Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Développement d’un modèle d’infestation par les helminthes chez le poulet de chair
- Recherche appliquée
- Maladies animales
240 poulets vont être utilisés, tous abattus à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Parmi eux, 220 reçoivent des vers parasites par inoculation orale, jusqu'à 25 inoculations par animal, avant abattage à 84 jours pour dénombrer les vers dans le tube digestif, pour mettre au point un modèle d'infestation utile à l'élevage. Le porteur affirme qu'aucun modèle ne provoquera de mortalité ni de signes cliniques graves, seuls des ralentissements de croissance et des baisses de consommation étant attendus. Il présente le projet comme une réponse aux attentes des éleveurs face à l'helminthiose.
Objectifs
En élevage avicole biologique et label, l’accès à une zone herbagée extérieure (ou parcours extérieur) pour les animaux est une obligation réglementaire. Le parcours contribue en partie au bien-être animal car il apporte un environnement adapté à l’expression naturelle de leur comportement exploratoire. Cependant, le parcours de volaille constitue également un réservoir de macro-parasites qui peuvent représenter un facteur de risque pour la santé animale. Parmi eux, les helminthes (vers parasites intestinaux) peuvent avoir un effet négatif sur le bien-être animal, mais également un impact technico-économique considérable dans les élevages de volailles : diminution de la consommation alimentaire, surconsommation d’eau, amaigrissement, baisse de performances, déséquilibre digestif, diarrhées, voire mortalité dans les cas les plus graves… L’objectif de ce projet est de mettre au point, chez le poulet de chair, un modèle d’infestation par les helminthes, pour reproduire une infestation d’un niveau comparable à ce que l’on peut trouver sur le terrain, mais sans atteindre de mortalité. Afin de trouver un modèle robuste et en adéquation avec la réalité du terrain, nous testerons plusieurs modèles d’infestation par inoculation orale, en prenant en compte 3 paramètres principaux : le choix du type d’helminthes (œufs ou larves), la fréquence des inoculations et le nombre d’helminthes administrés. Les modalités d’infestations testées au cours de ce projet seront définies à partir de la littérature et de nos précédentes études. Elles seront sans impact sur la mortalité, seules des baisses de performances sont attendues (ralentissement de la croissance, diminution de la consommation alimentaire). Ce modèle permettra par la suite de développer et mettre au point des solutions efficaces pour lutter contre l’helminthiase du poulet, mais également de documenter l’impact du parasite Ascaridia galli sur les performances d’élevage.
Bénéfices attendus
En trouvant le bon modèle d’infestation, notre projet offrira la perspective de réaliser des études plus poussées dans la recherche de solutions efficaces contre l’helminthiase du poulet, d’apporter des solutions concrètes aux éleveurs et de documenter les niveaux d’infestation tolérables dans les élevages. Aussi, dans le contexte actuel où la recherche de solutions naturelles est un enjeu de société, notre projet pourra aboutir, à plus long terme, au développement de solutions naturelles pour la lutte contre les helminthiases.
Procédures
Les 240 poulets du projet seront pesés individuellement à 4 reprises, entre leur arrivée à 1 jour et leur abattage à 84 jours, afin de connaitre et comparer leur performance de croissance. La durée d’une pesée est inférieure à 10 secondes par poulet. Parmi les 240 poulets, 220 seront soumis à une infestation par des helminthes. L’infestation se réalisera par inoculation orale sur animaux vigiles. Sur les 220 poulets infestés, 40 auront 1 inoculation à 36 jours, 60 auront 5 inoculations entre 36 et 64 jours, 100 auront 10 inoculations entre 36 et 66 jours et 20 auront 25 inoculations entre 36 et 70 jours. Chaque inoculation durera moins de 20 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs sur les animaux sont liés à la contention lors de l'inoculation et de la pesée, et au stress léger et passager que cela peut engendrer pour l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront abattus en fin d'expérimentation à des fins de prélèvements du tube digestif pour la recherche et le dénombrement de vers d’Helminthes dans les contenus digestifs.
Remplacement
Notre projet a recours à des méthodes alternatives du type « in vitro » pour le développement des œufs d’helminthes, le développement des larves en larves infestantes au sein de ces œufs, ainsi que pour leur maintien en vie. Cependant, il n’existe à ce jour, pas de méthodes in vitro ou in silico pour étudier les réponses physiologiques des individus face aux parasites (ici les helminthes) auxquels ils sont exposés. En effet, le développement d’une helminthiase au sein d’un organisme et la réaction des animaux sont très variables et dépendants de l’animal. Aussi, l’étude et l’analyse des contenus digestifs en fin de procédure, nécessitent obligatoirement le recours à des animaux. Enfin, avant le recours aux animaux, nous avons fait de nombreuses recherches bibliographiques à partir de la littérature scientifique sur le sujet. Si, à ce jour, aucun modèle d'helminthiase robuste et adapté aux larves et œufs produits et élevés dans nos laboratoires n'a été référencé dans la littérature, ces recherches nous ont aidés à définir les modalités d’infestation.
Réduction
Nous avons choisi d’étudier 11 modèles d’infestation (et 1 modalité témoin non infestée) parmi toutes les possibilités qui combinent : - le type d’infestation : œufs ou larves - le nombre d’helminthes inoculés : 200 à 5000 selon la littérature - le nombre d’inoculations : 1 prise unique à 1 prise par jour de 36 à 84 jours d’âge. Nous avons sélectionné les modèles qui nous paraissent être les plus pertinents, en combinant la réalité du terrain, la réalité de l’expérimentation, les résultats des publications scientifiques et nos propres résultats d’essai. Nous aurons 20 animaux dans chacune des 12 modalités (soit 240 animaux au total). Ce nombre de 20 animaux par modalité est optimisé pour réaliser des statistiques fiables et trouver des différences significatives pour évaluer l'effet de l’infestation sur la croissance des animaux et évaluer le degré d’infestation généré par les modèles par dénombrement du nombre de vers retrouvés dans les contenus digestifs à 84 jours d’âge.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des parquets (petits enclos où se trouvent les poulets), au sol sur des copeaux, en groupe de 20 par parquet afin de créer des relations sociales. Des ficelles et des pierres à piquer seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d’alimentation et de soins. Dans ce projet, nous avons porté une vigilance particulière aux conséquences des modèles d’infestation que nous avons choisis : aucun d’entre eux n’entrainera de mortalité, ni de signes cliniques graves. Seules des réductions de consommation alimentaire et des ralentissements de croissance sont attendues. Toutes les contentions (inoculations et pesées) seront réalisés dans le calme par des personnes expérimentées. Le matériel de pesée sera adapté à la taille et à la morphologie des animaux. Des points limites sont déterminés et une évaluation du bien-être des poulets sera complétée quotidiennement par le personnel animalier pour permettre de détecter précocement toute altération de leur état de santé ou de leur comportement. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, des actions seront prises sans délai.
Choix des espèces
S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet (gallus gallus) a été fait car il s’agit de l'espèce majeure sur le terrain et d'un modèle reconnu par la filière. Les poussins arriveront dans notre élevage à 1 jour d’âge, mais ne seront étudiés que sur la période 36-84 jours. En effet, l’infestation n’aura lieu qu’à partir de 36 jours d’âge car c’est à partir de cet âge que les animaux ont accès au parcours extérieur, et qu'ils vont potentiellement commencer à ingérer des œufs d’helminthes. Nous étudierons ensuite les animaux infestés sur toute la durée d’élevage, c’est-à-dire jusqu’à 84 jours qui correspond à l’âge classique d’abattage pour cette souche à croissance lente.
Reconstruction mammaire par bioprothèse sur un modèle lapin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles urogénitaux
21 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation de bioprothèses mammaires, avec chez une partie un prélèvement de graisse réinjecté, puis des pesées et échographies deux fois par semaine pendant quatre à neuf mois avant mise à mort. Le porteur indique un stress aux pesées, des pertes de poids après chaque anesthésie, des douleurs post-opératoires et des démangeaisons, pouvant s'aggraver si la prothèse est mal tolérée. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de prédire la tolérance de la bioprothèse ni le temps de son absorption.
Objectifs
Le cancer du sein est le 1er cancer de la femme dans le monde, avec plus de 58000 nouveaux cas diagnostiqués en France en 2018. La qualité de vie des patientes touchés par un cancer du sein fait partie intégrante de leur plan de soins. 40% des patientes bénéficient d’une ablation totale du sein, induisant des séquelles physiques et psychologiques. Des études récentes mettent en évidence une amélioration significative de la qualité de vie des patientes lorsqu’une reconstruction mammaire est réalisée. Elle est effectuée soit au cours de la même chirurgie que la mastectomie totale, soit lors d’une 2ème intervention chirurgicale avec un bioprothèse mammaire (ou prothèse à changer tous les 10-15 ans), ou par greffe utilisant les tissus de la patiente avec un risque d’évolution asymétrique entre les deux seins à court et moyen terme, entraine des cicatrices au niveau des zones de prélèvement mais l’évolution à long terme sera plus naturelle et symétrique par rapport à l’autre sein, sans nécessité de nouvelles chirurgies dans le temps). C’est dans ce contexte qu'une bioprothèse biodégradable, favorisant la régénération tissulaire grâce à une greffe de graisse sera testée dans ce projet qui cherche à évaluer le temps d’absorption d’une bioprothèse de taille humaine et la qualité de l’infiltration de la bioprothèse par le tissu graisseux.
Bénéfices attendus
L’ablation d’un sein pour une femme est assimilé à une amputation. Les méthodes pour pallier cette chirurgie sont lourdes. La bioprothèse testée ici pourrait permettre un retour à la normal pour la femme moins douloureux et plus naturel.
Procédures
Les animaux seront pesés et échographiés 2 fois par semaine pendant 4 à 9 mois. Ils subiront une chirurgie sous anesthésie générale avec antidouleur (2 incisons de la peau de 4 cm) qui durera entre 45 min et 1h15. Une partie des animaux sera anesthésié pour un prélèvement de graisse qui sera réinjectée dans la bioprothèse (environ 30 min).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors de chaque pesée qui devraient diminuer au cours du temps. Chaque anesthésie (chirurgie, Prélèvement et réinjection de graisse différé) entraine une perte de poids car l’animal s’alimente moins pendant un jour avec un retour à la normal rapide. Parfois, l’animal ne reprend pas son alimentation. Il est alors traité le lendemain et reste donc moins de 48 h sans manger et boire. La chirurgie peut entrainer des douleurs post opératoire au niveau de l’incision malgré les antalgiques (probabilité faible). Le processus de cicatrisation entraine des démangeaisons. Si la bioprothèse est mal tolérée, les démangeaisons seront plus importantes et des douleurs pourront être engendrées par une inflammation. Le prélèvement de graisse pour injection dans la bioprothèse bien que réalisé sous anesthésie et antidouleur peut générer une douleur passagère.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort car les bioprothèses et tissus nouvellement formés seront prélevés pour analyses.
Remplacement
De nombreux tests in vitro ont été réalisés : tests biomécaniques, tests de colonisation cellulaire, test de résistance à la radiothérapie. Cependant, il n’est pas possible de prédire la tolérance de la bioprothèse qui nécessite l’intervention complexe du système immunitaire ni le temps d’absorption et la colonisation par le tissu graisseux qui font intervenir de nombreux mécanismes.
Réduction
La première partie du projet consistera à mettre au point de la technique et ne donnera pas lieu à une étude statistique. C’est pourquoi 3 lapins seront mis à mort à chaque temps (4, 6, 9 mois). Au cours de la seconde procédure, le diamètre des bioprothèses sera également mesuré. Les diamètres seront comparés entre bioprothèse avec et sans greffe de graisse.
Raffinement
Dès l’acclimatation, les animaux auront des temps de jeux dans un espace plus grand que leur cage avec de nombreux enrichissements leur permettant d’exprimer leur comportement de curiosité (temps de 20-30 min max). Après la chirurgie, les animaux se réveilleront seuls dans leur cage et seront remis ensemble (par deux) dès l’observation de la reprise d’alimentation (pesées quotidiennes de l’aliment). Si une consommation faible d’aliment est observée pour un groupe d’animaux, ils seront également séparés afin d’identifier l’animal et de prendre les mesures nécessaires. L’animal sera réchauffé à l’aide d’un tapis chauffant durant l’anesthésie et de l’air chaud le réchauffera pendant le réveil. Les mêmes procédures d’anesthésie et antidouleur que chez l’homme seront utilisées pour la chirurgie et la greffe de graisse. Si le processus de cicatrisation engendre des démangeaisons, la cicatrice sera massée ave une pommade cicatrisante. Un scoring simple à mettre en œuvre permettant de déceler facilement un problème chez l’animal sera utilisé quotidiennement.
Choix des espèces
Le modèle lapin est le plus petit animal sur lequel des bioprothèses de taille « humaine » peuvent être implantées. La taille de 75 cm3 correspond à la plus petite taille nécessaire afin d’observer une recolonisation par les cellules graisseuses. Les animaux seront adultes et de grandes tailles afin de disposer d’un abdomen suffisamment grand pour placer les deux bioprothèses.
Infections nosocomiales : Détermination du profil de biodistribution de nouveaux candidats antibactériens et évaluation de leurs efficacités
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
288 souris en gravité légère et 1 050 en gravité modérée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Immunodéprimées, elles sont infectées par des bactéries responsables d'infections urinaires et pulmonaires, puis tuées par exsanguination de l'aorte abdominale pour prélèvement d'organes, afin de tester de nouveaux candidats antibactériens. Le porteur décrit pourtant une infection pouvant être sévère, avec perte de poids, difficultés respiratoires et hypothermie. Il affirme qu'en l'absence de modèle in vitro reproduisant l'interaction entre pathogène et système immunitaire, le recours au modèle animal s'impose.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer dans un modèle murin l’efficacité de nouveaux candidats antibactériens vis-à-vis des pathogènes majeurs responsables des infections nosocomiales
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : (1) Mise au point/caractérisation d’un modèle de d’infection bactérienne mimant les infections cliniques majeures (Infections urinaires et infections pulmonaires) induites respectivement par E coli et P aeruginosa (2) Evaluer la biodistribution et l’efficacité des nouveaux candidats antibactériens, (3) Etablir Un suivi longitudinal aux moyens des systèmes d’imagerie du petit animal sera mis en place. Les résultats de cette étude pourraient être ainsi prédictifs de l’approche thérapeutique à déployer chez les patients.
Procédures
(1) Prélèvements réalisés sur animaux vigiles a. Urines : 1 seule fois par animal (point terminal) (1-2 min) (2) Prélèvements réalisés sur animaux sous anesthésies : a. Prélèvements sanguins : 1 seule fois par animal (point terminal) ; ils seront réalisés par exsanguination, en ponctionnant l’aorte abdominale. Pour cela, les souris auront préalablement une (i) anesthésie générale par exposition à l’isolflurane (5% dans 95% d’O2) et (ii) une anesthésie locale administrée par voie SC al (Lidocaine) (5-7min).
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes des souris immunodéprimées peuvent entrainer une infection sévère entrainant une perte de poids potentielle, des difficultés respiratoires (dyspnée), problème de miction (dysurie, hématurie) ou une baisse de la température corporelle (hypothermie).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements d’organes sont nécessaires.
Remplacement
L’absence de modèles in vitro relevant permettant de reproduire la majorité des interactions entre agent pathogène et/ou agent antimicrobien et système immunitaire (réponse inflammatoire) nous oriente vers l’utilisation de modèles animaux
Réduction
L’évaluation du nombre minimal d’animaux à inclure pour pouvoir observer l’effet escompté a été déterminé avec des tests statistiques pour petits échantillons a été déterminé en collaboration avec des biostatisticiens en utilisant ANOVA test. Par ailleurs, l’utilisation de l’imagerie permettra de réduire le nombre de souris, chaque animal étant son propre contrôle
Raffinement
Afin de prendre en compte la souffrance des animaux, un suivi par imagerie ainsi qu’un suivi clinique seront mis en place, basé sur des observations quotidiennes des souris. Un score clinique sera établi en fonction de différents critères (apparence générale, posture, activité, poids…). Des scores seront définis pour les points limites pour mettre à mort les souris immédiatement dès qu’ils sont atteints.
Choix des espèces
Dans la recherche préclinique, les modèles murins permettent d’intégrer un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine. Par ailleurs, l’ensemble des technologies d’imagerie pré-clinique est conçu pour des rongeurs de petite taille, principalement des souris Des souris adultes (8 à 12 semaines), femelles, immunodéprimées chimiquement (pour mimer l’état d’immunodépression des personnes ayant contractées des infections nosocomiales, seront utilisées pour ce projet
Caractérisation longitudinale par IRM et SRM quantitatives de la sclérose en plaque sur le modèle murin EAE (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent deux injections induisant une encéphalomyélite auto-immune, modèle de sclérose en plaques, qui provoque une paralysie progressive des membres, puis des séances d'IRM avant prélèvement du cerveau et de la moelle épinière. Le porteur décrit une paralysie qu'il présente comme réversible et n'attend pas d'effet indésirable de l'imagerie. Il affirme qu'aucun système in vitro ou in silico ne reproduit la complexité de la maladie et que le modèle animal en est la "seule alternative".
Objectifs
De nos jours, l'IRM diagnostique de la sclérose en plaque repose principalement sur la visualisation de manière qualitative des plaques au niveau du cerveau. L’idée de ce projet est de réaliser une étude quantitative afin de calculer un certain nombre de paramètres quantitatifs issus des images IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et des spectres SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique). Ceci devrait nous permettre de mieux comprendre la pathologie au cours de son développement tant sur le plan cérébral qu’au niveau de la moelle épinière ou du nerf optique. Ce projet n’a pas fait l’objet d’une évaluation par d’autres instances.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont une meilleure compréhension de la mise en place de la pathologie dans le modèle particulier EAE (Expérimental Autoimmune Encephalomyelitis) de réponse autoimmune au niveau du cerveau et de la moelle épinière. Ces résultats seront corrélés avec ceux de nos collaborateurs qui étudient le rôle des lymphocytes Treg dans la mise en place et l'évolution de la sclérose en plaques.
Procédures
La réalisation du modèle EAE implique deux injections : * une première injection de MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) - durée 30s * une deuxième injection de 200ng de toxine de pertussis - durée 30s L'IRM de perfusion nécessite l'injection de DOTAREM (agent de contraste utilisé en routine clinique) : injection en 10s- durée de l'IRM : 1h30 maximum
Impact sur les animaux
Les signes cliniques dans le modèle EAE consistent en une paralysie progressive des membres antérieurs et postérieurs qui apparait dans les 10-14 jours après injection. Cette paralysie est réversible. Aucun effet indésirable n'est attendu pour l'imagerie et la spectroscopie. En effet l'IRM et la SRM sont deux techniques non invasives et atraumatiques largement utilisées en recherche préclinique pour des études longitudinales.
Devenir
Pour chaque procédure ,les animaux seront maintenus en vie jusqu’à J30 pour un suivi longitudinal. A la fin de chaque procédure ils seront mis à mort. Le cerveau et la moelle épinière seront prélevés.
Remplacement
Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la sclérose en plaque (SEP). Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le déclenchement de l’inflammation chronique du système nerveux central (SNC). Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP. Nous ne réaliserons pas de tests in vitro avant sur des cellules cérébrales ou de moelle épinière
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de la SEP ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 240 souris. L’étude IRM se fera par mesure des intensités de signal sur les images. Des tests non paramétriques Mann-Whitney seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs.
Choix des espèces
Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adaptés à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire
Modèle de dégénérescence rétinienne
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Lapins : 3000
3 000 lapins et 6 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un acte chirurgical ou physique induit une dégénérescence de la rétine, suivi d'examens d'imagerie et d'injections péri ou intraoculaires sous anesthésie, pour tester des substances neuroprotectrices, le projet servant aussi à de la formation et à de la production réglementaire. Le porteur affirme que le développement de ces maladies "n'est pas douloureux" et que les animaux gardent un comportement normal malgré la baisse de vision. Il indique qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'œil "dans sa globalité", ce qui rendrait le recours aux animaux vivants "nécessaire".
Objectifs
La rétine est une unité fonctionnelle du système nerveux central assurant la conversion d'un signal lumineux en un influx nerveux. La rétine mature est composée de deux tissus : la rétine neurale et l'épithélium pigmentaire de la rétine. L’atteinte de la rétine entraîne une baisse d’acuité qui peut être sévère, une atteinte du champ visuel et peut faire basculer les patients dans le handicap. Les dégénérescences de la rétine font partie des causes de cécité les plus fréquentes dans les pays industrialisés. On retrouve parmi elles : le glaucome, la dégénérescence maculaire (DLMA) sous sa forme sèche, la rétinopathie diabétique et la rétinite pigmentaire. Le but de ce projet est de tester l'efficacité de substances neuro-protectrices dans deux modèles de dégénérescence de la rétine chez le rat et le lapin.
Bénéfices attendus
Le but du projet est d'utiliser un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements neuroprotecteurs de la rétine. La recherche de traitements pour préserver les cellules de la rétine est en constante évolution, pour intervenir à différents stades des maladies (glaucome, DMLA, rétinite pigmentaire) et préserver au mieux la vision des patients.
Procédures
Un traitement physique ou un acte chirurgical unique de brève durée sous anesthésie sont pratiqués pour induire les modèles expérimentaux. Les examens effectués par la suite en imagerie ou en électrophysiologie pour étudier le fonctionnement des cellules de l’oeil ainsi que certains traitements administrés par voie péri ou intraoculaire se font sous anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal et de ne pas occasionner de stress pour celui-ci, chaque examen ne dure que quelques minutes puis l'animal est replacé dans son cadre d'hébergement habituel. Il est possible de réaliser des prélèvements de sang si besoin de doser le médicament administré ou tout autre marqueur.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles causées lors de l’induction de la pathologie, comme le maintien dans des cages individuelles des animaux dans un environnement différent des conditions normales d’hébergement quelques heures (exposition à une lumière bleue). Pour les modèles de dégénérescence des RGC, l’induction nécessite l’anesthésie par injection intramusculaire, des animaux et une intervention au niveau de l’œil. Les examens pratiqués pour évaluer les signes cliniques de la maladie ne sont pas invasifs. Ils sont semblables à ceux pratiqués chez l’animal en clinique vétérinaire ou chez l'homme en cabinet ophtalmologique où ces examens sont d’ailleurs pratiqués sans anesthésie. Ici la gêne occasionnée sera le maintien de l’animal ou l’administration de l’anesthésie dans le cas où l’immobilisation est nécessaire. L'administration topique des produits notamment des traitements devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme. L'administration par injection intraoculaire, en sous cutanée ou en transdermique pourra occasionner une petite inflammation transitoire avec l'apparition de rougeurs sans conséquence. Une administration d’anesthésiant locale dans le cas des injections intraoculaires réduira la gêne à son maximum. Les animaux vont avoir une baisse de la vision, mais leur comportement, déplacement dans leur cage, prise de poids n’est pas altéré. Le développement de ces maladies de la rétine n’est pas douloureux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations histologiques ou les dosages de produits.
Remplacement
L’oeil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales est nécessaire pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rats seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger. Si la procédure expérimentale le permet un abri sera ajouté. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’oeil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dans les publications de référence sur lesquelles le projet est basé. Pour ce projet, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront des jeunes adultes agés au minimum de 6 semaines pour les rats correspondant à la maturité de la rétine. Les lapins inclus dans les études seront âgés de minimum 8 semaines.
Alimentation des chatons en croissance
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
125 chatons vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des prises de sang, jusqu'à 4 ml par prélèvement, et des collectes d'urine, pour évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments industriels destinés aux chatons en croissance. Le porteur affirme que le protocole n'entraîne "ni douleur, ni souffrance" et que le stress des prises de sang est minimisé, l'objectif restant la formulation de produits commerciaux. Il indique qu'aucun modèle ne peut prédire l'appétence d'un aliment complet chez le chat, ce qui rendrait "nécessaire" le recours à l'essai sur les animaux.
Objectifs
Pour évaluer la bonne prise alimentaire et la tolérance des aliments destinés aux chatons, il est nécessaire de procéder à des évaluations. Pour être complets, ces tests doivent comprendre le suivi clinique, pondéral et alimentaire des animaux, ainsi qu’une évaluation de la tolérance digestive, des mesures d'odeur de selles, des analyses d'urines et des paramètres sanguins.
Bénéfices attendus
Connaissances sur les besoins nutritionnels et le comportement alimentaire des chatons en croissance. Formulation de produits au plus près des besoin des chatons pour leur garantir une appétence et une tolérance digestive optimales. Identification de nouvelles solutions nutritionnelles.
Procédures
La recolte d'urine et prise de sang seront fait avec les animaux vigiles. Une analyse de la biochimie sanguine au maximum une fois par seamine et par animal. Les paramètres pour les prises de sang incluent les mesures de la fonction rénale et hépatiques (urée, créatinine, phosphatase alcaline, albumine, gamma glutamyl transférase, glutamate-pyruvate transaminase, protéine totale, cholestérol, globuline, et bilirubine totale). L’hématologie incluera la numération des hématies et le dosage de l’hémoglobine, numération des globules blancs et plaquettes. Une analyse d’urines (couleur, turbidité, pH, protéine totale, glucose, cétones, bilirubine et sang, densité spécifique et sédiment) pourra être réalisée à la discrétion du vétérinaire. La collection d’urine se fera par collecte libre (free-catch). Lors de prises de sang, le volume minimum nécessaire (comme spécifié par les laboratoires d’analyses) pour analyse les marqueurs sera prélevé : 4ml/prise (sans exceder 15 % du volume sanguin sur une période de 28 jours). La collection d’urines devra prélever 5ml. La prise de sang sera fait par un vétérinaire et si l’animal ne se débat pas: -sur la phase de prélèvement uniquement : 15 secondes (maximum 30 secondes) -En incluant la phase de contention, de tonte, de désinfection et de prélèvement 2 minutes maximum
Impact sur les animaux
Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. Le stress éventuel lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et recevront un suivi vétérinaire et des soins adaptés à leur état de santé.
Remplacement
Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards AAFCO et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place. Le protocole a pour objectif d'évaluer l'appétence et la tolérance digestive d'aliments destinés aux chatons en croissance. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse approcher la digestion, absorption et métabolisation d’un aliment complet dans cette espèce. Il est donc nécessaire de passer par des essais in vivo au cours desquels les chats reçoivent la formulation d’aliment à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux inclus pour chaque étude est issu de la recommandation américaine lors de la réalisation d’un protocole dit AAFCO utilisé par l’intégralité de la profession, soit 1 lot de 10 chatons issus au minimum de 3 différentes mères. 10 chatons inclus au début de l’étude pour avoir au moins 8 retenus à la fin.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement par des techniciens animaliers et des vétérinaires à des rythmes réguliers et définis et continuent les sorties quotidiennes habituelles. Ce protocole n'entraîne ni douleur, ni souffrance. L'état d'anxiété lors de réalisation de prises de sang est minimisé par un personnel qualifié et des animaux habitués dans notre centre.
Choix des espèces
Chaque espèce animale possède son propre métabolisme, ses propres performances digestives , ainsi que ses propres préférences alimentaires et facteurs d’appétence pour un aliment donné. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. Il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la tolérance digestive ainsi que de prédire l’appétence d’un aliment complet chez le chat. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chatons reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Les chatons seront âgés de 3 à 12 mois pour évaluer les besoins nutritionnels en croissance. Indépendemment de l'âge, les chatons devront peser plus de 500g pour être inclus dans ce projet.
Identification de nouveaux traitements pour le cancer du rein.
- Recherche appliquée
- Cancers
832 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses par injection sous-cutanée ou par chirurgie intra-rénale, puis un traitement quotidien pendant trois semaines par voie orale ou intrapéritonéale, pour tester une combinaison thérapeutique contre le cancer du rein. Le porteur indique une masse tumorale, une possible perte de poids et une déshydratation après chirurgie, et renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme. Il affirme que la culture cellulaire ne renseigne pas sur un "organisme complexe vivant" et que le recours à la souris est le "seul moyen" de répondre à ses questions.
Objectifs
On estime à 13 000 le nombre de nouveaux cas de cancer du rein en 2015 en France. Le cancer du rein représente environ 3 % de l'ensemble des cancers. L'âge moyen au moment du diagnostic est 65 ans. Il est classé 14e cancer le plus fréquent chez la femme et 9e chez l'homme. La chirurgie est le traitement de référence, les traitements par chimiothérapies, ainsi que la radiothérapie peuvent être réalisés mais les cellules cancéreuses du rein sont généralement résistantes à ces traitements. C’est pourquoi il est important de trouver de nouveaux traitements. Nous avons identifié des nouvelles cibles impliquées dans la résistance à la chimothérapie. Nous souhaitons démontrer in vitro et in vivo qu’un inhibiteur de ces cibles, déjà utilisé en clinique, en combinaison avec la chimiothérapie présenterait un effet anti-tumoral synergique en favorisant l’apoptose mais aussi en stimulant l’immunité antitumorale.
Bénéfices attendus
Si notre nouveau traitement est efficace nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète de la tumeur. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes de résistances aux traitements au cancer du rein. A terme ce projet permettra de proposer une nouvelle ligne de traitement du cancer du rein et ainsi augmentera les chances de survie des patients atteints de ce cancer.
Procédures
Les souris seront soumise à une greffe de cellules par injection sous cutanée (20 secondes /souris y compris contention) ou intra-rénal avec chirurgie (20min/ souris y compris anesthésie). Elles seront traitées quotidiennement pendant 3 semaines par voie orale (10 secondes /souris y compris contention) ou par injection intrapéritonéale (5 secondes /souris y compris contention) avec une chimithérapie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont la présence d'une masse tumorale, une possible perte de poids (mais pas obligatoire) d'une fatigue et d'une déshydratation suite à la chirurgie.
Devenir
A la fin de l'expérience tous les animaux sont tous euthanasiés car ils ne peuvent pas rentrer dans une nouvelle procédure et un prélèvement de la tumeur résiduelle est nécessaire.
Remplacement
L’alternative possible à l’utilisation d’animaux est l’utilisation de cellules en culture. Cependant cette alternative ne permet pas de connaitre les effets de nos traitements sur un organisme complexe vivant, ni de déterminer le rôle du système immunitaire dans le traitement du cancer, ni de mimer la pathologie existante chez l’Homme. Ainsi l’utilisation d’animaux est le seul moyen de répondre aux questions scientifiques de notre projet sur le cancer du rein.
Réduction
Les biostatisticiens nous conseillent de travailler avec 10 animaux. Ce nombre d’animaux par groupe ne doit pas être vue comme une augmentation de la quantité d’animaux nécessaires, mais au contraire comme une réduction, les données statistiques seront plus solides, et donc il n’y aura pas la nécessité de reproduire l’expérience. Pour analyser l’effet des différents traitements sur la croissance tumorale, il y aura 2 étapes d’analyse : la croissance tumorale et l’analyse de la survie.
Raffinement
Les mesures destinées à réduire la contrainte, la souffrance et l’angoisse des animaux prévues dans le cadre de notre expérimentation sont: la présence de coton ou « petites maisons » afin de créer un enrichissement de l’hébergement pour limiter les bagares liées aux problèmes de dominances, les souris seront hébergées en zone SOPF, cette zone permet au statut dommageable de ne pas apparaitre. Les mesures destinées à réduire la douleur mises en place sont : un suivit quotidien afin de surveiller l’état général des animaux, une anesthésie par inhalation d’isoflurane sera nécessaire lors de la greffe orthotopique, si la souris est déshydratée, nous réalisons une injection sous cutanée de NaCl, pour gérer la douleur, nous utilisons des analgésiques : buprenorphine 0,05 à 0,1 mg/Kg deux fois par jour en cas de signe de douleur jusqu'à une durée de 5 jours max en sous cutanée (volume injecté 5 ml/Kg), en cas de perte de ou de difficultés à se nourrir, nous ajouterons de la nourriture gélifiée, en cas de baisures liées à des « bagarres » entre les animaux nous désinfecterons avec Bétadine+Dakin et nous observerons cette souris quotidiennement.
Choix des espèces
Les souris sont le meilleur modèle représentatif de l’homme pour ce type d’expérience, et le moins onéreux. Nous utiliserons des souris immunocompétentes (fond génétique BALB/c) pour greffer des cellules de cancer du rein murines et des souris immunodéprimées (fond génétiques Nude ou NSG) pour les greffes de cellules tumorales humaines. Les animaux utilisés seront les mâles et femelles adultes (>6 semaines) car le cancer du rein étudié est présent chez l'adulte.
Evaluer l’impact d’anticorps murins dirigés contre des peptides impliqués dans la fonction de reproduction sur la fertilité chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Une à trois injections d'anticorps dans l'abdomen ou dans une veine, puis douze heures d'accouplement par trio d'un mâle et deux femelles : 216 souris CD1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections peuvent provoquer inflammation, hématome ou infection du péritoine, et la voie intraveineuse un saignement ou une opacification de l'œil avec cécité, alors que le porteur évoque une douleur "légère transitoire" pour une injection, "modérée transitoire" pour trois. Ces anticorps, obtenus en immunisant d'autres souris, visent deux peptides de la spermatogenèse que reconnaissent aussi des anticorps de patients atteints de COVID-19, et l'équipe compte les portées et les nouveau-nés pour mesurer leur effet sur la fertilité. Les souris traitées sont tuées pour analyses, et 118 souris, non traitées ou nées des accouplements, sont déclarées réutilisées.
Objectifs
Les agents infectieux jouent un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes et ce par divers mécanismes dont le plus important est le mimétisme moléculaire consistant à déclencher une réactivité auto-immune lorsque l’agent pathogène et l’antigène tissulaire humain sont structurellement similaires(1). L'épidémie de COVID-19 a incité les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une auto-immunité par le biais d'une réactivité croisée. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains partageant des séquences communes avec la protéine SPIKE, entraînant une réactivité auto-immune. Pour exemple, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns pouvant par exemple conduire à une altération de la spermatogenèse et notamment de l'étape de spermiogénèse nécessaire à la maturation des spermatozoïdes . Une première analyse in-silico a permis d'identifier 4 peptides liés à la spermatogénèse qui partageaient au moins 5 acides aminés communs avec la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons découvert que les patients infectés par la COVID-19 développaient des anticorps contre 2 peptides (peptide A et B dans l'étude) impliqués dans la spermiogénèse. Une analyse biochimique a prouvé que les anticorps anti-Spike S du virus Sars-COV2 peuvent reconnaitre les deux peptides A et B liés à la spermatogenèse chez les hommes mais également chez les femmes affectés par la COVID-19. Ce résultat indique l'apparition possible de nouveaux troubles de la fertilité et féconditité dans la population. Pour aller plus loin dans cette étude, nous avons produit des anticorps murins de sous-classe IgG réagissant avec les peptides A et B en immunisant des souris saines contre ces peptides. Le but de ce projet est d’évaluer la pathogénicité de ces anticorps en les administrant à des souris mâles et femelles saines et en déterminant leur effet sur la fertilité (nombre de portées) et la féconditité (nombre de nouveaux-nés)..
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur l'ensemble de la population. Cette étude permet de mieux comprendre les effets de l'infection par le SARS-Cov-2 sur les humains, en particulier la pathogénicité d'auto-anticorps sur le système reproducteur.
Procédures
Les souris mâles et femelles recevront 1 à 3 injections maximum d’une durée de 2 minutes chacune sur animal vigile ou anesthésié. L'accouplement est composé d'un trio : 1 mâle et 2 femelles. Temp d'accouplement 12 heures.
Impact sur les animaux
L'administration dans la cavité abdominale peut induire une inflammation, une induration, un hématome ou une infection de la cavité péritonéale et l'administration Intra-veineuse peut induire un un saignement, une inflammation, une infection ou une opacification avec cécitéselon que l'animal recevra une injection ou au maximum 3. Ces injections pourront induire une douleur légère transitoire si réalisée une seule fois sur l'animal voire modérée transitoire si au maximum selon les résultats de l'étude pilote 3 injections devaient être réalisées.
Devenir
Tous les souris traitées seront mise à mort pour analyses ultérieures. Les souris non traitées et les souricaux seront réutilisés.
Remplacement
Le projet actuel représente la partie finale d'une étude plus étendue préalables visant l'identification des peptides partageant des identités de séquence avec la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, elle a été suivie des studios dans les sérums des patients atteints de COVID-19 . Actuellement, le seul modèle disponible pour prouver le rôle des anticorps anti-peptides sur le système reproducteur est un organisme complexe comme le modèle murin. Aujourd'hui, notre objectif ne peut pas être atteint en utilisant des modèles cellulaires artificiels. Le modèle murin représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux dans le projet est évalué selon les calculs de puissance visant à réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude.
Raffinement
Nous avons établi des points-limites qui permettent de soustraire l'animal à la souffrance sur la bse d'une grille de score permettant d'évaluer l'état de santé des animaux ainsiq ue la douleur. L'injection intra-veineuse est réalisée sous anesthésie. Afin de réduire la douleur, une goutte d'anti-douleur sera ajoutée après l'injection. Les souris sont logées en groupe social et chaque cage sera équipée de matériaux de nidification pour que les mères puissent construire le nid et d'un bâton à ronger.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme et elles développent des pathologies similaires à celles observées chez l'homme. De plus, le modèle murin a un taux de reproduction élevé permettant d'obtenir rapidement des résultats. Les souris CD1 sont utilisées à l'âge de 6-8 semaines après avoir atteint leur maturité sexuelle.
Caractérisation de vésicules extracellulaires in vivo chez la souris en vue de leur utilisation comme outil thérapeutique dans le cadre de traitement des maladies digestives
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune anesthésiée pour neuf séances d'imagerie optique après une dose unique de vésicules extracellulaires, injectée ou administrée par gavage, puis tuée pour une étude post-mortem. Ces vésicules n'ont été testées qu'in vitro, et le porteur ne peut exclure ni une toxicité ni des crampes abdominales, des rougeurs, des ulcérations ou une fausse route lors du gavage. Il présente le projet comme "la première étape" d'un futur traitement des fistules digestives et de l'inflammation intestinale, l'efficacité des vésicules étant renvoyée à des travaux ultérieurs. Pour l'effectif, il évoque seulement "des groupes pertinents composés d'un nombre d'animaux suffisant pour arriver à une conclusion claire", sans calcul ni taille de groupe.
Objectifs
Les vésicules extracellulaires, particules sécrétées par les cellules, agissent comme des messagers intercellulaire en libérant leur contenu dans la cellule cible. Cette capacité fait d’elles une nouvelle voie thérapeutique importante. Les vésicules extracellulaires sont donc présentes dans le corps humain. Ainsi le risque qu'elles entraînent une réaction immunitaire est faible, ce qui facilite leur application en médecine humaine en comparaison de la thérapie cellulaire et génique. Elles offrent ainsi de nouvelles perspectives d’application dans les champs du diagnostic et de la thérapie. Avant d’évaluer leur propriétés anti-inflammatoire et régénérative dans un contexte pathologique de maladies digestives, il est indispensable de déterminer la biodistribution, la cinétique, l’élimination, et la tolérance de ces vésicules. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer dans un organisme vivant l'ensemble de ces paramètres.
Bénéfices attendus
Ce projet est la première étape du développement d’un nouveau traitement des fistules digestives et de l'inflammation gastro-intestinale améliorant la prise en charge et la qualité de vie des patients. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes d’intégration des vésicules extracellulaires et d’avoir les premiers éléments permettant par la suite d’évaluer leur propriétés anti-inflammatoires et régénératives ainsi que leur efficacité.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles ou geste chirurgical n'est prévu dans ce projet. Les animaux recevront une dose unique de substance par injection ou gavage sur une durée de deux minutes maximum. Par la suite, chaque animal sera examiné par imagerie optique à 9 intervalles de temps différents après l’injection, dont la durée est environ de 5 minutes chacun. L'imagerie sera réalisée sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Cette étude sera menée en imagerie optique, non invasive et non irradiante, sous anesthésie. Cette technique n’induit aucun douleur ou effet indésirable. Les produits administrés ont été testés et validés in-vitro mais ce sera la première étude menée in-vivo. De ce fait, on ne peut exclure ni une toxicité ni des effets indésirables potentiels liés à l’injection : crampes abdominales, rougeur, ulcération, ou fausse route dans le cas du gavage.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort afin de procéder à une étude post-mortem.
Remplacement
Une étude in vitro ne peut se substituer à l’étude in vivo, afin de visualiser la biodistribution des vésicules extracellulaires dans un organisme entier. Des tests in vitro ont été réalisés au préalable, afin d'optimiser la formulation et choisir la plus stable ainsi que pour optimiser certains paramètres d’imagerie.
Réduction
Nous avons fait le choix d’utiliser une technique d’imagerie, non-invasive et non irradiante, permettant le suivi longitudinal et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents composés d’un nombre d’animaux suffisant pour arriver à une conclusion claire. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
L’environnement des animaux est enrichi pour favoriser le bien-être, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort (gel ophtalmique) sont appliquées. Les animaux sont observés quotidiennement. L’imagerie optique, méthode d’exploration choisi pour notre étude, est reconnue pour n’induire ni douleur ni effets secondaires néfastes.
Choix des espèces
La souris est une espèce communément utilisée pour les études d’imagerie optique du fait de leur petite taille, et représente un modèle pertinent pour évaluer au mieux la biodistribution. L'étude de la biodistribution sera ainsi réalisée sur des souris âgées de 8 semaines, afin de travailler avec des animaux possédant un système immunitaire et un système digestif matures. Cette espèce sera également utilisée dans les études ultérieures car favorable au développement de modèle de maladie inflammatoire de l’intestin.
Perturbation endocrinienne de la relation Reproduction-Immunité-Métabolisme énergétique chez le bar européen par du triphényle phosphate
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système urogénital
700 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés pendant deux mois au triphényl phosphate, un plastifiant suspecté d'agir comme perturbateur endocrinien, à concentration environnementale, puis maintenus neuf mois avant d'être tués pour prélèvement d'organes et de tissus. Le porteur décrit un suivi par grille de score, un individu à la nage désordonnée étant mis à mort au point limite, et ne prévoit pas d'intervention sur animal vigile ou anesthésié en dehors de cette fin. Il affirme que les approches in vitro ou in silico ne permettent pas d'évaluer l'impact du produit sur un "organisme entier", ce qui justifierait selon lui le passage par le poisson vivant.
Objectifs
L'immunité est une fonction majeure impliquée dans les défenses contre les agents pathogènes. Chez les vertébrés à mâchoire, les lymphocytes T ont la particularité de se développer dans le thymus lui-même sujet à des variations de taille suivant l'âge ou les taux plasmatiques des hormones sexuelles. Ces variations ont été associée à une altération de l'abondance des sous-types de lymphocytes T périphériques, une diminution de la réponse immunitaire adaptative, une augmentation de l'incidence des maladies infectieuses et une augmentation de la tolérance immunitaire (grossesse). Nous avons montré que les effets des estrogènes sur le thymus et les lymphocytes T étaient conservés entre le bar et les mammifères et que l’exposition à de l’estradiol (E2) modulait chez le bar la plasticité thymique et augmentait sa tolérance immunitaire. Chez le poisson, le thymus subit une involution hivernale puis une reformation en été qui semble avoir lieu chez des juvéniles de l'année mais également des individus matures avec chez ces derniers une involution plus marquée ainsi qu'un dimorphisme sexuel. En plus des hormones sexuelles, celles du métabolisme semblent également être des éléments de premier ordre dans ce phénomène. Ces dernières ont un rôle dans la gestion des réserves énergétiques ou le métabolisme en général, mais également dans la régulation de la reproduction. Ainsi, les fonctions de reproduction, d’immunité et de métabolisme sont étroitement liée. Au sein de ce projet, nous testerons dans un premier temps (1) l’hypothèse selon laquelle l'involution thymique serait influencée par les hormones stéroïdes résultant d’un compromis énergétique (trade-off) entre immunité et reproduction. L’action des perturbateurs endocriniens à activité estrogénique (PEE) sur les téléostéens est bien documentée (reproduction, croissance, immunité…) mais rares sont les études analysant les impacts sur plusieurs fonctions physiologiques à la fois. Le triphényl phosphate (TPP), détecté dans les eaux de surface de nombreux pays, est un plastifiant suspecté PEE, connu pour affecter la reproduction, l’immunité et le métabolisme. Ainsi, dans un second temps, (2) nous évaluerons l’impact du TPP sur ce trade-off établi entre ces trois grandes fonctions.
Bénéfices attendus
- Chez les poissons téléostéens, les connaissances concernant la régulation endocrinienne et environnementale (incluant la contamination environnementale) de la reproduction et de l’immunité par les hormones du métabolisme sont quasiment inexistantes. Or il s’avère que la compréhension de ces mécanismes est à la base de cette demande. Les mécanismes étant très conservés chez les vertébrés, les résultats permettront par ailleurs de mieux comprendre le lien existant entre certaines pathologies humaines métaboliques, l’immunité et la reproduction. - L’étude de l’action du TPP sur un équilibre affectant plusieurs fonctions physiologiques permet une vision plus intégrative et de mieux appréhender les risques environnementaux et sanitaires associés à la présence de ce contaminant largement utilisé dans les produits de la vie quotidienne. Nous pourrons faire une évaluation intégrative de la santé des individus de poissons mais aussi plus largement des populations. - Ce travail aidera, par extrapolation, à élucider l’impact du TPP dans certaines pathologies humaines métaboliques, mais aussi sur l’immunité et la reproduction qui, chez les sujets obèses, sont moins performantes.
Procédures
Les animaux seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (température, luminosité, pH contrôlés). Aucune intervention sur animal vigile ou endormi. Chaque individu sera euthanasié pour prélévement d'organes et tissus.
Impact sur les animaux
Le projet est divisé en deux périodes. Durant la première, les poissons seront maintenus en conditions contrôlées mimant une évolution naturelle des saisons. Durant la seconde, les individus seront exposés à un contaminant à concentration environnementale pendant 2 mois, puis maintenus en condition non contaminée pendant 9 mois (identique à la première période). Un période d'acclimatation de 7 jours sera respectée afin de permettre leur habituation et une meilleure gestion du stress. Des contrôles quotidiens seront effectués afin de s'assurer du bien-être des poissons et du respect des conditions d'hébergement (température, pH, luminosité...). Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite) après anesthésie (MS222).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre le prélèvement d'organes et tissus.
Remplacement
Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de ce PEE sur un organisme entier. Afin de comprendre l’impact de ce TPP sur la physiologie du poisson, nous devons obligatoirement passer par un modèle vivant. Cependant, toutes les études préalables de définition de concentrations utiles ont été réalisées par une approche in vitro.
Réduction
- Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux, nous avons calculé l’effectif nécessaire pour pouvoir détecter un effet significatif s’il existe réellement. Pour cela, il est nécessaire de décrire plusieurs paramètres : la puissance statistique souhaitée (habituellement 90%), delta (différence de moyenne attendue), sd (écart-type attendu des données), le risque alpha (habituellement 5%). Les paramètres delta et sd ont été obtenus à partir d’expérimentations précédentes sur des bars matures mâles et femelles. Résultat : - Les concentrations utilisées sont en cours de détermination grâce à des tests in vitro. Ces derniers permettront de cibler les concentrations intéressantes afin de limiter le nombre de conditions et donc d’organismes utilisés. - Plusieurs mesures biologiques et chimiques sur chaque individu
Raffinement
Dans le but de réduire au maximum la douleur, l’angoisse et la souffrance des animaux nous utiliserons durant toute l’expérimentation la grille de score de la Fraunhofer institute qui est un bon guide pour la prise de décision quant à la souffrance animale. Un animal qui présenterait une nage sur le dos avec des mouvements non coordonnés, nage erratique serait immédiatement euthanasié (point limite). Nous souhaitons qu’à la base de cette grille de score nous restions avec des animaux qui sont en code couleur vert.
Choix des espèces
Le bar Européen constitue une espèce à fort intérêt écologique et économique et, du fait de sa production aquacole importante, son système immunitaire et reproductif font l'objet de nombreux articles scientifiques. De plus, suivant nos recherches, chez le bar, le thymus et les lymphocytes T font l'objet d'une régulation fine par les composés oestrogéniques, ce qui suggère que l'immunocompétence du bar pourrait être impactée par des perturbateurs endocriniens oestrogéniques présents dans son environnement. Cette espèce constitue donc un modèle de choix pour notre étude. Ce poisson est par ailleurs soumis à des restrictions croissantes de pêche en Europe de l’Ouest (850/98/EU ; 2018/120/UE) car les stocks de celui-ci sont actuellement en déclin et cela ne résulte probablement pas uniquement d’une activité de surpêche. Les individus seront pris à un âge où ils sont encore sexuellement immatures mais immunitairement matures (dès 180 dph, cohortes 1b et 2b) et matures à la fois sexuellement et immunitairement (dès 450 dph, cohorte 1a et 2a). Nous sommes intéressés par l’étude des étapes clés correspondant au basculement d’une immunité « entière » à une immunité moins complexe et en fonction de la saison et de la mise en place d’une stratégie de reproduction. Chez les bars, en termes de reproduction, les mâles développent leurs gonades dès 310 dph et les femelles en condition contrôlée dès 240 dph. Pour ce qui attrait à l’immunité, les bars sont matures dès 180 dph.
PTOL : Etudes de tolérabilité et de choix de doses chez les rongeurs.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 2500
1 000 souris et 2 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent par gavage quotidien des molécules jamais testées auparavant, à des doses pouvant atteindre 300 mg/kg par jour, avec prélèvements sanguins répétés et jeûnes allant jusqu'à 16 heures, pour cribler des produits chimiques en début de développement. Le porteur indique que les effets peuvent être sévères, avec convulsions, tremblements, prostration et pertes de poids, les animaux qui se dégradent étant mis à mort. Il affirme que les essais in silico et in vitro ne renseignent ni sur les effets à long terme ni sur la gravité, et présente le recours au rongeur comme "incontournable".
Objectifs
Ce projet concerne les premières études toxicologiques réalisées chez l’animal. A ce stade de développement d’un produit chimique, les informations sur la caractérisation du profil toxicologique sont parcellaires, et souvent inexistantes dans un organisme entier vivant. En accord avec le principe des 3R, le recours à l’animal doit être réduit au maximum. Les études in vivo sont cependant incontournables pour appréhender les effets d’un produit chimique sur un organisme entier. Dans le cas des études in vivo, la priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées. Pour ce faire et pour que les études exploratoires et de choix de doses soient les plus prédictives possibles, elles sont réalisées sur les mêmes espèces que les études constitutives du dossier de mise sur le marché des produits (rongeurs : rats et souris). Ce projet comprend une série d’études permettant d’évaluer la dose maximale tolérée par les rongeurs, ainsi que des informations sur le choix de doses pour les études futures. Il permet de fournir des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale pendant une période courte. En effet l’exposition à un composé est souvent multiple (doses répétées) et peut produire des effets immédiats ou plus tardifs (par accumulation de la substance d’essai ou par sa biotransformation par exemple). Le projet est utilisé pour fournir des informations sur le potentiel toxique d’un produit au début de son développement. Ces études d’une durée inférieure ou égale à 15 jours permettent de cribler les molécules, d’arrêter le développement de molécules trop actives ou de définir les doses qui pourront être utilisées dans des études subaiguës et subchroniques requises par les autorités sans induire d’effets sévères. Ces études précoces sont conduites avec un nombre restreint d’animaux et leur suivi clinique est renforcé en particulier en début d’exposition. On distingue trois types d’essais précoces : Les études de tolérabilité et de choix de doses qui sont réalisées sur des rongeurs adultes, les études de tolérabilité et de choix de doses qui sont réalisées sur des rats juvéniles et les études de tolérabilité et de choix de doses qui sont réalisées sur des femelles gestantes afin d’éliminer précocement des molécules ayant un effet toxique sur le développement.
Bénéfices attendus
Ces études permettent avec un nombre restreint d’animaux d’arrêter précocement le développement de molécules trop actives ou de déterminer les effets toxiques généraux induits par l’exposition à la substance d’essai chez les rongeurs afin de définir les doses qui seront utilisées dans les futures études.
Procédures
Un gavage journalier sur animaux vigiles, se faisant en 15 secondes, tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l'âge des animaux. Des prélèvements sanguins réalisés en moins de 2 minutes par animal. Eventuellement, un prélèvement unique d’urine en cage à diurèse pendant un maximum de 16h.
Impact sur les animaux
Les effets toxiques attendus sur les animaux peuvent être sévères car les molécules n’ont jamais été testées au préalable dans l’espèce, à l’âge et aux doses choisies. Les signes de toxicité pouvant apparaitre en cours d'études incluent des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, convulsion, prostration, augmentation ou diminution de la mobilité et de l'agressivité, tremblement ou impact sur la température corporelle. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale, la veine sublinguale ou la veine saphène. Suite aux prélèvements, de petits hématomes peuvent apparaitre. Lors des prises d'urine les animaux sont isolés une nuit dans une cage à diurèse ce qui peut induire un stress léger sur l’animal. Pour certains prélèvements les rats peuvent être soumis à un jeûne de 16h maximum générant une perte de poids inférieure à 10% du poids corporel et réversible dès la réintroduction de la nourriture. Les produits ne seront administrés qu’à des doses appropriées : la dose maximale utilisée est en général 300 mg/kg/jour. On utilise donc des doses inférieures aux doses limites préconisées dans les lignes directrices pour le calcul de la toxicité aiguë (Dose létale 50%).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin d’étude pour évaluer l’effet de la molécule sur les organes lors de l'autopsie. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.
Remplacement
De nombreux essais in silico et in vitro sont utilisés pour identifier/confirmer des mécanismes d’action préalablement au recours aux études animales. Mais ils ne peuvent prendre en compte l’intégralité des mécanismes conduisant ou pas à l’apparition d’effets toxiques et ils ne peuvent pas donner d’informations concernant les effets à long terme ni la gravité des effets qui suit l'exposition au produit. De même, pour comprendre le mode d'action d'une toxicité spécifique, un enchaînement d’évènements biologiques au niveau moléculaire et tissulaire doit être identifié et caractérisé.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. Un nombre de 3 à 6 animaux adultes et 4 pour les juvéniles ou les gestants (la gestation n’étant pas certaine au démarrage de l’étude). En fonction des effets attendus, une seule dose sera testée au préalable et les doses des autres groupes adaptés en fonction des signes observés.
Raffinement
Dans ces études, les animaux sont hébergés en groupe ou individuellement avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes de reformation régulière. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal qui sera demandée par le directeur d’étude. En cas de problème un vétérinaire est présent sur le site pour assurer un traitement. En cours d’étude si besoin des prélèvements sanguins seront réalisés en fonction des recommandations du NC3R National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research). A la fin de chaque étude, une évaluation sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal et le comité d’éthique.
Choix des espèces
Ces études sont réalisées chez le rongeur car ce sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur utilisation fréquente dans les études toxicologiques et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Le stade de développement des animaux utilisés est : • Les études de tolérabilité et choix de doses sont réalisées chez de jeunes adultes ou adultes (en général de 6 – 10 semaines) • Certaines études décrites dans ce projet (procédure expérimentale 2) sont conçues pour étudier les effets d'un composé d'essai sur différents paramètres de la puberté (par exemple, chez les femelles, l'âge de l’ouverture vaginale et l'effet sur le cycle de l'œstrus sont déterminés). Cela nécessite donc l'utilisation d'animaux sexuellement immatures (juvéniles). En général au début de l’étude les animaux auront environ 20 jours (minimum postnatal (PND) 18). • Les études de tolérabilité et choix de dose de toxicité du développent visent à étudier le potentiel toxique d’une substance sur le développement et seront réalisées pendant la gestation puisque l’objet de l’étude porte sur le développement du fœtus lors d’une exposition in utero. De jeunes rats (8-12 semaines au début de l’étude) seront utilisés conformément aux recommandations des guidelines internationales.
Virus du Nil occidental (West Nile virus) : évaluation dans un modèle animal des facteurs génétiques impliqués dans la virulence
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Infectées par le virus West Nile, elles peuvent développer une perte de poids, une perte d'équilibre, une paralysie et mourir, un point limite de deux signes cliniques déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Le porteur compare la virulence de virus chimériques assemblés en laboratoire pour identifier les facteurs génétiques en cause. Il indique que la capacité du virus à infecter le système nerveux ne peut s'étudier qu'in vivo et présente ce modèle comme "nécessaire".
Objectifs
L’infection au virus West Nile (VWN) constitue un risque majeur pour la santé humaine et animale notamment chez les oiseaux sauvages et les équidés. Les symptômes liés à la maladie vont de la simple fièvre jusqu’à des atteintes neurologiques pouvant être mortelles dans les cas les plus sévères. Ce virus est présent dans de nombreux pays européens, avec 49 cas équins et 1 humain en 2015 ou encore 13 cas équins et 26 cas humains dans le sud de la France en 2018. Le VWN est retrouvé tous les ans dans le sud de la France. Sa transmission est assurée par les moustiques du genre Culex. Le réchauffement climatique impactant la distribution des espèces de moustiques, la répartition géographique de certains agents vectorisés par ces derniers, dont le VWN, peut se voir modifiée dans les prochaines années. La compréhension des mécanismes de la virulence chez l’hôte vertébré permet d’anticiper et de réagir rapidement face aux nouvelles épidémies. Actuellement, malgré la présence de traitement chez l’animal, aucun vaccin n’a été développé chez l’Homme. L’étude des facteurs impliqués dans la virulence s’ancre dans une dynamique de proposition de nouvelles cibles afin de disposer de solutions vaccinales. La souche WN Israël 1998 est considérée comme très virulente chez l’oiseau, tandis que la souche WN Italie 2008 est faiblement virulente. Des outils innovants en laboratoire ont rendu possible la génération de VWN modifiés, appelés chimères, par un assemblage artificiel de régions génétiques d’intérêts issus de ces deux souches et potentiellement impliquées dans la différence de leur virulence. Ces chimères ont déjà fait l’objet d’une étude dans des modèles cellulaires en laboratoire. Mais le VWN a la capacité à infecter le système nerveux. Cette capacité neuroinvasive ne peut s’étudier qu’à l’aide d’un modèle in vivo. L’évaluation de la virulence de ces chimères sur un modèle murin permettra de mieux comprendre le mécanisme de virulence de ces deux souches et d’identifier les facteurs génétiques potentiellement impliqués dans la virulence chez les vertébrés.
Bénéfices attendus
Nous avons choisi d’étudier la différence de virulence (dangerosité, capacité à se répliquer et à entraîner une possible mortalité) engendrée par la souche WN Israël 1998 et la souche Italie 2008 en modifiant leur génome. Pour cela, nous avons décidé d’échanger une partie de génome d’un virus avec une partie du génome de l’autre virus afin de reconstituer un génome entier, modifié, comprenant d’une part des fragments du premier virus et d’autre part des fragments du deuxième virus. Nous avons eu recours à une méthode au laboratoire permettant de remplacer un fragment génomique du virus Israël 1998, par le même fragment mais issu du virus Italie 2008. Ces virus ayant une virulence différente, cela permet de comprendre quel fragment peut être responsable d’une virulence amoindrie chez Italie 2008 par rapport à Israël 1998. A plus long terme, cette étude permettra d’identifier de nouvelles cibles pour la lutte antivirale.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles (à la queue ou à la joue) ou sur souris anesthésiés (au sinus rétro orbital) par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement dure quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlés tous les jours.
Impact sur les animaux
Les souris sont sensibles à l’infection par WNV. Les signes cliniques décrits sont la perte de poids, perte d’équilibre et de motricité d’un membre, paralysie et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours puis 2 fois par jour dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices.
Devenir
West Nile est un virus de classe 3, zoonotique. Les souris peuvent mourir de l’infection. Toutefois, un point limite (moment à partir duquel l’expérimentation sera arrêtée) est défini pour cette procédure expérimentale à savoir la présence simultanée de deux signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte d’appétit, poils ébouriffés, dos voûté, perte d’équilibre, perte de certaines capacités motrices. Dans le cas où les souris n’ont pas présenté ces signes avant la fin de l’expérimentation, elles seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes, et l’analyse de la quantité de virus dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Les différences de comportement des constructions virales réalisées entre les virus WN Israël 1998 et Italie 2008 ont d’abord été étudiées sur des modèles alternatifs (culture cellulaire). Cependant, le modèle in vitro ne permet pas d’évaluer le pouvoir infectieux (développement de signes cliniques, présence de virus dans la circulation sanguine), la localisation du virus dans un organisme (« préférence ») et la virulence (mortalité). Le modèle in vivo est nécessaire pour cette étude.
Réduction
Au total 60 souris maximum seront impliquées dans ce projet d’étude. Six groupes seront constitués. Cinq souris seront utilisées par groupe afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement et scientifiquement. Le nombre de 5 souris par groupe nous permettra d’analyser les résultats obtenus au cours de cette procédure expérimentale par des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis pour une comparaison de moyennes d’échantillons indépendants (quantité moyenne de virus retrouvé dans le sang à un temps donné, suivi de mortalité), test t pour une comparaison de moyenne entre seulement deux échantillons,...). Un résultat sera considéré comme statistiquement significatif si la valeur « p » est strictement inférieure à 5% (p < 0,05). Un duplicat pourra être effectué en cas de la non infection des souris ou bien réaliser la même étude pour d’autres virus West Nile modifiés avec des facteurs génétiques d’intérêts.
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton). Une surveillance bi-quotidienne des animaux est mise en place à compter de l’apparition des premiers signes cliniques. Un point limite a été défini pour décider de la mise à mort d’animaux trop sévèrement atteints, à savoir la présence simultanée de deux des signes cliniques suivants: perte de poids supérieure à 15%, perte de poids, poils ébouriffés, dos voûté, troubles de la coordination des mouvements, perte d’équilibre, perte de motricité.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour le virus West Nile, de par sa grande sensibilité à l’infection après inoculation par différentes voies. Elle développe généralement des signes neurologiques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris auront entre 7 et 8 semaines. Les souris seront donc des adultes et cela facilitera les prélèvements sanguins car elles seront plus grosses.