Recherche appliquée

4 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses sous la peau du dos, puis des chimiothérapies par voie intra-péritonéale et des molécules par gavage pendant quatre semaines, avec des effets attendus de fatigue, diarrhées, troubles cognitifs et perte de poids. Les souris sont tuées après un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de certains lipides dans la résistance des tumeurs aux traitements. Le porteur affirme que des études précliniques sur animaux sont "incontournables" pour saisir la pharmacocinétique des molécules.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, des échecs thérapeutiques persistent à cause de mécanismes de résistance des tumeurs aux traitements en partie dû à une production accrue de lipides qui constituent la matière grasse du vivant. Dans le cadre des cancers colorectaux (CCR), les travaux de notre équipe ont montré que la résistance des cellules coliques aux traitements des CCR est associée à une augmentation de la quantité de gouttelettes lipidiques (GL), réservoirs de lipides régulant les besoins énergétiques de la cellule, ainsi qu’à la surexpression de l’enzyme lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), impliquée dans la production de la phosphatidylcholine (PC). La PC est un lipide majeur des membranes cellulaires, séparant l’intérieur des cellules de leur environnement extérieur. Ainsi, l’utilisation de molécules capables de réduire et/ou moduler les taux de PC et GL semble être une approche prometteuse afin de restaurer une sensibilité des cellules résistantes aux agents anticancéreux. La 1ère partie de ce projet s’attachera donc à confirmer chez la souris la capacité de 4 composés candidats à agir comme modulateurs de la production de PC et des GL et sensibiliser les cellules tumorales coliques aux chimiothérapies utilisées en clinique. Nous utiliserons des modèles de souris greffés par des cellules coliques murines surexprimant ou non LPCAT2 et des souris dépourvues de système immunitaire greffées par des cellules coliques humaines résistantes et sensibles aux traitements. La 2ème partie de ce projet concerne l’étude d’autres lipides que sont les cardiolipines (CL), dans la progression et résistance aux chimiothérapies. Les résultats de l’équipe ont montré que des cellules du cancer du col de l’utérus résistantes à un agent anticancéreux, l’Aplidine®, présentent des teneurs en CL supérieures à celles des cellules sensibles. De plus, ces altérations sont associées à une modulation de la composition des CL, corrélée à une altération des enzymes de production dont la cardiolipin synthase 1 (CRLS1) et la tafazzin (TAZ), contribuant à diminuer la sensibilité des cellules à la mort cellulaire induite par l’Aplidine®. Ainsi, il s’agira de confirmer l’implication des enzymes de production des CL dans la résistance à l’Aplidine®. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéficientes greffés par 2 modèles cellulaires humains de cancer du col de l’utérus, des cellules sensibles et résistantes génétiquement modifiées pour CRLS1 et TAZ.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet de recherche devrait permettre d’approfondir les relations existantes entre les altérations des voies de biosynthèse des lipides complexes, en particulier, celles de la phosphatidylcholine (PC) et les phénotypes de résistance des cancers colorectaux (CCR). Ce projet viendrait également soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à augmenter l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques notamment grâce à l’identification de nouvelles molécules bioactives/d’origine naturelles ou de formulations capables de cibler/d’inhiber la production de PC des tumeurs coliques et d’agir en synergie avec les chimiothérapies conventionnelles, réduisant la toxicité et les effets secondaires de ces dernières. Ainsi, ces travaux conforteraient l’utilisation potentielle en clinique de certaines de ces molécules en complément des traitements conventionnels des CCR. De plus, cette étude devrait mettre en exergue le potentiel de l’analyse des teneurs plasmatique en PC en tant que nouveau biomarqueur pronostique non invasif des CCR. La seconde partie de ce projet viendra renforcer les quelques données de la littérature suggérant qu’une dérégulation de la quantité et de la qualité (composition) des cardiolipines (CL) pourrait influencer la sensibilité des cellules tumorales aux drogues de chimiothérapie. Par ailleurs, à ce jour, la contribution d’une production exacerbée des CL via l’enzyme cardiolipin synthase 1 (CRLS1) dans la résistance tumorale a été montré uniquement dans un contexte de carcinome hépatocellulaire résistant à la radiothérapie. De plus, ce projet permettrait, à plus long terme, d’étendre ces observations à d’autres agents chimiothérapeutiques, ainsi qu’à d’autres types de cancers tels que le cancer colorectal, un cancer récidivant et agressif, ce qui permettrait d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de contrecarrer les mécanismes de résistance.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur le bas du dos à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A partir de ce moment-là, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Les traitements par 2 chimiothérapies et 4 molécules naturelles/chimiques seront administrés respectivement par voie intra-péritonéale (ip) à raison d’1 à 5 fois par semaine pendant 1-3 semaines , et par voie orale (gavage) quotidiennement pendant 4 semaines, et à raison de 1 à 3 concentrations par molécule. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Sur une partie des animaux sera réalisé un prélèvement sanguin par ponction intra-cardiaque sous anesthésie préalable. Ce prélèvement se réalise en 20 secondes environ pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Bien que la croissance et la masse tumorale puissent entrainer une potentielle gêne pour l’animal au cours du temps, la gêne au mouvement pouvant contribuer à une diminution de la mobilité dans la cage devrait être minime compte tenu de notre choix de localiser la greffe de cellules cancéreuses sur la région dorsale de l’animal. Des effets secondaires associées au traitement chimiothérapeutique pourront être observés tels que des signes de fatigue, des diarrhées, des troubles cognitifs et une perte de poids. Afin de prévenir ou diminuer toutes nuisances qui pourraient survenir suite à la répétition des injections en intrapéritonéal (inconfort lié au volume et à la température des solutions injectés, risque de contamination qui peut causer une infection et irritation au site de l’injection), nous veillerons à respecter les règles décrites dans la partie Raffinement (5.10.3).

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés. Pour les expériences de mise au point des doses de traitement, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, même si des régressions tumorales pourront être observées en fonction des traitements, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite le sacrifice de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter. Concernant les expériences avec la dose adéquate de traitement, des analyses des teneurs et composition en lipides plasmatiques seront réalisées à partir du sang des souris. De ce fait, les souris seront mises à mort après prélèvement sanguin.

Remplacement

Les travaux réalisés jusqu’à présent sur différents modèles cellulaires ont pu montrer d’une part, que des molécules d’origine chimique ou naturelle sont capables de chimiosensibiliser les cellules résistantes aux chimiothérapies conventionnelles au travers l’inhibition du métabolisme lipidique, en particulier celui de la phosphatidylcholine (PC), et d’autre part, que des lipides complexes tels que les cardiolipines (CL) peuvent constituer des cibles thérapeutiques prometteuses pour contrecarrer les mécanismes de résistance. Des études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier les effets indésirables potentiels des traitements utilisés ou non en combinaison, mais également de considérer l’aspect pharmacocinétique et pharmacodynamique des molécules incluant le processus de transformation de ces molécules par l’organisme (pouvant conduire à une augmentation de leur efficacité ou bien une perte de leur efficacité). En outre, l’utilisation de souris immunocompétentes et au système immunitaire déficient, permettra d’évaluer si le système immunitaire joue un rôle clé dans le processus de chimiosensibilisation des molécules.

Réduction

Les différents modèles cellulaires utilisés au cours de ce projet chez des souris présentant un système immunitaire déficient ou non est parfaitement maitrisée au sein de notre équipe, évitant ainsi de réaliser des étapes de mise au point de greffes de cellules tumorales et réduisant le nombre d’animaux. Pour chacune des expériences, nous utiliserons des groupes de 10 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à la réalisation de tests statistiques.

Raffinement

Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées, mesures de tumeurs…). Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront euthanasiées selon la méthode choisie. Les souris seront hébergées en groupe pour favoriser les contacts sociaux, avec un enrichissement du milieu approprié. Un contenant sera placé dans chaque cage leur permettant de se cacher et de développer leur répertoire comportemental. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Étant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité de nos molécules d'intérêt en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Par ailleurs, les études antérieures pré-cliniques de notre équipe ont été réalisées chez la souris, dont les résultats ont pu être transposés chez des patients. L’injection de cellules cancéreuses humaines nécessite l’utilisation d’animaux NSG qui sont des modèles génétiquement modifiés présentant un système immunitaire déficient. Les souris d’espèces BALB/c (immunocompétente) seront également utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions physiologiques en présence d’un système immunitaire compétent. De plus, le modèle cellulaire de cancer du côlon murin CT26 que nous utilisons présente le même fond génétique que la souris d’espèce BALB/c. Nous utiliserons des souris âgées de 8- 12 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie et réutilisés. Chaque animal subit sous anesthésie une injection sous-cutanée, seize prélèvements sanguins sur cinq semaines et deux biopsies de peau, pour comparer une nouvelle formulation d'un médicament anticancéreux à un traitement de référence. Le porteur mentionne des hématomes et une inflammation possible au site d'injection. Il présente le motif du projet comme économique, proposer aux hôpitaux une alternative "à moindre coût", et affirme qu'aucun modèle autre que le primate ne convient.

Objectifs

Le cancer du sein est une maladie qui touche de nombreuses femmes, une sur huit sera confrontée à cette maladie au cours de sa vie. Seules 20 à 30 % des cas, peuvent bénéficier d’un traitement par un anticorps commercialisé sous le nom d’Herceptin®. Il a transformé la maladie cancéreuse aiguë en maladie chronique pour une majorité de patiente. Actuellement, le schéma thérapeutique consiste en plusieurs perfusions intraveineuses toutes les 3 semaines sur 1 an. Le 2 septembre 2013, une nouvelle voie d’administration, la voie sous-cutanée a été autorisée par la Commission de l’Union européenne pour le traitement de ce type de cancer. Cette nouvelle voie est très prometteuse en termes de confort pour la patiente et de gain de temps pour le personnel hospitalier. Depuis, des médicaments biosimilaires (équivalents des médicaments génériques dans le cas des petites molécules) sont apparus sur le marché. Ces derniers ne sont actuellement disponibles que pour des traitements par voie intraveineuse. Avec l’arrivée des biosimilaires IV, les cliniques/hopitaux sont revenus pour des questions de coûts aux injections IV au détriment de l’utilisation de la forme sous-cutanée d’Herceptin. Dans ce projet, nous proposons de développer une formulation sous-cutanée pour la diffusion progressive de l’anticorps, permettant donc de proposer une alternative à moindre coût pour les cliniques/hôpitaux, mais améliorant grandement le confort des patientes tout en conservant la même efficacité. Dans ce projet, 6 macaques cynomolgus seront utilisés et répartis en deux groupes (anticorps testé versus traitement de référence).

Bénéfices attendus

Si ce projet démontre que l’utilisation de cette nouvelle formulation d’un médicament biosimilaire est équivalente à l’utilisation du médicament de référence, cela permettra aux patientes atteintes d’une forme spécifique de cancer du sein de bénéficier du même confort de traitement (administrations sous-cutanées versus intraveineuses répétées) à un coût beaucoup moindre, donc une meilleure accessibilité du traitement pour les patientes.

Procédures

Les procédures réalisées sur chaque animal (sous anesthésie générale) seront : - 1 injection sous-cutanée - 16 prélèvements sanguins sur 5 semaines (semaine 1 : 10 prélèvements, semaine 2, à 4 : 2 prélèvements/ semaine espacés au moins d’un jour) - 2 biopsies cutanée Chaque intervention durera au maximum 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus seront principalement liés aux injections de l’anesthésique et aux conséquences des prélèvements sanguins répétés (potentiels hématomes aux sites de prélèvement) et d’une biopsie (plaies en cicatrisation). L’injection du traitement pourrait entraîner une possible inflammation au site d’injection.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet. Ils sont examinés par un vétérinaire pour vérifier qu’ils ont recouvré leur état de santé en fin de protocole.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative au model primate non-humain pour cette expérimentation. Les modèles rongeurs utilisés précédemment ont montré la non-toxicité de l’élément d’essai mais ne permettent pas d’injecter un volume suffisant similaire à celui utilisé chez l’Homme et permettant d’étudier la biodégradation du gel. Il en est de même avec les modèles sous-cutanés de peau humain ne permettant pas l’injection d’un volume suffisant pour valider la biodégradation du gel. De plus, les primates non-humains possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés a été réduit à son maximum pour répondre aux questions posées. Compte-tenu de l’apport des études préliminaires réalisées sur le modèle rongeurs, 3 animaux par groupe seront suffisants pour obtenir les données de pharmacocinétique, de biodégradation et évaluer la réponse inflammatoire (au niveau du site d’injection) et au niveau global (dans la circulation sanguine). Ce projet représente une phase préliminaire aux études réglementaires utilisant un effectif plus important.

Raffinement

- Hébergement : les animaux seront hébergés au minimum par paire. Un programme d’enrichissement spécifique à l’éspèce et à l’âge des animaux utilisés est mis en place sur tout le site, et supervisé par le responsable du bien-être animal. Les enrichissements sont structurels (perchoirs, balançoire…), alimentaires (graines pour fourragement, fruits, friandises…) ou consistent en l’apport d’objets de manipulation changés régulièrement. - Procédures : les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention et seront sous couverture analgésique pour les biopsies. - Des points limites ont été définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance des animaux, évaluée grâce à une grille de scoring

Choix des espèces

Dans ce projet, des macaques cynomolgus seront utilisés, car ils possèdent un récepteur de l’anticorps testé similaire à celui de l’humain. Ce projet ne justifie pas d’utilisation d’animaux d’un stade de développement particulier. Néanmoins, les animaux seront âgés de plus de 18 mois (animaux juvéniles ou adultes).

168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour implanter une prothèse de diaphragme, avec des risques de saignement, de difficultés respiratoires, d'infection et de douleur postopératoire. Les rats sont ensuite tués pour analyser l'intégration de la prothèse dans les tissus. Le porteur présente cette étape in vivo comme "indispensable" avant une application clinique et vise le développement puis la commercialisation d'une prothèse pédiatrique.

Objectifs

Dans le cadre d’un projet de recherche, nous développons une prothèse pariétale pédiatrique et plus précisement, un implant diaphragmatique pour répondre à la problématique des récurrences de hernie diaphragmatique congénitale à large défect. Cette pathologie rare et grave du nouveau-né impose une chirurgie dès les premières heures de vie avec mise en place d’une prothèse pour combler le défect dans les formes les plus graves. Aucune prothèse dédiée n’existe à l’heure d’aujourd’hui et la prothèse la plus couramment utilisée est une prothèse en polytetrafluoroéthylène expansé (e-PTFE) qui présente un taux de lâchage de 30 à 50% imposant une reprise chirurgicale et grévant la morbimortalité de cette pathologie déjà lourde. Nous avons pu démontrer les faiblesses de cette prothèse par des précédents travaux ce qui nous a permis de définir le cahier des charges d’une prothèses dédiée et de développer les premiers prototypes de prothèse pédiatrique diaphragmatique. Nos premiers travaux ont permis de caractériser les propriétés mécaniques de cette prothèse, supérieures à la prothèse référente dans cette indication avec une meilleure étirabilité sans rupture. Les tests biologiques in vitro ont permis de prouver sa biocompatibilité, l’absence de toxicité cellulaire et de carcatère proinflammatoire, la qualité de la colonisation cellulaire à sa surface. Ainsi nous avons pu valider in vitro la pertinence de nos travaux et valider nos prototypes d’implant. Nous avons ainsi une réelle ambition d’innovation en biomatériaux. Après avoir validé les étapes in vitro de notre plan de développement, une analyse in vivo sur petit animal est indispensable pour poursuivre nos travaux vers une application clinique.

Bénéfices attendus

Actuellement, de toutes les prothèses existantes sur le marché, aucune n’est dédiée au diaphragme de l’enfant et les propriétés mécaniques et de biocompatibilité des prothèses les plus utilisées ne semblent pas idéales dans cette indication. Ainsi, nous développons des prothèses spécifiquement pensées pour cette indication mais plus globalement, dédié à l’enfant, organisme en croissance. Nos travaux ont débuté par une analyse des prothèses existantes et des échecs (récupération des explants), permettant de définir les caractéristiques de notre prothèse idéale en termes de propriétés mécaniques et biologiques. Nous avons développé différents prototypes pour lesquels nous testons systématiquement in vitro, les caractéristiques mécaniques et les caractéristiques biologiques, permettant peu à peu d’affiner les critéres de synthèse (type de matériau et prcess de synthèse). Une fois cette première phase validée, il est important de pouvoir tester nos prototypes sélectionnés in vivo in situ (implanté en diaphragmatique) avant d’envisager une application clinique. Si ces tests confirment les données in vitro, alors nous pouvons envisager de développer et commercialisé la première prothèse pariétale pédiatrique prenant en considération le phénomène de croissance de l’enfant mais aussi ses spécificités en termes de réponse biologique aux implants. A long terme, en implant diaphragmatique, nous pouvons espérer faire diminuer drastiquement le risque de récidive et donc de réintervention. Nous améliorerons la survie et la qualité de vie des patients atteinds de hernie diaphragmatique large porteur d’implant.

Procédures

Il s’agira de procédures chirurgicales sous anesthésie générale réalisées sur l’abdomen des individus, d’une durée de 30 à 45 minutes environ

Impact sur les animaux

En peropératoire : saignement, difficultés respiratoires, plaie d’organe En postopératoire : douleur postopératoire, infection du site opératoire, infection de paroi, désunion, perte d’appétit en lien avec la douleur ou un sepsis, ileus intestinal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de projet pour analyse histologique des explants et comprendre l’integraiton de notre biomatériau aux tissus hôtes.

Remplacement

Les phases expérimentales in vitro du projet ont été décrites et permettent de valider et sélectionner les prototypes les plus abouties des prothèses diaphragmatiques en terme de biocompatibilité, de qualité de colonisation biologique et de prorpiétés mécaniques permettant ainsi de réduire l’experimentation animale aux prototypes les plus aboutis in vitro. Avant un développement clinique de ces prothèses, il est primordial de pouvoir évaluer la réponse biologique in vivo des prothèses ainsi que leur comportement mécanique en implantation orthotopique. Plusieurs équipes ont travaillé sur les diaphragmes de rongeurs (rats) ce qui valide le choix de cette espèce pour nos travaux à cette phase du projet. En effet, parmis les éspèces possible : la souris ne permet pas la réalisation des procédures du fait de la petite taille du diaphragme et le choix d’animaux vertébrés plus gros ne semble pas non plus justifié et imposerait le sacrifice de trop d’animaux, avec des temps d’étude pour l’analyse de la croissance trop important.

Réduction

Nous avons choisi le nombre d’animaux minimal nécessaiez à l’obtention de résultats fiables et robustes La procédure permet d’évaluer la réponse biologique au terme du délai attendu de 15 jours de cicatrisation de 6 prototypes sélectionnés en prenant comme gold standard le e-PTFE faisant référence actuellement.

Raffinement

En préopératoire, les individus bénéficieront d’un temps d’adaptation en cage de deux au sein de l’animalerie selon les conditions habituelles d’hébergement. En postopératoire immédiat, les animaux sont placés en cage individuelle pour une surveillance de 48H. Au-delà, ils seront à nouveau 2 par cage jusqu’au sacrifice. Ils seront surveillés de façon biquotidienne les 2 premiers jours, une fois par jour ensuite. En cas d’apparition de signe de souffrance (score de bien être anormal), les actions de gestion de douleur et de confort seront associées et la surveillance accrue jusqu’à normalisation ou mise à mort en cas d’atteninte des points critiques. L’environnement des cages est enrichi à l’aide de carrés de cellulose et de frisure pour la construction des nids, de tunnels pour permettre aux animaux de se cacher et ainsi diminuer le niveau de stress. Une nourriture adaptée pour les rongeurs et l’eau de boisson sont données ad libitum.

Choix des espèces

Le choix des rats Wistar s’est fait sur plusieurs critères : - Animal de taille adaptée à une chirurgie du diaphragme, - Potentiel de croissance sur une période d’étude concevable, - Résistance et maniabilité de la race wistar, - Travaux faisant référence sur la même pathologie déjà réalisés sur cette souche.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infestées par gavage avec des œufs du parasite Echinococcus multilocularis, dont le développement d'une masse larvaire dans l'abdomen provoque une prise de poids progressive et des difficultés de locomotion, avant une prise de sang intracardiaque et une autopsie. Le porteur fixe un point limite de poids à 60 grammes et prévoit la mise à mort des souris présentant des troubles locomoteurs trop importants. Sur le remplacement, il se borne à affirmer qu'il n'existe pas de méthode in vitro pour suivre la dissémination du parasite.

Objectifs

Les échinococcoses sont responsables de zoonoses (infections ou maladies pouvant se transmettre directement ou indirectement entre les animaux et les humains) parasitaires dues à un ver plat (Cestode) qui peut infecter l'homme sous son stade larvaire. Deux formes sont décrites en France: l'échinococcose alvéolaire (EA) et l'échinococcose kystique (EK), causées par des espèces d’échinocoques différentes. Cette demande ne concerne que l'échinococcose alvéolaire. L'échinococcose alvéolaire (EA) touche principalement le foie chez les personnes infectées, après une incubation jusqu‘à 15 ans. Trente cinq nouveaux cas humains d'EA sont diagnostiqués en moyenne tous les ans en France. Chez l'homme la maladie est très invalidante et ce diagnostic, en général tardif, est suivi de l'instauration d'un traitement à vie ou d'une exerèse partielle du foie. Dans certains cas, des antigenes parasitaires sont retrouvés dans la circulation sanguine. L’agent causant cette maladie est Echinococcus multilocularis, qui comme tous les Taenidae, boucle son cycle de développement en passant par 2 hôtes : un rongeur (en général le campagnol terrestre) comme hôte intermédiaire qui héberge le stade larvaire et un carnivore (en général le renard) comme hôte définitif porteur du stade adulte (vers) dans ses intestins. L'homme se contamine par ingestion des œufs microscopiques du parasite disséminés dans l’environnement via les fèces des hôtes définitifs. Ce projet vise à infester des souris avec des œufs d’ Echinococcus multilocularis par voie orale. La forme larvaire du parasite obtenue suite aux infections expérimentales servira : => au suivi du développement de la forme larvaire suite a une infestation par la voie naturelle notamment en vue d’une détection précoce et facilitée pouvant attester de la survie du parasite => à suivre la cinétique d’apparition de marqueurs (antigènes et ADN libre circulant) et leurs localisations dans différents organes en complément du développement usuel de lésions hépatiques.

Bénéfices attendus

Ces données récoltées doivent permettre de 1/contribuer à une meilleure compréhension de la dissémination du parasite notamment des échinoccoses secondaires (dissémination depuis la lésion hépatique initiale), 2/compléter les informations sur la détection d’ADN libre circulant pouvant être un marqueur de la survie du parasite chez les patients sous traitement et 3/émettre des hypothèses sur la potentielle manipulation comportementale de l’hôte par le parasite

Procédures

Tous les animaux seront : 1/ anesthésiés à J0 pour gavage avec des oeufs d'échinocoques (durée totale= moins d'une minute). 2/ anesthésiés (le dernier jour de leur suivi) pour subir une prise de sang totale par voie intra-cardiaque, et une autopsie pour collecte d'organes (durée totale = environ 10/15 minutes)

Impact sur les animaux

L'infestation par le parasite entraine une prise de poids progressive des souris en raison du dévelopement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour autopsie puis collecte d'organes/sang.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour le suivi de la dissémination de marqueurs du parasite chez son hôte.

Réduction

Le projet utilisera 50 souris sur 2 ans. Cela se justifie par l’infestation par deux souches parasitaires différentes de 2 fois 5 lots de 5 souris qui seront euthanasiées à 15 jours, 1, 2, 3 et 6 mois post infestation afin de disposer d’une cinétique du developpement parasitaire . De par notre expérience, nous savons qu'environ 3 souris infectées sur 5 développent une forme larvaire au niveau du foie L’effectif a donc été estimé à 25 animaux/an/souche testée, soit 50 souris afin de pouvoir étudier la présence potentielle de marqueurs parasitaires.

Raffinement

Les prises de sang intracardiaques seront réalisées sous anesthésie gazeuse et injectable. Une analgésie sera pratiquée 1 heure avant l'anesthésie. Les souris seront surveillées tous les jours. Une pesée mensuelle permettra de suivre l'atteinte d'un point limite fixé à 60 grammes. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement le campagnol. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour suivre la diffusion de marqueurs dans l’organisme de l’hôte, il est nécessaire d'utiliser un modèle souris. Notre expérience a montré que le stade de développement des animaux n'avait pas d'influence sur la sensibilité au parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris utilisées auront un poids compris entre 10 et 20 grammes.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des antibiotiques par voie intraveineuse, intra-péritonéale ou par gavage, puis un prélèvement de liquide céphalo-rachidien après rasage et incision du crâne sous anesthésie, ainsi qu'un prélèvement de sang, pour étudier la diffusion cérébrale de nouvelles molécules. Sur une partie des souris, une inflammation est déclenchée par injection de LPS. Le porteur affirme que l'usage des animaux est "indispensable", les approches in vitro ne prenant selon lui pas en compte la pharmacocinétique, et fixe la mise à mort à une perte de poids de 20 %.

Objectifs

Les infections bactériennes du système nerveux central (SNC) sont des pathologies graves, avec un taux de mortalité élevé. Le traitement de ces infections repose sur un traitement antibiotique adapté. Cependant, en cas de résistance bactérienne, notamment chez les staphylocoques résistants à la méticilline (SRM), les options thérapeutiques peuvent être limitées. A l’heure actuelle, les molécules recommandées dans les infections du SNC à SRM sont la vancomycine et le linézolide (recommandations de la société américaine de maladie infectieuse 2017). Cependant ces antibiotiques peuvent poser le problème d’une tolérance médiocre (effets indésirables hématologique du linézolide, effets indésirables rénaux de la vancomycine) et de résistances acquises émergentes. La dalbavancine et l'oritavancine, le tédizolide, ou la délafloxacine sont des nouveaux antibiotiques, actifs sur les staphylocoques résistants à la méticilline, qui possèdent des propriétés pharmacocinétiques innovantes (longue demi-vie) ou des profils de tolérances favorables. Cependant, malgré leur potentiel intérêt dans les infections du SNC, il n’existe pas de donnée à l’heure actuelle sur leur diffusion dans le système nerveux central. L’inflammation, qui peut être présente en situation infectieuse a également une influence sur la diffusion au niveau cérébral, de part son impact sur la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il est donc primordial d’étudier la diffusion de ces molécules en conditions saine et inflammatoire. Ainsi, l’objectif de notre travail est d’étudier la diffusion dans le système nerveux central (pharmacocinétique) de ces nouveaux antibiotiques dans un modèle in vivo (en conditions saine et inflammatoire), et d’explorer les différents facteurs pharmacologiques et moléculaires modulant cette diffusion.

Bénéfices attendus

La possibilité d’usage de ces molécules pour lutter contre les infections cérébrales par des germes résistants est un chalenge. Les données de diffusion de ces nouvelles molécules dans le système nerveux central pourront ouvrir les portes à un essai clinique de pharmacocinétique chez l’Homme, préalable nécessaire à l’utilisation en clinique de ces molécules dans le traitement des infections du système nerveux central.

Procédures

Nous administrerons des antibiotiques aux souris, par voie intra-veineuse (IV) en 10 à 15 secondes, intra-péritonéale (IP) en 10 à 15 secondes ou par voie orale en 5 secondes. Dans le cas d’administration IV, l’injection se fera par voie rétro-orbitale en 10 à 15 secondes. Dans le cas de l’administration par voie orale, l’administration sera réalisée par gavage intra-gastrique 1x/j en 5 secondes, soit par administration continue dans l’eau de boisson. Nous réaliserons des prélèvements de sang (200µl) et de Liquide Céphalo-Rachidien (LCR) (5µl) sur ces animaux. Un seul prélèvement de chaque liquide biologique sera réalisé par animal. Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal, le LCR puis le sang seront prélevés. Pour prélever le LCR, le crâne de l'animal, placé sur un tapis chauffant (37°C), est rasé et la peau incisée sur 1cm après injection sur le site de prélèvement en SC de lidocaine 10 min avant l'intervention. Le prélèvement lui-même prend environ 5 min. Puis, le sang sera prélevé dans la veine caudale de l'animal. Pour se faire, l'animal aura au préalable reçu une injection de buprénorphine 30min avant l'acte et ce afin de diminuer la douleur liée à ce prélèvement. L'inflammation systémique est induite par l'administration de LPS (lipopolysaccharide) par voie IP en 10 à 15 secondes. L’administration des antibiotiques aura lieu 2 heures après l’administration de LPS.

Impact sur les animaux

Douleur légère lors de l’injection intraveineuse d’antibiotiques sans effet secondaire. Douleurs légères à modérées suivant l’administration intra-péritonéale de LPS.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés, afin de pouvoir réaliser l’étude histologique et pharmacocinétique au sein des tissus cibles (parenchyme cérébral).

Remplacement

L'utilisation des animaux est indispensable en raison de la complexité des différents acteurs cellulaires et moléculaires qui sont impliqués dans la diffusion du médicament. L'approche in vitro qui permet l'analyse de paramètres définis ne peut pas remplacer l'utilisation des animaux car elle ne prend pas en compte les problèmes de pharmacocinétique du médicament ou des effets physiopathologiques (inflammation). Pour cette étude seront utilisés des souris (Espèce Mus Musculus A1). La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'Homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris C57Bl/6J femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines).

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum. Le nombre de souris (n = 24) par groupe de traitement a été calculé pour avoir un nombre de points pharmacocinétiques minimum (8 points) permettant de réaliser une courbe des concentrations du traitement testé en fonction du temps, dans le plasma et dans le LCR (liquide céphalo-rachidien). Afin d'obtenir un résultat statistique cohérent, un minimum de 3 animaux par point pharmacocinétique est nécessaire (triplicata de chaque point pharmacocinétique). Les analyses statistiques des résultats sont réalisées avec des tests non paramétriques. Le nombre de 264 souris nécessaires au total (10 groupes de traitement + 10% de souris supplémentaires en cas de mortalité) a été calculé au plus juste afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux.

Raffinement

Les prélèvements du LCR (5µl) et sanguin (200µl) se font sous anesthésie par un mélange d'air et d'isofluorane (3% induction et 1,5% maintien). Dans l'ordre et après anesthésies de l'animal : le LCR, puis le sang seront prélevés après injection d'un antalgique général type buprénorphine (SC 0.05 mg/kg) 30 min avant le prélèvement sanguin à la veine caudale et d'une anesthésie locale (SC) type lidocaïne (3mg/kg) 10min avant prélèvement du LCR. L'inflammation systémique est induite par l'administration de LPS (lipopolysaccharide), et les souris seront analgésiées par administration de buprénorpine par voie SC (0,1mg/kg) 30 minutes avant l’injection de LPS. La douleur de l’animal sera suivie toutes les heures suivant l’administration du LPS. Réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse : les animaux sont hébergés à raison de 5 souris par cage de type 2L)). Ils seront expérimentés par du personnel formé et qualifié. Ils seront surveillés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques et auront en permanence accès à l'eau et à la nourriture. Chaque cage est pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwoll »). Durant les périodes d'expérimentation, ils seront anesthésiés sous l'isoflurane. Des points limites précis de douleur ressentie par les animaux (cf partie suivante) sont définis et les animaux seront euthanasiés si on ne peut soulager leur douleur. L'estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Le score limite est de 12. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. SURVEILLANCES REALISEES: Une surveillance quotidienne du poids des animaux sera effectuée. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères prépondérant sont les suivants selon les critères de : - Perte de poids des animaux par rapport au poids initial>20%

Choix des espèces

Pour cette étude seront utilisés des souris (Espèce Mus Musculus A1). La souris est le plus petit mammifère utilisable en recherche expérimentale. Son élevage aisé en animalerie permet des conditions environnementales contrôlées. La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Des souris C57Bl/6J femelles seront utilisées au stade adulte (8 semaines). Souris C57Bl/6J utilisées au stade adulte (8 semaines). Le choix d’une souris adulte est nécessaires d’un point de vue pharmacocinétique et physiologique (comparabilité des résultats, système hépatique et rénale fonctionnels, quantité de LCR prélevable).

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'un modèle de myopathie de Duchenne, ils reçoivent une molécule mêlée à la nourriture et une injection intramusculaire nécrosante que le porteur décrit comme modérément douloureuse, avec mesures de force et prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever muscles, diaphragme et cœur. Le porteur revendique une réduction des effectifs à six rats par groupe grâce aux données déjà accumulées. Il affirme que la validation pharmacologique sur ce modèle est une étape "indispensable" avant d'envisager un essai clinique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les signalisations moléculaires de nécrose dans les myopathies. Ces mécanismes ne peuvent être déterminés qu’en condition in vivo puisque le mécanisme de mort cellulaire par lequel une cellule meurt dépend de plusieurs paramètres dont l’importance reste largement méconnue. Le projet vise également à tester le potentiel thérapeutique de l’inhibition de la nécroptose (une nouvelle voie de mort cellulaire) dans la myopathie de Duchenne, avec un composé mélangé à la nourriture dont on attend qu'il protège les muscles de la dégénérescence qui les touche

Bénéfices attendus

Ces dernières années ont vu l’émergence de nouveaux types de mort cellulaires nécrotiques. Parmi la famille étendue des dystrophies musculaires, la dégénérescence par nécrose des fibres musculaires est un mécanisme pathogénique central et commun. Nous attendons de ce projet une cartographie plus précise des types de nécrose à l'œuvre dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). À court terme, nous attendons aussi chez nos animaux modèles de DMD traités avec un inhibiteur de nécrose un bénéfice avec une amélioration de la microstructure et de la fonction du muscle dystrophique traité. En cas de résultat encourageant chez les animaux DMD avec des traitement courts, nous projetons de poursuivre avec une évaluation à plus long terme de cet inhibiteur pour consolider le dossier préclinique en vue d’un éventuel essai clinique chez l’humain.

Procédures

Le traitement est mélangé à la nourriture et consommé spontanément par les animaux. Les animaux anesthésiés seront injectés par voie intramusculaire une fois dans le muscle de la patte pour induire une régénération musculaire. Cette intervention est rapide (moins de 10 minutes). La mesure de la force du membre antérieur sera réalisée une seule fois par animal et dure une vingtaine de minute (5 répétitions de mesure d'une minute avec 3 minutes de repos entre 2 mesures). La durée d'un enregistrement de la force musculaire du membre postérieur est de 90 minutes, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement sera réalisé pendant l’anesthésie de la mesure de force, le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

L’injection intramusculaire sera réalisée sous anesthésie générale et ne sera réalisée qu’une seule fois dans chaque muscle tibialis anterior, de façon bilatérale. En raison du volume injecté dans le muscle (100 µl) et de la réaction inflammatoire induite, cette injection nécrosante est modérément douloureuse.

Devenir

La totalité des rats inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de recueillir leurs muscles (ceux des membres, le diaphragme, le cœur) en vue de les analyser par des techniques d'imagerie, d'histolgie et de biologie moléculaire (expression différentielle de gènes, de protéines).

Remplacement

Le but de notre projet est la validation pharmacologique d’une stratégie thérapeutique préalablement testée in vitro puis par inhibition génétique sur souris dystrophique. L’inhibition pharmacologique vise à protéger les fibres musculaires dystrophiques de la nécrose de type « nécroptotique » en utilisant une molécule dont l’efficacité a déjà été éprouvée dans des publications issues de laboratoires distincts. La nécrose du rat DMD étant optimale, la validation pharmacologique dans ce modèle est une étape indispensable pour évaluer un éventuel bénéfice sur la progression de la maladie, avant d’envisager une étape clinique, en cours pour d’autres maladies.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre un maximum de 3 rats par cage. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).