiquement modifiées appelées ci-après (CAR-ProTcells) qui pourrait contourner certains des obstacles rencontrés. L'utilisation de la thérapie CAR-ProTcells permettrait d’accélérer la reconstitution du thymus, lieu de production des lymphocytes T, du patient, et améliorerait l'efficacité et la durabilité du traitement. Le projet sera mené en collaboration avec une entreprise de biotechnologies qui a mis en place un procédé de production de progéniteurs T et montré son efficacité à produire un compartiment de lymphocytes T matures, importantes. Des études préliminaires ont également mis en lumière une nouvelle génération de produits d’immuno-oncologie cellulaire pour lutter efficacement contre les cancers. Ces produits cellulaires pourraient limiter les effets néfastes secondaires récurrents, par exemple la production massive de cytokines inflammatoire, de la stratégie des lymphocyte T génétiquement modifiés. Notre projet propose de mener des études précliniques dans un modèle rongeur, afin de démontrer le potentiel et l’efficacité de la stratégie CAR-ProTcells comme thérapie pour l’éradication de leucémies.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des progéniteurs de lymphocytes T génétiquement modifiés, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique chez l'humain. L’acquisition de nos données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. La stratégie de CAR-ProT cells pourrait offrir des réponses antitumorales durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs d'efficacité, de longévité et de spécificité des CART reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.

Procédures

Irradiation : Les animaux receveurs des greffes de CSH et cellules Pro-CAR T cells. La procédure d’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles.) Injection intraveineuse rétro-orbitale des cellules 1 fois, sous anesthésie. L’injection durera 1 minute / animal après anesthésie. Injection sous cutanée, 1fois par semaine, animaux vigiles. durée 1 minute/ animal. Injection intraveineuse (queue) des cellules tumorales 1fois. L’injection durera 1 minute par animal vigile. Les souris subiront des prélèvements sanguins (au maximum 3 sur une période de 2 à 3 mois) en cours d'expérience sous anesthésie. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes par animal. Imagerie Bioluminescence sur animaux anesthésiés maximum 1 foi par semaine (dure 10 min/souris) Un prélèvement de moelle osseuse, sous anesthésie générale, avec un traitement anti-douleur avant et après l'intervention (dure environs 3 minutes)

Impact sur les animaux

L’introduction des cellules leucémiques humaines peut occasionner chez l'animal des troubles de type amaigrissement du fait de l'envahissement leucémique prononcé qui joue sur l'appétit des animaux. La durée de nos expériences ne dépassera pas 6 mois pour éviter ces effets indésirables. Nos expériences préparatoires vont anticiper ces possibles troubles en définissant la période précédant leur apparition, qui sera celle choisie pour injecter les CAR-T ou CAR-ProT cells qui devraient agir comme une thérapie. Un prélèvement de moelle osseuse sera réalisé (uniquement sur les groupes ayant reçu les cellules leucémiques du patient) qui pourrait provoquer également de la douleur.

Devenir

L'obtention des résultats requiert que tous les animaux soient euthanasiés en fin d'expériences afin de pouvoir analyser le contenu cellulaire normal et leucémique des organes des souris et donc de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long processus expérimental de mises au point et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique des CAR-ProT cells avant un développement clinique chez l'humain. Des études in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser les conditions de préparation et améliorer le produit de thérapie cellulaire. Néanmoins ces tests sont trop limitants et il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir des cellules T humaines matures et fonctionnelles. Pour l’instant, seule la xénotransplantation de cellules hématopoïétiques humaines à des souris immunodéficientes permet la maturation et la différenciation complète de progéniteurs de lymphocytes humains dans le thymus de ces souris. Nous sommes donc arrivés à un point où nous ne pouvons pas aller plus loin dans le remplacement de l'utilisation d'animaux par un modèle in vitro.

Réduction

Chaque expérience sera répétée 2 fois, afin d’accumuler les datas dans 10 à 12 animaux au total. Nous avons auparavant et au sein d’autres projets acquis des connaissances sur le modèle tumoral de cellules hématopoïétiques. Ce modèle est reproductible et la tumeur peut être éliminée par un traitement classique CAR-T. Selon nos expériences précédentes et les données de la littérature utilisant ce type de modèle, nous avons postulé que si nous accumulons des données sur 10 à 12 souris au total nous devons pouvoir observer une différence significative entre les groupes non-traités et traités par l’approche CAR-ProTcell (diminution de tumeur dans le groupe traité versus groupe non traité). Pour obtenir ces résultats sur le nombre d’animaux déposés, nous allons effectuer 2 expériences indépendantes contenant 5 à 6 souris par groupe.

Raffinement

Les animaux seront suivis très régulièrement pour mesurer l'impact des manipulations sur leur état de santé. L’état de santé sera évalué à l’aide d’une grille de score définie par la structure chargée du bien-être animal au sein de l’organisme. Cette grille permet de réagir rapidement, pour décider de la mise en place de traitements palliatifs ou d’une euthanasie Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telles que les prélèvements sanguins ou les injections de cellules seront réalisées sous anesthésie et analgésie

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes. Ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, normales ou pathologiques, et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Ce modèle est couramment utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris immunodéficientes adultes, qui joue un rôle majeur dans la maturation des lymphocytes T, ressemble à celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un composé par voie orale ou intraveineuse, puis jusqu'à trois prélèvements sanguins, pour étudier le devenir de molécules dans l'organisme. Le projet relève de l'évaluation préclinique d'inhibiteurs de kinases, la sélection des meilleures molécules étant située à "plus long terme". Le porteur affirme que les tests in vitro "ne constituent pas des méthodes alternatives" et que le recours au modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine: maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie, dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacocinétique. L’étude de la pharmacocinétique in vivo d’un nouveau composé permet d’affiner la compréhension et l’analyse du devenir du composé dans l’organisme afin de mieux caractériser son mode d’action et appréhender de potentiels effets indésirables. L'objectif du projet est d'étudier l'effet du système biologique d'un organisme entier sur le devenir d'un composé test au cours du temps suivant son administration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer les propriétés pharmacocinétiques de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées dans le but de déterminer leur capacité à atteindre leur cible in vivo. Cela permettra d’optimiser leur posologie (dose et fréquence d’administration) pour l’évaluation de leur toxicité d’une part et de leur activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines d’autre part. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer un composé test une fois par voie orale (quelques secondes) ou intraveineuse (inférieur à 1 minute). Des prélèvements de sang seront réalisés à différents temps après le traitement n’excédant pas 3 prélèvements par animal (durée du prélèvement inférieure à 1 minute).

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. Les animaux se verront administrer le composé test une fois : par voie intraveineuse pour la moitié d’entre eux, et par voie orale pour l’autre moitié. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront faits au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire, 3 fois maximum par animal, répartis sur une durée maximale de 48h.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de sélectionner les meilleures molécules candidates d'une part, et d'autre part d'avoir une première approche de la pharmacocinétique des composés (absorption, métabolisme), mais ils ne peuvent fournir l'ensemble des éléments caractérisant le devenir du composé dans un organisme vivant. Ils ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, il est nécessaire d'avoir au minimum 3 prélèvements par temps pour obtenir des paramètres pharmacocinétiques fiables en tenant compte de la variabilité biologique. Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés nous utiliserons la technique du microsampling : des micro-prélèvements de sang seront réalisés sur un même animal à différents temps de prélèvements réduisant ainsi la variabilité des résultats et le nombre d'animaux nécessaires. Il n'est pas prévu de faire une étude statistique sur ce projet. Les effectifs seront limités à 9 animaux par groupe pour tenir compte de la variabilité biologique (3 animaux par temps de prélèvement) et du nombre de prélèvements répétés possibles (chaque animal sera utilisé pour 3 prélèvements maximum).

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début de la procédure expérimentale. Durant cette période les animaux seront manipulés et habitués à la boite de contention qui sera utilisée pour réaliser les injections intraveineuses. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. Pour les prélèvements de sang, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera utilisée.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant les résultats obtenus serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (dose maximale tolérée et efficacité). Il est donc prévu d’utiliser des souris de même fond génétique que les souches nécessaires et choisies pour la cible thérapeutique considérée. De plus, la souris est un modèle tout à fait pertinent pour les études de pharmacocinétiques en raison de ses similitudes avec les humains dans les processus d'absorption, de métabolisme et d'élimination. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital de l'œil sous anesthésie, puis des prélèvements sanguins au même endroit, avant une mise à mort permettant de prélever leurs organes. Le projet vise à documenter un effet inattendu observé lors d'une étude précédente d'un candidat d'immunothérapie, en vue d'un dossier réglementaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne mime le système immunitaire complet et qu'il est "obligé" de recourir à la souris.

Objectifs

L’équipe s’intéresse au développement de petites molécules exprimées par des vecteurs viraux notamment pour restaurer le système immunitaire dans certaines pathologies. Plusieurs de ces molécules sont déjà en développement clinique mais il est possible que l’expression d’une ou plusieurs de ces molécules via un vecteur pourrait permettre une expression prolongée et/ou une distribution différente dans l’organisme de ces protéines, voire engendrer une activité biologique différente de celle de la forme non vectorisée et ainsi avoir une efficacité accrue. Des études précédentes (dans des modèles murins) ont permis d’obtenir une preuve de concept pour un candidat, administré par voie intraveineuse, basé sur vecteur virale modifié codant pour une protéine agissant sur le système immunitaire majoritairement décrite pour agir sur un certain type de lymphocyte. Lors de ces études, il a été observé un effet non négligeable et inattendu de ce candidat sur un autre type de cellule. Malheureusement, nous n'avons pas pu investiguer en détails les effets du candidat sur ces cellules, ces dernières n'étant pas la cible privilégiée dans notre étude précédente. Par conséquent, nous souhaitons réaliser une nouvelle étude préclinique ayant pour objectif l'étude de l'impact de ce candidat sur ce type cellulaire dans des souris naïves. Ces résultats permettront de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) d’action de notre candidat, dans le but d’étoffer les dossiers règlementaires nécessaires pour initier un développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements pour traiter l’immunosuppression en restaurant le système immunitaire des patients et ainsi prévenir les infections secondaires pouvant leur être fatales. Précédemment, nous avons montré la pertinence de vectoriser une protéine particulière sur sa capacité à booster le système immunitaire de souris saines. Néanmoins, lors de cette évaluation, nous avons observé un effet inattendu sur un type particulier de cellule, qui n’a pas pu être pleinement étudié, les tests d’analyse étant focalisé sur la réponse cellulaire T. L’objectif à court terme de ce projet de recherche est donc de confirmer et de documenter plus en profondeur l’effet biologique observé sur ces cellules cibles. Ces résultats permettront de mieux appréhender le mécanisme d’action du produit ce qui peut être critique pour la suite du développement du produit en phase clinique. En effet, mieux connaître le mécanisme d’action d’un produit d’immunothérapie permettrait de mieux cibler les patients pour lesquels le produit pourrait être testé.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Injections des produits en intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie locale suivie d’une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sur tous les animaux : (1 fois/souris et 2 à 3 min/animaux) - Prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbital sur animaux vigiles après anesthésie locale (1 fois/ souris et 1 à 2 min/souris)

Impact sur les animaux

Aucune toxicité du produit n’est attendue puisque celui-ci a déjà été évalué chez la souris. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment de l’injection des candidats (injection intra veineuse au niveau du sinus rétro-orbital) qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale suivie d’une anesthésie générale mais également lors des prélèvements sanguins à l’œil. La douleur est sont atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.

Devenir

Le but du projet étant d’évaluer l’activité biologique de notre candidat sur différents types cellulaires provenant de différents organes au cours du temps, il est donc nécessaire de mettre à mort tous les animaux inclus dans la procédure.

Remplacement

Les objectifs de ce projet étant d‘évaluer un candidat d’immunothérapie, susceptible de suivre un développement clinique chez l’homme, nous sommes donc contraints de respecter les obligations réglementaires à savoir qu’un produit ne peut pas passer en clinique en se basant uniquement sur des résultats générés in vitro. La caractérisation in vitro de ce candidat a déjà été réalisée. Désormais, nous voulons évaluer au cours du temps les effets de notre candidat sur une population lymphocytaire et ses sous-types dans différents organes dont le pic de la réponse peut différer, ce qui nécessite l’utilisation d’un organisme vivant entier. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro mimant le système immunitaire complet murin et susceptible d’apporter le même niveau d’information pour répondre à ces objectifs. L’utilisation des invertébrés ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré, la souris.

Réduction

Tout au long du projet, nous avons essayé de réduire le nombre de souris sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Ce type d’expérience ayant déjà été réalisé au cours du projet global, nous avons donc pu calculer la taille de l’effet de notre produit sur cette population at ainsi déterminer le nombre de souris nécessaire par groupe pour avoir une puissance statistique adéquat. Vingt souris par groupe seront donc nécessaires pour comparer deux à deux les moyennes des groupes et pour montrer une différence statistique entre les groupes d’intérêt, moins de souris (10 souris/temps) pour le groupe injecté par le tampon de dilution du MVA car les effets biologiques ne varient pas au cours du temps. Dans ce projet, nous prélèverons post mortem la plupart des organes cibles de notre candidat afin de répondre à un maximum de question dans un seul protocole.

Raffinement

Mise en place du raffinement dans la procédure : L’injection intraveineuse au niveau du sinus rétro orbital de notre candidat est réalisée sur animaux anesthésiés, une anesthésie locale par de la tétracaine suivie d'une anesthésie générale gazeuse. Les prélèvements sanguins à l’œil se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. Les points limites ont été définis de manière suffisamment prédictive et précoce pour éviter toute souffrance de l'animal de la naissance à la mort. Tout au long de la procédure nos animaux sont surveillés au moins 5 fois par semaine avec une observation accrue quelques heures après l’injection des produits (entre 4h et 6h post injection) même s’il n’est pas attendu d’effet délétère de ces derniers sur l’état général des animaux. Néanmoins, en cas d’apparition de signes cliniques (pelage ébouriffé, terne), une surveillance accrue avec suivi de la température sera effectuée. En cas de fièvre (température > 39°C), du doliprane sera donné dans l’eau de boisson (0.6mL/mL). Si persistance de la fièvre (> 2 jours) ou de tout autre signe clinique (immobilité, prostration, apathie) pouvant traduire une douleur/détérioration de l’état général, ce sera un critère de point limite et il y aura mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle animal pour étudier la réponse cellulaire car le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant déjà validé l’efficacité de ce candidat chez la souris, il nous semble pertinent de confirmer et d’approfondir les résultats inattendus précédemment observés dans le même modèle. Nous utiliserons des souris avec un système immunitaire mature, c'est à dire des animaux d'au moins sept semaines pour ces études précliniques

20 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale d'environ une heure pour l'implantation de deux prothèses, gardées en place deux, quatre ou treize semaines, avant une mise à mort permettant de prélever les implants et des organes. Le projet évalue un dispositif médical de réparation des hernies, en testant la résorption et la résistance mécanique des prothèses. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" car ces prélèvements ne sont pas réalisables chez l'humain.

Objectifs

Les hernies abdominales et les éventrations restent compliquées à réparer actuellement même pour les chirurgiens les plus expérimentés. La mise au point d’implants abdominaux destinés à améliorer la prise en charge et la réparation de ces plaies est ainsi primordial. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo plusieurs paramètres suite à l’implantation d’un dispositif, dont le taux de résorption du dispositif et la résistance mécanique. L'objectif du projet est l’obtention des dispositifs médicaux d'essai après une durée d’implantation in vivo (2, 4 et 13 semaines respectivement). Ces échantillons sont nécessaires pour permettre, par des analyses ex-vivo ultérieures, une étude du taux de résorption du dispositif et une analyse de la résistance mécanique. Le critère de jugement principal est l’obtention des dispositifs (avec débors) après une période d’implantation de 2, 4 et 13 semaines chez le porc. Les autres objectifs seront : - D’évaluer les effets locaux induits par l'implantation du dispositif médical pendant 2 semaines, 4 semaines et 13 semaines, - La colonisation des tissus du dispositif médical à l’issue de 2 semaines, 4 semaines et 13 semaines d’implantation (examen visuel)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’évaluation in vivo de la colonisation de la prothèse en fonction du temps. De plus, grâce aux échantillons prélevés à l’issue de l’étude, une analyse de la résistance de la prothèse en situation in vivo et l’évaluation microscopique de l’adhésion de la prothèse par examen histologique pourront être réalisés.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie abdominale pour l’implantation des deux prothèses d’essai d’une durée d’1 h environ, sous anesthésie générale. D’éventuels prélèvements sanguins pourront être effectués en cas de besoin pour compléter l’examen clinique vétérinaire, afin de vérifier les paramètres biologiques qui seront le témoin d’une éventuelle inflammation ou infection de prothèse par exemple. Un traitement analgésique pourra être administré en cas de besoin en fonction des suites opératoires et de l’examen clinique. La durée des actes de prélèvement et d’injection est limitée à quelques minutes.

Impact sur les animaux

Des nuisances au niveau de la cicatrice sont attendus avec des risques d’infection, d’ouverture de la cicatrice, gêne à la marche etc qui seront particulièrement surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour le prélèvement des deux prothèses de test et d’éventuels autres prélèvement d’organes, qui ne seraient pas compatibles avec leur réveil.

Remplacement

Toutes les analyses qui ont pu être réalisées in vitro ont été faites. Des données complémentaires sur la résistance nécessitent l’obtention de prélèvements de l’implant intégré et des prélèvements biologiques éventuels, ce qui n’est pas réalisable chez l’Homme. Le modèle animal est donc ici indispensable pour pouvoir effectuer ces tests dans des conditions les plus proches de chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux dans cette étude est limité au minimum nécessaire pour obtenir un nombre suffisant d’échantillons permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et ce, sur 3 temps d’étude optimaux pour les résultats escomptés. Deux prothèses seront implantées par animal, ce qui limite d’autant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une structure agréée pour l’expérimentation animale, dans des conditions maîtrisées (température, ventilation, éclairage). Ils sont suivis quotidiennement et biquotidiennement dans les premiers jours post-opération. Leur environnement est enrichi par la présence de ballons et d’autres objets permettant de maintenir des comportements normaux. Au cours des procédures, les animaux sont anesthésiés et l’anesthésie est suivie et ajustée par un personnel qualifié. Une analgésie post-opératoire sera mise en place au besoin. En post-opératoire et pour la suite de la manipulation, une grille de cotation évaluera différents paramètres pour identifier des signes de mal-être ou de souffrance de l’animal. L’examen clinique comprendra par ailleurs une surveillance de la tension abdominale, de l’état de la plaie (infection, tenue des sutures) et de la température de l’animal. Si ces signes venaient à apparaître, une analgésie post-opératoire serait mise en place avec un suivi renforcé, conformément à la grille de score et suite à l’examen clinique vétérinaire. Si cette gestion venait à être insuffisante ou inefficace, ou si une complication ne pouvait être gérée, la manipulation sera arrêtée, et l’animal serait mis à mort pour éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

Le modèle porc est le modèle utilisé car il est particulièrement adapté à l’implantation sur des durées longues. De par son anatomie proche de l’homme, le modèle porc se prête à l’implantation preperitonéale (rétromusculaire ou intrapéritonéale) de dispositifs de tailles suffisantes afin de permettre des observations histologiques et mécaniques. Enfin, le modèle porc est un modèle usuellement choisi sur ce type de dispositifs de renforts de paroi de sorte que les résultats obtenus permettront une comparaison des résultats. Les animaux utilisés sont des jeunes de 2 à 4 mois (25-30 kg) car la taille des animaux est compatible avec celle des prothèses implantées.

3 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie, puis l'administration de composés pendant 56 jours maximum, une à deux fois par jour, avec des prélèvements sanguins répétés et une ponction intracardiaque terminale. Le projet vise à confirmer l'activité antitumorale d'inhibiteurs de kinases avant un éventuel passage en clinique, les bénéfices pour les patients étant renvoyés au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" pour obtenir des résultats transposables à l'humain.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine, notamment les cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situe dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Pour chaque composé test les études sur les modèles de cellules en culture, la pharmacocinétique et l’évaluation de la dose maximale tolérée in vivo auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacologique in vivo. Les composés testés dans ce projet auront été préalablement sélectionnés pour leurs propriétés anti-tumorales vis-à-vis de certains types de tumeurs dans des tests cellulaires adaptés et pertinents. L’objectif du projet est donc de confirmer l’efficacité anti-tumorale attendue in vivo sur des modèles murins porteurs de tumeurs pertinents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer l’activité anti-tumorale de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées sur des modèles vivo bien caractérisés et pertinents. Ces données, en association avec celles obtenues in vitro et in vivo au préalable permettront de poursuivre (ou stopper) le développement du médicament vers les phases d’essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour améliorer la prise en charge des patients dans le traitement de différents cancers.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale, puis une incision sur le dos sera réalisée suivie d’une injection de cellules dans le tissus sous cutané. L’évolution pondérale des animaux et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine en même temps, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Les animaux se verront administrer des composés pendant 56 jours maximum, 1 à 2 fois par jour maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront réalisés au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire dans le respect des volumes maximaux réglementaires. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’implantation de cellules tumorales aux animaux peut générer une perte de poids transitoire. De même l'effet indésirable attendu suite à l'administration des molécules et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. L’implantation sous cutanée de cellules tumorales peut entrainer un inconfort transitoire au niveau du site d’incision cutané et du site d’injection. Enfin, l'injection d'un composé test ou d'un anesthésique ou la piqure d'une aiguille pour un prélèvement peuvent générer un inconfort transitoire au niveau du site d'injection/piqure.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de ne retenir que les meilleures molécules candidates et d'avoir une première estimation de leur efficacité in vitro sur un panel de lignées cellulaires tumorales humaines, mais ils ne permettent pas de prédire leur efficacité face à la complexité des mécanismes mis en jeu dans un organisme vivant. Les modèles précliniques se doivent de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme, et idéalement les mécanismes prédictifs de résistance. Il convient donc d’utiliser des modèles qui reproduiront la physiopathologie des cancers chez l’homme le plus fidèlement possible. Les souris constituent des organismes-modèles présentant de multiples avantages, notamment liés à leur physiologie proche de l’homme. Le recours à l’utilisation de ce type de modèle animal est donc indispensable afin d’obtenir des résultats transposables chez l’homme.

Réduction

Des études préliminaires in vitro et in vivo ont été réalisées afin de déterminer les propriétés toxicologiques et pharmacologiques des composés testés dans ce projet, ceci permettant de ne tester que les meilleures molécules candidates et d’affiner la dose et la fréquence d’injection aux animaux. Dans le cadre de la thérapie ciblée, les modèles de lignées cellulaires utilisés dans ce projet sont préalablement caractérisés au niveau moléculaire (présence de la cible) afin de s’assurer qu’ils soient pertinents et donc susceptibles de répondre aux thérapies envisagées. En effet la maitrise des modèles permet de cibler uniquement les plus pertinents, de gérer la variabilité attendue, notamment le taux de prise de greffe, et donc de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux greffés pour réaliser une étude d’efficacité pertinente. Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Afin d’éviter un stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, les animaux seront manipulés et habitués aux conditions expérimentales au cours de la période d’acclimatation. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Leur évolution pondérale et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Des limites ont été définies dans le projet pour renforcer le suivi des animaux lorsqu’ils se rapprochent d’un point limite nécessitant une euthanasie, notamment au niveau des pertes de poids. Si un animal devait atteindre l’un de ces points limites il sera euthanasié. Lors de la greffe de tumeurs les animaux recevront un anesthésique et un tranquillisant afin d'éviter un stress ou une douleur. Il en sera de même pour les prélèvements de sang terminaux en fin de phase expérimentale. Pour des prélèvements de sang de faible volume au cours de la phase expérimentale, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera privilégiée car elle offre la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal en s’affranchissant des biais interindividuels et en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques, notamment en oncologie qui constitue le sujet de ce projet. Les modèles implantables ou de greffe dans lesquels des cellules humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), préalablement cultivées in vitro, sont greffés sur des souris immunodéficientes ou immunocompétentes, sont des modèles animaux indispensables et systématiquement utilisés pour la découverte, la caractérisation et le développement de candidats médicaments en oncologie. Il est donc nécessaire d'y avoir recours pour tester l'activité anti-tumorale in vivo des molécules testées dans ce projet. Nous cherchons à nous rapprocher de la physiopathologie cible du composé développé afin de pouvoir transposer nos résultats à l’homme, les animaux doivent donc être adultes au début de la phase de traitement. De plus, nous devons prendre en compte la période de latence nécessaire avant traitement pour avoir des tumeurs bien implantées, et le fait que le taux de prise de greffe diminue avec l’âge chez certaines souris immunodéficientes. Les animaux seront donc implantés au stade de jeunes adultes, soit un âge de 6 à 9 semaines environ.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Huntington, elles subissent une injection intracérébrale par chirurgie stéréotaxique vers deux à trois mois, puis, pour une partie, des tests moteurs que le porteur qualifie de "peu stressants" et des séances d'imagerie sous anesthésie. Les souris sont ensuite tuées pour une analyse complète des tissus. Le porteur affirme que seul un mammifère doté d'un striatum et de comportements complexes permet de valider les cibles thérapeutiques visées.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie génétique héréditaire provoquant la dégénérescence (mort) de neurones ce qui se traduit par l’apparition progressive de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques extrêmement invalidants. Le symptôme le plus visible est la chorée, qui se manifeste par des mouvements brusques, imprévisibles et involontaires qui s’étendent progressivement à tous les muscles. La maladie apparaît généralement à l’âge adulte, entre 30 et 50 ans. Il y a plus de 6000 patients en France. Cette maladie est due à une mutation affectant le gène HTT, codant pour la protéine huntingtine (HTT). Bien que cette protéine soit normalement exprimée dans tout l’organisme, la forme anormale (mutée) de la protéine HTT qui est toxique, affecte plus spécifiquement le striatum, une région du cerveau jouant un rôle central dans le contrôle du mouvement, la mémoire procédurale (mémoire dite « à long terme ») et les mécanismes d’adaptation cognitive (comme la perception ou l’apprentissage). La maladie s’étend ensuite à d’autres structures du cerveau et les patients décèdent environ 15 ans après le début des symptômes. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement permettant de ralentir l’évolution de cette maladie. Une meilleure connaissance des mécanismes de la maladie est nécessaire pour trouver des nouvelles cibles thérapeutiques et développer des traitements adaptés. Selon notre hypothèse de travail, des gènes sélectivement exprimés dans le striatum pourraient être impliqués dans sa vulnérabilité spécifique dans le contexte de la MH. En partant de cette hypothèse, une comparaison des gènes exprimés par le striatum en conditions normales ou en conditions pathologiques nous a permis d’identifier des protéines spécifiques du striatum et dont l’expression est diminuée dans la MH. Nos résultats préliminaires indiquent que certaines d’entre elles ont une fonction protectrice vis-à-vis de l’huntingtine mutée. Ce projet vise à comprendre quels mécanismes moléculaires expliquent ces effets protecteurs, et fait appel pour cela à la lignée de souris transgéniques R6/1, un modèle génétique bien caractérisé de la MH. Cela nous permettra de valider sur les plans comportementaux, anatomopathologiques et biochimiques l’effet neuroprotecteur des protéines que nous avons identifiées.

Bénéfices attendus

La maladie de Huntington est une maladie génétique héréditaire qui entraine des troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques extrêmement invalidants et qui évoluent inéluctablement jusqu’au décès du patient. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette maladie. Il est donc nécessaire de poursuivre des recherches pour identifier des cibles thérapeutiques et développer des nouvelles stratégies de traitements. C’est le but poursuivi par ce projet qui a pour objet de tester trois nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle de souris pertinent et bien caractérisé de la MH. Au-delà du cas spécifique de la MH, ce projet pourrait également permettre l’identification de cibles thérapeutiques d’intérêts pour l’ensemble des maladies neurodégénératives qui impliquent des mécanismes se rapprochant de la MH et pour lesquels les options thérapeutiques sont actuellement très limitées et largement insuffisantes.

Procédures

L’ensemble des animaux seront soumis à une procédure d’injection intracérébrale pratiquée à l’âge adulte (2-3 mois) par chirurgie stéréotaxique. Cet acte chirurgical dure environ 30 minutes, est peu invasif, et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. Ils seront toutefois sous surveillance quotidienne pendant une semaine à la suite de cette chirurgie, période à l’issue de laquelle les agrafes ou fils de suture utilisés pour refermer la plaie seront retirés. Certaines souris (224 animaux) seront soumises à des tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacité motrice de façon longitudinale en 4 sessions de 12 jours, avec 1 à 2 jours de repos entre chaque test. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris. Lors des sessions d’imagerie qui concernent 192 animaux, le crâne des souris sera immobilisé dans un cadre stéréotaxique sous anesthésie gazeuse légère (isoflurane 1-2%) tout au long de l’acquisition des données d’imagerie qui dure de 12 à 45 minutes en fonction du type d’image réalisé.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui pourront entrainer différents types de nuisances ou d’effets indésirables tels que : - Une douleur post-opératoire modérée provoquée par la chirurgie stéréotaxique. - Un stress lié à la contention lors des sessions d’imagerie. - Un stress lié à la manipulation par l’expérimentateur lors des tests comportementaux .

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet fait appel à un modèle de souris transgéniques déjà caractérisé de la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, ce projet ne peut, ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques (moteurs et cognitifs) de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, l’expression des protéines d’intérêt pour le striatum est quasi absente dans les modèles de cultures de cellules striatales. Leur expression est détectée principalement dans le cerveau « adulte », totalement « différencié » (ayant subi toutes les étapes du développement) et requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation du cerveau. Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe doté d’un striatum et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre de valider des nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques d’intérêts pour la MH.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 672 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum (comprenant des groupes témoins de référence) a été déterminé en fonction des expériences à réaliser et des différents groupes expérimentaux requis pour pouvoir répondre à notre question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les groupes inclus dans les différentes procédures puissent être étudiés sur différents paramètres. Par exemple les animaux inclus dans la procédure 1 permettront de déterminer l’effet des cibles étudiées sur des critères comportementaux et histopathologiques, et ceux inclus dans la procédure 3 permettront une caractérisation par imagerie in vivo, qui sera corrélée à une analyse histologique.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières permettant d’évaluer l’état de santé des animaux, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.

Choix des espèces

La région la plus touchée du cerveau des patients atteints de la maladie de Huntington est le striatum. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones striataux dans leur environnement cérébral complexe. Ces souris expriment la partie du gène qui porte la mutation, mimant ainsi le défaut génétique observé chez les patients atteints par la maladie de Huntington. Elles présentent aussi des altérations motrices et cognitives et des altérations cellulaires caractéristiques de la maladie de Huntington. La maladie de Huntington est une maladie qui se déclare chez l’adulte mais qui présente des déficits subtils dès le début du développement du cerveau et qui s’aggravent avec le temps. Ce projet vise à valider des cibles thérapeutiques susceptibles d’avoir un effet neuroprotecteur dans la maladie. Pour cette raison les animaux seront traités avant l’apparition des symptômes (2 mois) et les effets sur la pathologie seront étudiés à des stades précoces (jusqu’à 5 mois).