Recherche appliquée

13 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules ou de fragments tumoraux en sous-cutané, puis des administrations répétées de substances, pour tester l'efficacité d'anticancéreux pour le compte de clients industriels ou de laboratoires. Le porteur indique que le développement tumoral peut provoquer perte de poids, hypothermie, épanchement abdominal et difficultés respiratoires. Il décrit une activité de prestation commerciale et affirme que ce modèle ne peut "pas être remplacé" par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeure et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Le modèle d’injection de cellules en sous-cutané, dit hétérotopique, permet d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments peuvent facilement être évaluées grâce à un suivi cinétique de la croissance tumorale par des mesures au pied à coulisse. Bien que la greffe de cellules ou de tissu cancéreux n’est pas réalisée dans l’organe d’origine dont est issue la tumeur, ce type de modèle a pu montrer un caractère prédictif satisfaisant afin d’identifier des molécules à activité thérapeutique pour la clinique humaine, qui en fait un modèle standard de la recherche en oncologie. La procédure décrite dans ce projet correspond à la création de différents modèles de tumeurs chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est d’administrer des cellules tumorales issues de différents types de tumeurs et de mesurer différents critères (taille de la tumeur, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles. La création de ce type de modèle dans ce projet ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration. Dans ces buts, la procédure consistera à injecter des lignées cellulaires humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), des cellules primaires obtenues à partir biopsies de patients ou d’explants tissulaires en sous cutané chez des animaux immunocompétents (souris ou rats), immunodéprimés (souris ou rats), transgéniques ou humanisés dépendant du modèle. Un suivi de la croissance du volume tumoral sera réalisé avec un pied à coulisse ou d’autres modalités d’imagerie par bioluminescence ou fluorescence (utilisant des cellules reportrices adaptées à ce type de modalité) mais aussi par rayons X ou échographie. De plus, le poids et l'état général des animaux seront suivis au cours du temps. Cependant les modèles de mélanome, aussi injectés en sous cutanés, ne seront pas considérés dans ce projet car induisent la formation de métastases agressives. Les animaux présentant une immunodéficience nécessitant un cloisonnement ou certains animaux transgéniques seront hébergés en condition Biosafety level 2 (BSL2) afin de maintenir leur statut Specific and Opportunistic Pathogen Free (SOPF) et éviter toutes contaminations chez ces animaux plus sensibles.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 10 min pendant laquelle ils seront tatoués dans la pulpe de leurs doigts en utilisant une aiguille imbibée d’encre de tatouage pour animaux. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude. - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance. - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et ne permettent pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réaliser en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères.... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclue une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à postériori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Des études de ces aberrations et la compréhension de leur contribution à la physiopathologie du cancer sont nécessaires pour améliorer le diagnostic et la thérapie. Aujourd’hui encore, les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. Tous les animaux utilisés seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris.

12 porcs Landrace d'environ 28 kg vont être utilisés, et chacun subit en quatorze jours trois anesthésies générales, une laparotomie avec création de stomies sur l'intestin, sept prises de sang, trois IRM, trois biopsies et la pose d'un dispositif médical changé toutes les 72 heures sous sédation. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et tous les porcs sont tués à J14, après la dernière IRM. Le porteur écrit que chaque porc "sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif", ce qui fait de lui son propre témoin. Le but est de lever "les derniers risques" d'un appareil de réinstillation du chyme destiné aux patients porteurs d'une double entérostomie, avant une demande d'essai clinique puis la mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité d’un nouveau dispositif médical intestinal. Cette étude sur le gros animal permettra de lever les derniers risques liés au dispositif et de confirmer son fonctionnement en conditions physiologiques. Les performances de l’appareil seront objectivées par l’évaluation des bénéfices nutritionnels et l’étude de la morphologie intestinale. Les conclusions de cet essai permettront également d’optimiser l’appareil afin de proposer aux patients un produit fini, sécurisé et adapté à leurs besoins.

Bénéfices attendus

Cet essai nous permettra de confirmer les bénéfices nutritionnels de la réinstillation sur un gros animal. Des données microscopiques (Biopsies intestinales) et macroscopiques (poids, selles, prise de sang) seront collectées afin d'observer le changement morphologique de la muqueuse intestinale et l'évolution d'état nutritionnel de l'animal. Nous confirmerons que l'hypothèse de la réinstillation est efficace pour corriger l'insuffisance intestinale en augmentant la capacité d'absorption intestinale. Cet essai sera également une opportunité de confirmer la tenue du dispositif médical en conditions physiologiques ainsi que ses performances.

Procédures

Tous les animaux subiront : - 3 anesthésies générales (J0, J7, J14) - La pose d’un cathéter lors du premier bloc opératoire (J0) - Prélèvements sanguins (7 prélèvements : J0, J2, J4, J7, J10, J12, J14) - 1 laparotomie avec mise en stomie et création d’une jéjunostomie d’alimentation (J0) qui resteront en place pendant tout l’essai -1 radiographie d’opacification (J7) -Pose du DM sous anesthésie générale (J7) et changement sous sédation -3 IRM (J0, J7, J14) -3 biopsies, pendant l'opération sous Anasthésie Genérale (J0, J7, J14)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables correspondent aux points limites nécessitant l’euthanasie de l’animal, c’est-à-dire : L’observation simultanée de 3 points limites, qui persisteraient au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. La présence d’une blessure OU d’une stomie bouchée, enflammée, gonflée OU un saignement au niveau de la muqueuse OU une température corporelle élevée qui persisterait au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. Une respiration pénible nécessitant l’euthanasie immédiate de l’animal.

Devenir

Les procédures 1 et 3 seront réalisées dans le même temps opératoire. A l’issu de l’intervention, l’animal sera gardé en vie. La simulation du grêle court d’amont impose de maintenir l’animal en vie tout au long de l’expérience. Les procédures 4 et 5 regroupent la pose du DM et le changement toutes les 72h. L’animal doit rester en vie tout au long de la pose du DM afin d’observer l’évolution des différents paramètres nutritionnels, physiologiques et morphologiques. L’animal sera euthanasié à l’issu de la dernière IRM de masse graisseuse réalisée à J14 avant sacrifice (procédure 2).

Remplacement

Ce nouveau dispositif propose une nouvelle prise en charge thérapeutique qui doit être scrupuleusement validée. La mise à disposition d’une nouvelle technologie impose de rassembler des données pré-cliniques solides en termes de sécurité et de performances, notamment en vue d’une demande d’autorisation d’essai clinique sur l’Homme puis la mise sur marché. Ainsi, il est essentiel de réaliser des essais sur l’animal afin de valider le fonctionnement du dispositif en conditions physiopathologiques.

Réduction

Depuis le début du projet, aucun animal n’a été utilisé. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons réalisé un ensemble de tests sur banc d’essai (mannequin en plastique avec fabrication artisanale d’un système digestif). Aussi l’animal sera son propre témoin. Il sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif. Les résultats obtenus dans les deux situations seront comparés. Cette stratégie nous évitera de construire un groupe témoin et un groupe de test. Enfin, nous reproduirons scrupuleusement les conditions d’un intestin interrompu avec carences nutritionnelles partielles selon un modèle déjà validé et publié par une équipe de chercheurs allemands. La mise en œuvre de ce protocole nous évitera une étape de validation préalable sur un modèle animal.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 11 jours est prévue à l’arrivée du porc afin de réduire le stress de l’animal. En postopératoire, le porc sera extubé dès lors qu’il aura commencé à respirer spontanément. Les étapes chirurgicales seront réalisées sous lampe chauffante. Le porc sera ramené dans la cage lorsque la température corporelle physiologique sera atteinte (39–39.5°C). Les animaux auront un accès immédiat à l’eau et à la nourriture dès le premier jour postopératoire. Une voie veineuse centrale sera conservée en postopératoire à des fins de prélèvements sanguins. Pour éviter d'endommager le cathéter central, les animaux seront gardés dans des cages séparées, dans la même pièce. La voie centrale sera protégée par un pansement pour éviter toute blessure de l’animal. L'ensemble des procédures sera fait par du personnel formé, les animaux traités avec soin (traitement de la douleur lors du suivi, anesthésie) et dans un hébergement répondant à leurs besoins physiologiques (température, cycle de lumière 12h-12h, ...) et éthologiques (enrichissements, dimension des boxes...).

Choix des espèces

Pour une approche de recherche ciblée et spécifique d'un syndrôme de grêle court d'amont, un modèle animal approprié est nécessaire. Nous considérons les avantages et les inconvénients de chaque modèle afin de sélectionner le modèle le plus adapté. A cet effet, à la fois un petit modèle animal, tel que le rat, ou un grand modèle animal, tel que le porc, conviendraient. Nous considérons également la taille de notre dispositif. Les porcs ont de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Le modèle porcin constitue le modèle expérimental le plus approprié pour la recherche sur le syndrôme du grêle court d'amont et utile pour tester l’efficacité et la sécurité de ce dispositif destiné à l’utilisation humaine. Ainsi, des porcs Landrace pédiatriques pesant environ 28-29 kg seront utilisés pour la réalisation de ce projet.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie quatre injections sous-cutanées dorsales, dont une de LPS destinée à déclencher une inflammation, pour évaluer un hydrogel chargé en lipoxine A4. Le porteur indique que le dispositif peut gêner les mouvements des animaux et prévoit une mise à mort par dislocation cervicale afin de prélever la membrane. Il affirme qu'il est "nécessaire" de travailler sur des systèmes biologiques complexes, les applications en dentisterie restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Le contexte clinique du projet est celui de maladies inflammatoires orales (inflammation pulpaire = pulpite et inflammation parodontale = parodontite). Les parodontites et les pulpites sont des maladies respectivement du parodonte (tissu de soutien de la dent) et de l’endodonte (tissu conjonctif situé à l’intérieur de la dent). Ces deux affections sont très fréquentes, génèrent des douleurs, des pertes dentaires, une altération de la qualité de vie et des coûts pour les individus et la société. Dans ces deux situations, des microorganismes sont à l’origine d’une inflammation des tissus conjonctifs constitués par le parodonte et par l’endodonte. Cette réaction inflammatoire est au départ normale et a pour objectif un retour à la normale appelée « homéostasie ». L’homéostasie fait intervenir des médiateurs spécialisés appelés « médiateurs lipidiques pro-résolutifs » tels que les « lipoxines ». Ces dernières ont été étudiées in vitro et in vivo, et ont montré́ une action efficace à différents niveaux de la réponse immunitaire.De plus, les lipoxines ont été étudiées dans différents contexte inflammatoire (maladies auto-immunes, cancers, parodontites...) sur des modèles animaux. Pour répondre à ces besoins, nous avons créé un dispositif (hydrogels) permettant la libération in situ des LXA4. L’objectif du projet est donc d’évaluer le caractère anti-inflammatoire de notre proposition thérapeutique. Pour cela, nous utiliserons le modèle murin de poche d’air sous-cutané (air pouch). Nous induirons la formation d’une cavité en injectant de l’air stérile en sous-cutané au niveau dorsal puis nous procèderons à l’injection de nos hydrogels plus ou moins chargés en LXA4 avant de simuler une inflammation. Ce modèle est pertinent car il permet d’étudier les composants de l'inflammation, la résolution de la réponse inflammatoire, la réponse au stress oxydatif et par conséquent les cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Ce modèle nous permettra d’induire une inflammation dans un système global ce qui n’est malheureusement pas possible avec les expérimentations in vitro. Nous pourrons alors évaluer l’effet anti-inflammatoire de nos hydrogels chargés en LXA4. Les médicaments anti-inflammatoires actuellement disponibles, ont pour objectif d'atténuer une inflammation excessive sans compromettre la défense de l'hôte. Les nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant des LXA4, qui améliorent la résolution de l’inflammation pourraient avoir un meilleur rapport bénéfice/risque. A court terme ce protocole nous permettra de répondre à plusieurs questions. Tout d’abord, nous pourrons choisir une formulation d’hydrogel, la plus efficace pour favoriser la résolution de l’inflammation. Nous pourrons également valider l’effet de la LXA4 in vivo dans un système complexe et non seulement in vitro sur les macrophages. Notre proposition peut également être avantageuse par rapport à d'autres systèmes d'administration de médicaments (tels que des nanoparticules synthétiques) qui ont des effets toxiques indésirables potentiels. A plus long terme, ce protocole marquera une avancée dans l’élaboration d’un système complexe permettant de relarguer des molécules anti-inflammatoires telles que la LXA4 de manière contrôlée dans le temps. En clinique, l’objectif final sera d’apporter une alternative supérieure en termes de cicatrisation et de régénération des tissus concernés dans le cadre des pulpites et parodontites. Bien que notre perspective se concentre sur le domaine de la dentisterie, l'utilisation de notre proposition thérapeutique pourrait être déployée afin de traiter de multiples maladies inflammatoires et/ou des défauts osseux.

Procédures

Injections sous cutanées sur animaux anesthésiés sous isoflurane : 4 injections / souris (2 injections d’air + 1 injection hydrogel / contrôle + 1 injection LPS). Chaque injection prendra quelques secondes. Les animaux seront observés après chaque injection pour s'assurer de leur bonne santé.

Impact sur les animaux

Ce modèle bien décrit, entrainera une inflammation contrôlée du tissu sous cutané au niveau de la poche dorsale. Ce protocole de classe modérée ne devrait pas conduire à des effets indésirables ou douloureux pour les animaux bien qu’ils peuvent néanmoins entraîner une gêne dans les mouvements et déplacements des animaux. La lipoxine A4 n’est pas un produit irritant (information vérifiée dans la fiche de données de sécurité du produit fourni par Cayman). Nous resterons bien évidemment très attentifs sur tout comportement anormal des animaux de manière à soulager leur douleur si celle-ci venait à apparaître.

Devenir

Mise à mort par dislocation cervicale pour tous les animaux. Les animaux doivent être mis à mort afin de pouvoir récupérer la membrane de la poche créée et ainsi d'effectuer les analyses histologiques post mortem nécessaires à notre projet.

Remplacement

Cette étude prend en compte la règle des 3R. Les expériences in vitro ne permettent malheureusement pas de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs cellulaires (macrophages, neutrophiles, monocytes…) et les différents systèmes (immunitaires, vasculaires…). Il est donc nécessaire de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors de la réponse inflammatoire.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les formulations d’hydrogels ont été testées et sélectionnées en amont pour leur biocompatibilité et leur caractère anti-inflammatoire in vitro. Compte-tenu d’études comparables déjà effectuées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=6). L’épaisseur de la membrane de la poche sera comparée dans les différents groupes par une analyse de variance puisqu’il s’agit de valeurs quantitatives indépendantes. Le même type de test sera utilisé pour la comparaison de la quantité de leucocytes présents dans l’exsudat. Le fait de répéter les expérimentations selon l’homogénéité des premiers résultats permettra d’étudier la reproductibilité des effets observés.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse, les animaux seront manipulés plusieurs jours avant l’expérimentation dans un but d’habituation et leur environnement sera enrichi (alpha-dri). Les souris seront hébergées à raison de 5 souris par cage. Nous raffinerons également en réduisant les éventuelles douleurs via des antalgiques (buprénorphine) lors des expérimentations afin d’améliorer la reproductibilité et la qualité des résultats obtenus. Les souris seront observées et pesées quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérimentation. Par ailleurs, des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en œuvre lors de l’atteinte de ces points limites ont été décrites. Enfin, les analyses menées sur chaque animal seront complètes : d’une part l’exsudat sera récupéré pour analyse des cytokines et de l’expression génique des cellules, et d’autre part la membrane sera récupérée pour analyses histologiques

Choix des espèces

L’utilisation de souris est justifiée puisque le modèle d’injection d’air stérile sous-cutané a été développé chez cet animal de manière rapide et reproductible. Ces modèles sont décrits et reconnus dans le domaine de l’inflammation. Les animaux reçus auront 6 semaines, ils auront une semaine d’acclimatation dans l’animalerie avant le début du protocole. Les souris auront donc 7 semaines au début du protocole et 8 semaines à la fin du protocole. Ce choix correspond à notre volonté de travailler sur de jeunes adultes afin d’éviter les effets liés à la sénescence, de plus cela correspond aux protocoles standards retrouvés dans la littérature concernant ce modèle d’inflammation.

360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie cérébrale leur implante des canules profondes, suivie de sessions de prélèvement de trois à quatre heures reliées par des câbles et d'un isolement post-opératoire. Le projet mesure l'effet de candidats médicaments sur l'activité cérébrale, le porteur qualifiant la technique de "translationnelle". Il affirme que les cultures de neurones ne suffisent pas et que le retrait de la canule laisserait des lésions "non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions".

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines conditions psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser certaines substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients atteints de maladies neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le petit animal.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. Lors de la collecte des microéchantillons ou dialysats, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène (les durées de sessions de perfusion/prélèvement sont en général de l'ordre de 3 à 4 h). Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique.

Impact sur les animaux

Des douleurs peuvent être liées à l'implantation d'électrodes au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Suite à la chirurgie, les animaux sont isolés pour protéger la canule de microdialyse (cependant, ils gardent un contact visuel, sonore et auditif avec leurs congénères). Les animaux peuvent perdre du poids ou une plaie peut se former au niveau de la zone d'implant en raison d'une infection post-chirurgicale. Lors du test, les animaux sont connectés pendant plusieurs heures à des cables pendant la diffusion du perfusat et la collecte du dialysat suite à l'administration d'une substance pharmacologique.

Devenir

Les rongeurs seront euthanasiés à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisées, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait de la canule implantée pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux; les tests qui seront appliqués ne sont pas encore connus (mise en place de la technique), des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux reçoivent un traitement analgésique général au début de la chirurgie puis pendant 48 h et un traitement analgésique local supplémentaire pendant la chirurgie. Lors de la chirurgie, l'implantation d'une canule peut induire une hémorragie. Si cette dernière ne peut être maitrisée, l'animal sera euthanasié. Suite à la chirurgie, les animaux vont être pesés quotidiennement pendant 48 heures pour évaluer leur récupération. Un rat montrant une perte de poids supérieure à 15%, des signes de souffrance (poil hérissé, manque de toilettage) ou une atteinte locomotrice (démarche anormale, chutes...) sera euthanasié. Les conditions d'hébergement sont également optimisées avec la présence d'un enrichissement adapté (bois à ronger par exemple). Les animaux isolés sont hébergés dans des cages transparentes leur permettant de voir, sentir et entendre leurs congénères. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. Il arrive que l’animal se gratte au niveau de l’implant, endommageant les tissus autour de l’implant. Dans ce cas, l’animal est désinfecté quotidiennement avec une solution antiseptique. Un antibiotique peut être administré, le cas échéant.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalablement réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et à la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Le choix de l'espèce peut aussi être lié au modèle expérimental choisi. Par exemple, certains modèles mimant la maladie de Parkinson ont été préférentiellement développés chez le rat. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique).

135 flets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés en estuaire par pêche électrique, ils sont exposés un mois à un cocktail de pesticides par balnéation, puis tués pour prélever leur foie. Le projet vise à valider des biomarqueurs de la qualité des eaux estuariennes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à des poissons vivants et qu'il n'a "pas d'autre alternative".

Objectifs

Le projet présenté vise à évaluer l’impact d’un mélange de pesticides sur le flet un poisson plat communément trouvé dans les estuaires. Le poisson sera exposé pendant un mois à des doses sublétales de pesticides reflétant les concentrations classiquement retrouvées dans un estuaire dont le bassin-versant est soumis à une forte pression agricole. La procédure expérimentale développée, incluant deux niveaux d’exposition et un groupe témoin non exposé, permettra d’isoler les effets des pesticides des différents stress naturellement subis par le poisson dans la nature. L’objectif est d’identifier les modifications métaboliques du flet en réponse à cette exposition aux pesticides. Les résultats obtenus permettront de valider des biomarqueurs dont la dérégulation, chez des poissons prélevés dans la nature, est le signe de la présence de pesticides. Ce projet permettra donc, à terme, d’améliorer les procédures d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes.

Bénéfices attendus

La procédure expérimentale proposée permettra de décrypter les mécanismes moléculaires de la réponse, et les réorientations métaboliques mises en place par les poissons face à une contamination à des pesticides, à des concentrations classiquement observées dans des estuaires présentant des bassins versants dominés par les activités agricoles. La connaissance fine de ces mécanismes permettra de mieux comprendre les impacts des pesticides sur les espèces vivant en estuaire, mais également de développer de nouveaux biomarqueurs qui, caractérisés dans des poissons prélevés in natura, permettront d'augmenter l'efficacité des procédures d’évaluation environnementales applicables à ces écosystèmes qui revêtent une importance sociétale, écologique et économique considérable.

Procédures

Les nuisances prévues au cours de cette procédure expérimentale sont : - une session de pêche électrique (narcose légère) de 2-3 heures pour capturer les poissons en milieu naturel, - le transport jusqu’au laboratoire (1h30 maximum) dans des bacs de 150L, - les biométries effectuées en début d’expérience sur les individus sédatés et anesthésiés (1h en tout), - l’exposition par balnéation d’un mois à 2 concentrations de mélange de pesticides, une faible et une forte. Les poissons seront placés dans des bacs de 20L d’eau de mer, avec un renouvèlement de l’eau et des pesticides tous les 2 jours pour la moitié du volume d’eau, soit 10L.

Impact sur les animaux

Les juvéniles de flets subiront un choc électrique afin de permettre leur capture en milieu naturel. Il s’agit d’une narcose légère, de faible intensité pendant une dizaine de seconde, qui permet d’attraper les poissons avec un haveneau sans causer de stress majeur chez les individus. De plus, les poissons subiront un léger stress lors de leur transport jusqu'au site expérimental, mais cela ne durera qu’au maximum 1h30. Enfin, les poissons seront soumis à un léger stress pendant 1 mois, dû à la contamination aux pesticides.

Devenir

A la fin de l’exposition aux pesticides, l’ensemble des poissons de la procédure (contaminés et témoins) seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires aux analyses pour mener à bien la présente étude.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’étudier les dérégulations métaboliques des poissons exposés à un mélange de pesticides qui s’approche des conditions naturelles. L’organe ciblé pour approfondir les réponses moléculaires du poisson par une approche de protéomique est le foie. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux vivants, les poissons ne pouvant être remplacés par un modèle informatique, des invertébrés ou un tissu isolé. Par ailleurs cette procédure expérimentale au laboratoire sur poissons doit nous permettre d'affiner nos interprétations sur la réponse du poisson in natura aux stress environnementaux; nous n'avons donc pas d'autre alternative.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux prévu pour ce projet, le nombre de poissons utilisés et mis à mort pour cette procédure expérimentale est de 15 poissons par bacs, pour 9 bacs de 20L, soit 135 individus. Ainsi, la densité de poissons par bassin d’élevage sera inférieure à 10kg/m3 ce qui n’est pas considéré comme une densité génératrice de stress. De plus, cela correspond au minimum nécessaire à la robustesse des tests statistiques qui seront utilisés pour comparer les différentes conditions expérimentales et pour limiter la variabilité individuelle. En outre, le prélèvement en milieu naturel de 135 poissons constitue un nombre relativement faible d’individus, ce qui n’aura aucun impact sur la démographie de la population naturelle de flets de l’estuaire où seront échantillonnés les poissons.

Raffinement

Avant le début de la procédure, les flets seront maintenus une semaine dans des grands bacs de 300L pour acclimatation et traitements antibiotiques, si nécessaire. Les poissons seront ensuite placés dans les bacs expérimentaux de 20L, par lot de 15, pendant 1 semaine avant de lancer la procédure dans lesdits bacs. Ces bacs sont partiellement opaques et sont oxygénés en continu grâce à des pompes à air. Les poissons seront par la suite exposés aux pesticides par balnéation en introduisant directement les pesticides dans les bacs, à partir d’une solution mère liquide. Une surveillance quotidienne de l’état de santé sera également mise en place lors de l’expérience. Elle aura lieu le matin, lors du nourrissage des poissons, et en fin de journée. Les flets présentent des marqueurs de stress tels que le changement de couleur ou une altération du comportement pour la prise de nourriture, pouvant être utilisés comme points limites. Ainsi, si un individu présente de couleur sombre et des difficultés de nage, reste plaqué au fond du bac et ne s’alimente pas pendant 3 jours consécutifs, il sera considéré en état de souffrance, et de facto sorti du protocole expérimental et mis à mort. Cette décision sera prise en concertation avec le responsable du projet et la responsable(s) du bien-être des animaux. Une feuille de suivi des poissons sera complétée quotidiennement tout au long de la procédure. Cette fiche comportera un suivi des paramètres physico-chimiques (température, concentration en oxygène, pH, salinité) ainsi que l’état des poissons (problèmes de nage, position dans la colonne d’eau, prise alimentaire, changement de couleur, perte d’écaille, état des nageoires, lésions cutanées et parasites). Le nombre de poissons morts, moribonds, prélevés et restant dans les bacs d’exposition sera également relevé. Enfin, afin de limiter le plus possible le stress des poissons lors des manipulations, ils seront sédatés et anesthésiés un bac opaque avec couvercle prévu à cet effet et manipulés sur un linge humide pour protéger les écailles et la peau.

Choix des espèces

Le flet a été choisi pour cette procédure expérimentale car cette démarche s’intègre au sein d’un projet visant à optimiser des méthodes d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes Le flet est une espèce sentinelle de la qualité des eaux estuariennes, particulièrement étudiée à l’échelle de l’Europe ; cette espèce est présente en abondance dans les estuaires de la côte Atlantique. Le flet est considéré comme un très bon enregistreur de son environnement, en milieu naturel comme au laboratoire.