Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Modèles murins de xénogreffe de cellules tumorales de mésothéliome pleural malin pour tester de nouvelles stratégies d’inhibition de l’IL-34
- Recherche appliquée
- Cancers
108 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une tumeur de mésothéliome pleural humain leur est implantée sous anesthésie, avec un suivi par bioluminescence sous anesthésie jusqu'à dix fois et de multiples injections d'un traitement, avant une analyse terminale du sang et de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur développée peut gêner les déplacements des animaux sans, selon lui, affecter leur alimentation. Il présente le développement d'un nouveau traitement comme "indispensable" et affirme ne recourir aux animaux qu'après validation de la molécule sur cellules en culture.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’un nouveau traitement bloquant l’Interleukine 34 (IL-34) dans des modèles de mésothéliome pleural malin. En effet, le mésothéliome pleural malin est un cancer de la plèvre très agressif (médiane de survie < 1 an) pour lequel le seul traitement est une combinaison de chimiothérapie peu efficace. Il est donc indispensable de développer de nouveaux traitements pour ces patients. Plusieurs études récentes ont montré l’importance de l’IL-34, un messager du système immunitaire, dans la mise en place de l’immunosuppression au sein des tumeurs ainsi que dans la mise en place des mécanismes de résistance à la chimiothérapie. Dans ce contexte, nous développons plusieurs stratégies bloquant l’IL34 afin d’empêcher l’interaction avec ses récepteurs. Au cours de ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité d’une de ces stratégies pour empêcher l’initiation ou lever les effets délétères induits par l’IL-34 : l’immunosuppression via le microenvironnement tumoral et la résistance à la chimiothérapie. Cet antagoniste de l’IL34 sera testé dans un modèle murin de mésothéliome pleural malin mimant la pathologie par l’association de cellules tumorales issues de patients avec des cellules du microenvironnement tumoral. Cette étude sera réalisée chez la souris sur un maximum de 108 animaux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont dans un premier temps la mise en place d’un modèle de mésothéliome pleural malin le plus représentatif de la pathologie et de la problématique thérapeutique qui permettra l’évaluation thérapeutique de notre antagoniste de l’IL-34 mais qui pourra également par la suite servir à tester d’autres stratégies en développement dans notre équipe ou par des collaborateurs. L’étude de l’efficacité de notre antagoniste de l’IL-34 nous permettra dans un premier temps de l’optimiser en fonction des résultats obtenus puis dans un second temps d’envisager un transfert vers la clinque afin de proposer un nouveau traitement au patients atteints de mésothéliome pleural malin, particulièrement ceux en échec thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis à au moins une anesthésie générale pour l’implantation des cellules tumorales. Les animaux dont le suivi du développement de la tumeur sera fait par bioluminescence seront anesthésiés à chaque suivi : estimé entre 2 et 10 fois selon la vitesse de développement de la tumeur et l’efficacité du traitement lors de la dernière procédure. Cette analyse par bioluminescence dure environ 10 min dont 1 min d’acquisition et durant toute la procédure les animaux sont placés dans un environnement chauffé afin de maintenir leur température corporelle.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’implantation de la tumeur. L’implantation de la tumeur, bien que réalisée sous anesthésie et analgésie, peut conduire à une douleur légère et de courte durée aux animaux. Une fois la tumeur développée à un stade avancé il est possible qu’elle provoque une gêne aux déplacements des animaux mais sans conséquence sur leur alimentation …. Les points limites de l’expérience seront bien sûr adaptés dans le cas, peu probable, où le développement de la tumeur induirait un changement important du comportement lié à la douleur ou autre. Le suivi des animaux sera notamment réalisé grâce à la bioluminescence via la luciférase ce qui nécessitera l’injection du substrat et l’anesthésie des animaux une fois par semaine pouvant générer du stress. De plus, la réalisation du traitement nécessitera de multiples injections qui peuvent également induire une douleur légère et éphémère ainsi qu’un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser une analyse terminale sur le sang et la tumeur.
Remplacement
L’utilisation d’animaux démarrera seulement une fois que notre molécule sera parfaitement caractérisée et son efficacité validée dans plusieurs modèles artificiels réalisés sur des cellules en culture au sein du laboratoire.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étape sera réalisée successivement et les modèles/protocoles les plus pertinents seront finement sélectionnés à chaque étape. Chaque protocole sera réalisé dans un premier temps sur un petit nombre d’animaux avec le nombre minimum de groupe. Si la stratégie fonctionne, elle sera alors reproduite pour confirmer les résultats et le cas échéant des groupes contrôles seront ajoutés. Nous nous limiterons à 7/8 animaux final par groupe, nombre suffisant pour attester d’une efficacité thérapeutique validée par des tests statistiques.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum le stress des animaux, les souris sont maintenues en groupe sociaux (3 à 5 individus par cage), dans un environnement enrichi (frisottis + cabane transparente rouge) et observés quotidiennement afin d’identifier tout changement de comportement lié au stress ou à la douleur et mis à mort en cas de souffrance. L’injection des cellules tumorales et le suivi des animaux par bioluminescence sera réalisé sous anesthésie générale et anti-douleur local. De nombreux critères incluant le poids, le comportement des animaux et la taille de la tumeur nous permettrons de déterminer le stade de la tumeur à ne pas dépasser afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer le bénéfice de nouvelles stratégies antitumorales, de par leur facilité de manipulation et leurs similitudes physiologiques avec l’homme. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (sans système immunitaire) pour éviter tout rejet de greffe. Ces souris permettent à la fois la croissance des cellules tumorales humaines et la survie des cellules immunitaires humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte afin qu’elles ai atteint leur développement complet et afin de renforcer la pertinence des modèles (cancer chez l’adulte).
Migration facultative des civelles d’anguille européenne: rôle du stress et différentiation génétique
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
2 800 civelles d'anguille européenne vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée pour analyses et le reste relâché dans son estuaire d'origine. Elles sont marquées sous anesthésie légère, triées selon leur comportement migratoire, exposées à un anxiolytique (diazépam) à dose environnementale, puis soumises à un stress mécanique en chambre respirométrique. Le porteur indique surveiller le rythme cardiaque pendant le marquage grâce à la transparence des animaux et relâcher les individus en surplus après acclimatation progressive. Il affirme que le comportement migratoire, propre à l'espèce et au stade civelle, exclut tout remplacement par une autre espèce ou une approche in silico.
Objectifs
L’objectif principal du projet est de contribuer à une meilleure compréhension de la migration facultative de la civelle d’anguille européenne en déterminant la relation au stress des individus migrants (M) et non migrants (NM) mais également en testant une approche génétique sur les deux comportements. Il est actuellement admis, lors de la migration estuarienne des civelles, que certains individus ne migrent pas en rivière et se sédentarisent en eau saumâtre, voire en zone côtière. Les raisons de cette migration facultative ne sont pas encore élucidées et l’enjeu est de taille puisque les civelles se sédentarisant donneraient plutôt des mâles tandis que les individus migrant en rivière se développeraient plutôt en femelles. Or de récents travaux suggèrent que les civelles présentant le plus de signaux de stress pourraient avoir une plus forte probabilité de sédentarisation. Notre premier objectif est de déterminer si les civelles NM : (a) présentent des signes plus importants de stress que les M (procédure 1) et/ou (b) si elles sont plus sensibles au stress (procédure 2). Les civelles M et NM seront identifiées grâce à un tri expérimental basé sur l'alternance des courants de marée. Elles seront ensuite exposées, ou pas, à un anxiolytique, le diazepam (D), afin d'obtenir un gradient de réponses. Pour l'objectif 1a, nous faisons l'hypothèse que les marqueurs de stress présenteront le gradient suivant : NM>NM+D> M>M+D. Afin de vérifier si les civelles NM sont plus sensibles au stress que les M, la consommation d'oxygène sera mesurée avant, pendant et après un stress mécanique de 2 min (objectif 1b). La consommation d'oxygène reflète en effet le métabolisme d'un individu et augmente avec le stress. Nous faisons l'hypothèse que les civelles les plus stressées verrons leur consommation d'oxygène augmenter plus fortement et/ou mettrons pus de temps à retrouver un niveau de base. Par ailleurs, les approches génétiques de la migration chez l’anguille sont encore très rares et notre deuxième objectif (procédure 3) est d'évaluer la variabilité génétique entre civelles migrantes et non migrantes. Enfin, de fortes variations du statut énergétique ont récemment été mises en évidence entre les civelles d'automne et de printemps ce qui pourrait entrainer des variations de réponses au stress et/ou suggérer des différences génétiques. Des analyses préliminaires sont en cours pour déterminer si il serait pertinent de réaliser tout ou partie de l'étude sur les deux saisons.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à contribuer à une meilleure compréhension de la migration facultative chez l’anguille européenne. L’enjeu est de taille car le choix de migrer ou non peut être déterminant pour le déterminisme du sexe chez cette espèce. Comprendre la relation au stress des civelles migrantes et non migrantes ainsi que leur variabilité génétique sont autant d’informations pouvant nous permettre d’anticiper le fonctionnement et l’évolution de la population dans un contexte de changement global.
Procédures
Procédure 1: 160 civelles sont marquées en sous-cutané avec de l'élastomère coloré à l'aide d'une seringue à insuline (marque d’environ 1mm). Le marquage se fait sous anesthésie légère et dure de 3 à 4 secondes par civelle. Elles sont ensuite placées dans des installations expérimentales mimant l'alternance des courants de marée pour identifier leur comportement de migration durant 4 jours. Des lots de 30 civelles migrantes et non migrantes sont ensuite exposés, ou pas, à des concentrations environnementales de diazepam durant 7 jours (concentration mesurée dans des effluents de station d’épuration en estuaire : environ 5microgrammes par litre). Procédure 2: Afin de mesurer en continu la consommation d'oxygène des civelles, 12 individus de chacun des 4 lots (M, M+D, NM, NM+D)sont placés dans des chambres respirométriques durant moins de 6h et soumises à un stress mécanique de 2 minutes (agitation). Procédure 3 : 1200 civelles sont placées 24h dans une installation expérimentale de 25m3 mimant la photopériode pour identifier leur comportement de migration. Au crépuscule, les civelles considérées comme migrantes quittent les abris et dérivent avec le courant pour être piégées en aval quelques secondes plus tard.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sur les animaux concernent essentiellement la succession de procédures (marquage, tri comportemental, exposition au diazepam, respirométrie). Néanmoins, le marquage est rapide (3 à 4s par civelle) et sous anesthésie légère permettant un réveil rapide. Le tri comportemental offre la possibilité aux civelles de rester sous abris si elles le souhaitent, l’exposition au diazepam sera faite à des doses environnementales et la respirométrie nous permet de suivre en temps réel le niveau de stress des individus afin d'intervenir rapidement en cas de problème.
Devenir
Procédure 1: Pêche de 200 individus à l'automne et au printemps. A chaque saison, 160 civelles seront marquées pour le tri expérimental afin d'obtenir 60 civelles migrantes (M) et 60 non migrantes (NM). 4 lots de 30 individus seront effectués (30 M, 30M+D, 30 NM, 30 NM+D). 18 civelles pour chacun des 4 lots seront euthanasiées pour effectuer les analyses hormonale, moléculaire et métabolomique (6 pour chaque type d'analyse). 12 seront gardées en vie pour la procédure 2. Le tri nous donne plus de migrants que de non migrants ce qui explique l'utilisation de 160 civelles initialement et non de 120. Le marquage n'entraine aucune mortalité ni modification de comportement et il s'atténue très vite avec le développement naturel de la pigmentation des civelles. De petite taille (environ 1mm), il est par ailleurs peu visible sans éclairage aux ultra-violets et une civelle marquée peut poursuivre son cycle de vie en milieu naturel tout comme les individus non marqués. Les 80 civelles en surplus (dont 40 marquées) seront donc relâchées dans leur estuaire d'origine. Procédure 2: A chaque saison, les 12 civelles de chacun des 4 lots de la procédure 1 seront euthanasiées pour analyses de marqueurs hormonaux et moléculaires après mesures de leur consommation d'oxygène. Procédure 3: 1200 civelles pêchées à l'automne et au printemps. A chaque saison, 600 civelles seront euthanasiées après tri expérimental pour l'analyse génétique. Sur chaque individu, des variabilités ponctuelles de leur séquence d'ADN seront recherchées (SNP) afin de différencier les comportements de migration (migrantes vs non migrantes). Le surplus de 600 civelles par saison issues du tri comportemental sera relâché. Des analyses préliminaires sont en cours pour confirmer l'importance ou pas d'effectuer ces procédures à la fois à l'automne et au printemps.
Remplacement
Le comportement de migration étant spécifique à l’espèce et au stade de développement, le remplacement par une autre espèce ou un autre stade n’est pas envisageable. Nous cherchons à comprendre les mécanismes du déterminisme de la migration et, à ce stade, une approche in silico n’est pas non plus envisageable.
Réduction
Compte-tenu de la nécessité de travailler à l’échelle individuelle et de la variabilité inter-individuelle observée dans les analyses hormonale, moléculaire et métabolomique, nous avons fixé les échantillonnages dans la procédure 1 à 6 individus par lot pour chaque type d’analyse. Néanmoins, une mise au point des méthodes d’analyse à l’échelle individuelle est actuellement en cours et en fonction des résultats (à l’automne), nous verrons si ce nombre peut être diminué. Concernant la respirométrie (procédure 2), nous devons augmenter à 12 individus par lot pour tenir compte de la forte variabilité inter-individuelle du métabolisme. Dans le cadre de la procédure 3, nous souhaitons analyser les variations génétiques chez de nombreux individus afin d'étudier les corrélations avec le comportement de migration (M/NM) à l'échelle individuelle. Une analyse préliminaire statistique a permis de déterminer qu'il faudrait des tailles d'échantillons >800 civelles pour détecter des différences génétiques, si elles existent. Nous pensons néanmoins raisonnable de réduire ce nombre à 600, car l’équilibre des deux classes de comportement (300 M et 300 NM) augmente la puissance de détection.
Raffinement
Les civelles d’anguille remontent les estuaires en nageant principalement de nuit avec la marée montante et en se cachant dans le substrat à marée descendante. Pour nos tris comportementaux, les animaux seront placés dans des structures leur permettant de synchroniser leur comportement sur la photopériode et/ou sur l’alternance du courant de marée. Les installations sont équipées d’abris dans lesquels les civelles peuvent choisir de se cacher et sont sous alarme électrique. L’exposition au diazepam se fera à doses environnementales (concentrations retrouvées dans le milieu naturel en sortie de station d'épuration) dans des bacs aérés et équipés de morceaux de paillasson inversés que les civelles utilisent pour se cacher. L’espèce étant lucifuge, l’intensité lumineuse dans toutes les installations sera très faible. Une aube et crépuscule seront appliqués pour éviter les changements de luminosité brutaux et permettre la synchronisation du comportement sur l’alternance jour-nuit. La température sera maintenue constante et proche du milieu naturel. Procédure 1: les civelles seront acclimatées à l'eau douce progressivement durant trois jours. Lors du marquage sous anesthésie, le battement cardiaque sera surveillé grâce à la transparence des civelles. Une arythmie, entrainera la remise instantanée de l’individu en bac de réveil. Des signes de réveil entraineront immédiatement une remise en bac d’anesthésie. Les installations sont filmées et peuvent être surveillées à distance ce qui permettra une intervention rapide si besoin. Procédure 2: lors des mesures d'oxygène en continu, un expérimentateur surveillera en permanence les bonnes conditions d'expérimentation soit en présentiel, soit en distanciel via une caméra qui filme le dispositif. Procédure 3: Les civelles resteront 24h dans une installation de 25m3. Un expérimentateur sera présent durant la journée pour surveiller le dispositif. Durant la nuit, l'installation est sous alarme et un expérimentateur peut se déplacer rapidement bien que le volume important tamponne les variations d'oxygène et de température en cas de panne. Les civelles relâchées le seront dans la partie eau douce de l'estuaire d'origine pour respecter l'acclimatation faite à l'eau douce dans nos installations. Elles seront acclimatées progressivement à l'eau de l'estuaire en mélangeant progressivement (sur une trentaine de minutes) l'eau de l'estuaire et l'eau contenant les civelles avant d'être relâchées.
Choix des espèces
Nous nous intéressons à l’anguille européenne et plus exactement à la migration estuarienne du stade civelle. Cette espèce a une importance écologique, économique et patrimoniale majeure. La civelle d'anguille doit remonter les estuaires pour atteindre les zones de croissance en eau douce et celles qui ne le font pas ont une forte probabilité de se développer en mâles. Il est donc essentiel de comprendre ce qui amène certains individus à stopper leur migration et aucune autre espèce ne peut être utilisée pour atteindre le même objectif. L'anguille européenne sera utilisée au stade juvénile (civelle) car c'est à ce stade qu'elle effectue sa migration estuarienne.
Approches thérapeutiques dans le modèle de fistule anale chez le rat traité au TNBS
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une rectite leur est induite par instillation d'une solution irritante (TNBS), suivie de la création de fistules anales par introduction de fils de suture manipulés plusieurs fois par semaine, d'administrations de composés par de multiples voies et d'un suivi par IRM. Le porteur décrit des prestations menées pour des "clients", certains animaux étant tués à la suite des effets indésirables des produits testés. Il affirme que ce modèle de rat est le "seul" disponible et un "prérequis indispensable" à l'étude chez l'humain, les alternatives in vitro étant selon lui inexistantes ou insuffisantes.
Objectifs
Les lésions anopérinéales au cours de la maladie de Crohn sont fréquentes : 1 malade sur 2 présentera une lésion anopérinéale dans les 20 ans. Les lésions anopérinéales secondaires de la maladie de Crohn (fistules simples ou complexes +/- compliquées d'abcès) ont un impact important sur la qualité de vie quotidienne des patients. Les lésions anopérinéales secondaires sont le plus souvent traitées dans un premier temps par une chirurgie en urgence associée à un traitement antibiotique. Les traitements actuelles sont insuffisants et des récidives demeurent très fréquente à court/moyen terme (>50% dans la plupart des séries). A long terme, les lésions anopérinéales de la maladie de Crohn présentent des risques évolutifs mettant en jeu la survie et la qualité de vie des patients, incluant notamment la destruction du sphincter anal et un sur-risque de cancer. L'objectif de ce projet est de tester différents traitements innovants dans le but d'obtenir une cicatrisation complète et durable des fistules dans un modèle expérimental de fistules anale chez le rat.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les fistules anales. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.
Procédures
(1) Induction d'une rectite par instillation rectal avec une solution irritante (1 fois au démarrage des études - durée 5 min). (2) Génération des fistules par introduction de fils de suture (1 fois - durée 15 à 30 min). (3) Manipulation des fils pour permettre la génération des trajet fistuleux (2 à 3 fois par semaine pendant 1 à 4 semaines - durée 2-3 min). (4) Application d'un traitement par voie orale (gavage - 1 min par administration), intrapéritonéale (1 min), sous-cutanée (1 min), transdermique (1 min), intradermique (1 min), intramusculaire (1 min), intraveineuse (1 min), transrectale (1 min) ou transfituleuse (bolus (1-2 min) ou perfusion (2-10 min)). Le composé à tester pourra également être appliqué localement par application sous forme de crème (1-2 min par application). (5) Imagerie par IRM 1 à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude (15-30 min).
Impact sur les animaux
1) Induction d'une rectite par Instillation TNBS. 2) Création de fistules anale sous anesthésie. 3) Les anesthésies pour l'imagerie IRM 4) Les effets potentiellement indésirables du/des produits font l’objet d’échange avec nos clients pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux
Remplacement
Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (10 par groupe).
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses incluant les étapes d'anesthésies et d'analgésies nécessaires • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites (échelle de scoring), • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.
Choix des espèces
Le modèle de LAP chez le rat que nous utilisons est le seul modèle disponible pour tester l'efficacité in situ de nouvelles approches thérapeutiques et est un prérequis indispensable à l'étude sur l'homme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Description quantitative des évènements moléculaires clé conduisant à une toxicité thyroïdienne pour le développement de méthodes sans animal de laboratoire
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
231 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des substances de référence connues pour perturber la thyroïde, subissent des prélèvements sanguins répétés sans anesthésie puis une autopsie du foie, de la thyroïde et de l'hypophyse. Le porteur présente le projet comme relevant du remplacement et de la réduction, l'objectif affiché étant de valider des méthodes sans animaux (NAMs) par extrapolation des données in vitro. Il reconnaît que cette validation "nécessite" malgré tout des données obtenues chez le rat, un seul sexe étant testé pour limiter l'effectif.
Objectifs
Classiquement l’évaluation de la sécurité des produits chimiques implique le recours à des études animales pour ne soumettre à autorisation que des produits dont le profil toxicologique garantit l’absence d’effet néfaste sur la santé humaine. Or cette pratique de la toxicologie est remise en question par le développement de nouvelles approches méthodologiques (connues sous l’acronyme NAMs) qui, combinant des modélisations mathématiques par ordinateurs (études in silico) et des modèles cellulaires (tests in vitro), limiteront ainsi le plus possible voir totalement le recours aux modèles animaux (études in vivo). Ce développement est encouragé par les autorités de mise sur le marché européenne (EFSA) ou américaine (EPA). Dans ce contexte, l’objectif est de développer des modèles quantitatifs d’extrapolation des données in vitro aux données observées in vivo en se focalisant sur les baisses d'hormones thyroïdiennes induites par les interactions entre le foie et la thyroïde. En effet de nombreux produits chimiques y compris des substances ingérées au quotidien comme l'alcool, mais aussi médicamenteuses, sont métabolisées dans le foie et détoxifiées. L’induction d’enzymes de détoxification a comme effet collatéral une élimination plus rapide d’hormones thyroïdiennes, notamment chez le rat qui est connu pour être beaucoup plus réactif que l’homme. Cette connaissance est habituellement obtenue par des études de toxicologie sur l’animal. Mais aujourd’hui il est possible d’envisager d’étudier le potentiel d’activité d’un produit chimique pour cet Adverse Outcome Pathway (AOP) spécifique en utilisant des outils mathématiques et des données obtenues sur essais in vitro de foie et de thyroïde. C’est l’objectif de ce projet et plus spécifiquement de créer des modèles quantitatifs d’extrapolation des données obtenues in vitro aux effets observés in vivo. En accord avec le principe des 3Rs, ce projet a pour objectif de se passer à terme d'études chez l'animal quand un produit est identifié comme affectant la thyroïde in vitro.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la création d'un modèle mathématique capable de prédire les changements d'hormones thyroïdiennes chez le rat à partir des résultats d’essais in vitro sans avoir la nécessité de conduire une étude sur l'animal. Elle s'inscrit donc à la fois dans les R=Réduction et R=Remplaçement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet contribue à la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) en lieu et place de méthodes utilisant des animaux vivants, en utilisant ici des méthodes de culture cellulaire (hépatocytes et thyrocytes) combinées à des méthodes informatiques (in silico) qui nous permettront de prédire l’effet sur les hormones thyroïdiennes en fonction de l’impact des produits sur les enzymes hépatiques mesurées in vitro et sans recourir à l’animal.
Procédures
Les animaux seront exposés aux produits administrés oralement par gavage. Ils seront maintenus en hébergement collectif pendant 7 jours. Des prélèvements sanguins seront pratiqués de manière répétée sur des volumes très réduits (moins de 100 µl) sans anesthésie. Une autopsie sera pratiquée en fin d'étude conformément aux études de toxicologie pour de multiples analyses histopathologiques et moléculaires sur les tissus prélevés, notamment le foie, la thyroïde et l'hypophyse.
Impact sur les animaux
Les effets toxiques attendus seront modérés et connus car on utilisera dans ce projet 3 substances de référence, connus pour agir directement ou indirectement sur la thyroïde en induisant une diminution de la concentration circulante en hormones thyroïdiennes. De plus on sélectionnera des doses suffisamment basses (3 niveaux de doses études) dont la plus haute soit suffisamment tolérée pour que l’étude soit valide.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et autopsiés en fin d'étude conformément aux études de toxicologie pour la réalisation de multiples analyses histopathologiques et moléculaires sur les tissus prélevés, notamment le foie, la thyroïde et l'hypophyse.
Remplacement
Le projet s’inscrit totalement dans le R de Remplaçement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet a justement pour objectif la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) pour remplacer les études utilisant des animaux par des méthodes de culture cellulaire (hépatocytes et thyrocytes) combinées à des méthodes informatiques (in silico). Elles contribueront à mettre en place un modèle prédictif pour évaluer l’effet d'un produit sur les hormones thyroïdiennes en fonction de ses effets testés in vitro sur les enzymes hépatiques. Pour valider ces nouvelles méthodes et cette extrapolation entre méthodes in vitro et méthodes in vivo, des données sont nécessaires in vitro mais aussi in vivo chez le rat d’où cette demande d’autorisation de projet.
Réduction
Le projet s’inscrit également dans le R de Réduction de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Le nombre d’animaux est réduit (231): pour le limiter au maximum, on ne testera le concept que sur un seul sexe (mâles) et rendre aussi la démonstration plus aisée en évitant l’influence des variations hormonales observées chez les femelles. Ce projet participe à l'effort de mise en place et de validation de méthodes alternatives pour réduire globalement le nombre d’animaux utilisés en Toxicologie. En effet, l’objectif est de promouvoir que les produits au profil le plus favorable et le moins risqué dans les phases avancés (celles qui nécessitent toujours l’utilisation d’animaux d’un point de vue réglementaire), en testant d’abord les produits à travers ces nouvelles méthodes alternatives. De ce fait, un nombre plus restreint de produits nécessiteront d’être testé chez l’animal et avec de plus grande chance de donner des résultats favorables, ce qui réduira de facto le nombre d’études nécessaires et donc d’animaux. Dans ce projet, le nombre d'animaux est réduit au strict minimum par type d'étude afin d'avoir une puissance statistique suffisante dans chaque procédure, à savoir 5 par groupe dans l'étude de toxicocinétique et 12 dans les études de toxicodynamie.
Raffinement
Le projet s’inscrit également dans le R de Raffinement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Les paramètres étudiés sont beaucoup plus nombreux que ceux classiquement testés dans les lignes directrices de l’OCDE, notamment en incluant des biomarqueurs moléculaires à comparer à ceux qui seront mesurés in vitro. Ces études sont réalisés avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo thyroidien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal. Les points limites ne doivent pas être atteints et si c'était le cas, ont été définis avec précision, notamment en lien avec l'état général ici (consommation alimentaire, poids de l'animal, comportement) observé tous les jours.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet rentre dans le cadre des efforts entrepris afin de remplacer les études chez l’animal utilisé comme modèle en toxicologie, à savoir le rat, par de nouvelles méthodes alternatives. Pour comparer les données générées in vitro aux observations obtenues in vivo, et ainsi valider la pertinence de nos tests in vitro, il est important d’utiliser la même espèce animale et donc utiliser le rat dans ce projet. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent de jeunes adultes (à partir de 6 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.
Impact du mycobiote sur la fragilité osseuse
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une ostéoporose leur est induite par ovariectomie ou par injection de toxine botulique provoquant une paralysie, avant un traitement antifongique dans l'eau de boisson, des injections de calcéine, un test de perméabilité intestinale et un prélèvement squelettique terminal. Le porteur affirme que l'injection de toxine botulique provoque une boiterie mais que ses études antérieures n'ont pas mis en évidence de douleur apparente. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut être développée faute de données, et présente le mycobiote intestinal comme une piste "totalement inexplorée".
Objectifs
Des études antérieures ont montré un rôle important du microbiote bactérien intestinal sur le contrôle de la masse osseuse mais également de la qualité osseuse et de la résistance à la fracture, dans les ostéoporoses. En effet, la présence d’une dysbiose bactérienne entraine soit une exacerbation de la fragilité osseuse, soit protège de cette dernière, en fonction des espèces impliquées. Les populations fongiques et bactériennes occupent des espaces similaires dans l'intestin et peuvent s'influencer mutuellement. Une question évidente, pour laquelle aucune réponse aujourd’hui ne peut-être apportée, est l’influence des souches fongiques commensales sur la survenue de la fragilité osseuse des ostéoporoses. Notre projet s’interessera à cette problématique dans un modèle préclinique murin validé et maitrisé au sein de notre laboratoire en proposant l’utilisation d’antifongique pour dépleter le mycobiote intestinale et voir la répercussion sur la fragilité osseuse.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est de faire progresser les connaissances sur le rôle du mycobiote intestinal dans la physiopathologie des ostéoporoses. Ce pan scientifique est totalement inexploré et peut représenter une piste intéressante de traitement des ostéoporoses (transplantation de mycobiote, probiotique, …). De plus, en parallèle, nous projetons de lancer une étude clinique pour étudier la diversité du mycobiote dans la population ostéoporotique par rapport à une population de même age sans fragilité osseuse. La comparaison des données entre étude préclinique et clinique permettra de mieux comprendre les relations entre les deux modèles et de valider des cibles microbiennes pour le traitement de la fragilité osseuse.
Procédures
Dans le modèle d’ostéoporose par carence en hormone sexuelle (modèle d’ostéoporose post-ménopausique), les 75 souris seront soumises à : - deux injections sous-cutanées de calcéine (10mg/kg, durée de l'injection : 30 secondes) sur animal vigile avec une contention adaptée ; - un test de perméabilité intestinale, comprenant une administration orale de dextran-FITC (durée 2 minutes) suivi d’un prélèvement sanguin unique réalisé sous anesthésie gazeuse (durée 2 minutes). Dans le modèle d’ostéoporose par paralysie à la toxine botulique (modèle d’ostéoporose d’immobilisation), les 75 souris seront soumises à : - Une injection intramusculaire de toxine botulique ou de solution saline réalisée sous anesthésie gazeuse (durée 30 secondes) - deux injections sous-cutanées de calcéine (10mg/kg, durée de l'injection : 30 secondes) sur animal vigile avec une contention adaptée ; - un test de perméabilité intestinale, comprenant une administration orale de dextran-FITC (durée 2 minutes) suivi d’un prélèvement sanguin unique réalisé sous anesthésie gazeuse (durée 2 minutes).
Impact sur les animaux
L’administration d’antifongiques dans l’eau de boisson ne devrait pas entrainer d’effets indésirables pour les animaux. L’administration de calcéine réalisée à l’aide de seringue à insuline permet de limiter le désagrément de la piqûre. L’administration de calcéine ne provoque pas d’effet indésirable à l’animal. Le prélèvement sanguin du test de perméabilité intestinale sera réalisé sous anesthésie gazeuse afin de réduire le stress aux animaux. L'administration de toxine botulique sera réalisée sous anesthésie gazeuse et provoquera une boiterie à l'animal. Cependant, nos études antérieures publiées sur le modèle n'ont pas mise en évidence de diminution de l'activité des animaux ni de douleur apparente. L'administration de toxine botulique n'entraine pas de diminution de la prise alimentaire.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie entre les actes de chaque procédure. A la fin de la procédure 1 ou 2, l’ensemble des animaux seront euthanasiés afin de pouvoir réaliser les prélèvements de tissus et de pièces squeletiques.
Remplacement
Aucune donnée dans la littérature ne permet de prédire l’impact d’une modulation du mycobiote sur la fragilité osseuse. De ce fait, l’utilisation de méthodes alternatives telles que des techniques in vitro ou in silico ne peuvent être développées et le recours à l’emploi d’un modèle de petit animal est requis pour évaluer cette question. La souris est un modèle animal reconnu d'ostéoporose peu couteux et facilement maintenu en captivité. Les modèles murins d’ostéoporoses utilisés reproduisent les mêmes modifications de tissu osseux que celles observées en pathologie humaine. Nous avons également développé et validé depuis maintenant 10 ans tous les outils nécessaires à l'étude de la qualité osseuse dans des modèles murins.
Réduction
Les modèles d’ostéoporoses induite par ovariectomie ou par injection de toxine botulique sont des modèles maitrisés au sein de notre laboratoire. Nos études antérieures dans ces modèles ont permis de réaliser un calcul d’échantillonage afin de déterminer le nombre minimum d’animaux requis pour observer une différence significative de la déformation plastique, et donc de la fragilité osseuse, dans ces modèles d’ostéoporose. En se basant sur ce calcul et pour atteindre une significativité statistique, nous avons décidé d’inclure 15 animaux par lot. Des tests statistiques seront ensuite réalisés pour vérifier si les différences observées entre les groupes sont dûes au hasard ou au traitement/intervention.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon les conditions d’hébergements au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages normalisées, placées sur des portoirs ventilés à hygrométrie et température contrôlées. Les animaux auront à leur disposition de l’eau et de la nourriture à volonté. Un cycle automatique jour-nuit de 12h-12h sera respecté. Il sera mis à leur disposition un abri et de la cellulose pour la constitution d’un nid. Des frisottis en carton et/ou des petits morceaux de bois à ronger leurs seront distribués. Une grille de points limites adaptés sera mise en place avec les critères suivants : Perte de poids, activité, posture, respiration, automutiliation, aspect des matières fécales et déshydratation. La grille est fournie en annexe 2. Un animal démontrant une somme de points limites de score 3 ou supérieur sera sorti du projet et mis à mort immédiatement. La fréquence d'observation des animaux sera journalière. Un score supérieur ou égal à 1 entrainera l’injection d'un anti-douleur par voie sous-cutanée.
Choix des espèces
Les rongeurs sont recommandés par les agences de régulation du médicament comme première approche dans l’étude des mécanismes conduisant à une ostéoporose et une fragilité osseuse. La souris est un modèle animal reconnu d'ostéoporose peu couteux et facilement maintenu en captivité. Les modèles murins d’ostéoporoses utilisés reproduisent les mêmes modifications de tissu osseux que celles observées en pathologie humaine. L’ostéoporose post ménopausique est une pathologie du sujet de plus de 50 ans. En revanche, l’ostéoporose d’immobilisation est une pathologie qui peut toucher toutes les classes d’âge d’individus. Classiquement les modèles de souris utilisés font appel à un déclenchement de l’ostéoporose autour de la 16ème semaine de vie (ovariectomie ou paralysie). Les animaux que nous utiliseront seront ovariectomisés à l’âge de 16 semaines par l’établissement éleveur. Le traitement par antifongique commencera 4 semaines après afin de laisser la fragilité osseuse s’installer. Pour le modèle d’ostéoporose par immobilisation, l’injection de toxine botulique sera réalisée à la 16ème semaine et l’administration d’antifongique dans l’eau de boisson commencera deux semaines avant l’injection de toxine botulique et durera 5 semaines.
Effets de différents traitements sur les crises fébriles et le développement d’état de mal épileptique chez le jeune animal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
224 souris juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des crises fébriles leur sont provoquées sur animal vigile pendant une heure au maximum, avec prise de température par sonde rectale et injection intrapéritonéale, pour tester des traitements antiépileptiques transposables aux enfants de moins de deux ans. Le porteur indique que les nuisances attendues sont des crises myocloniques et convulsives, un stress lié à l'isolement des jeunes animaux et à la sonde, et une douleur liée à l'injection, un état de mal dépassant quinze minutes constituant un point limite. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas les crises d'un cerveau entier et que l'étude chez l'enfant ne serait pas éthiquement acceptable.
Objectifs
Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de traitements sur les crises fébriles, un type de crise présente chez les patients Dravet. Le syndrome de Dravet est une épilepsie grave de l’enfant, qui débute avant l’âge d’un an par des crises convulsives, souvent déclenchées par de la fièvre. Ces crises fébriles sont les premières manifestations de cette maladie orpheline et les traitements actuels ne permettent pas de soulager tous les patients. De plus, les crises fébriles reproduisent un état de mal épileptique (status epilepticus) qui touche de nombreux patients. Nous proposons ici de tester des traitements aigus sur un modèle murin de crises fébriles, afin de pouvoir diminuer ces crises précoces, prédisant le développement d’une épilepsie.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de traitements anti-épileptiques sur les crises fébriles, dès le plus jeune âge et ainsi conforter l’utilisation de ces traitements chez les patients de moins de 2 ans. L’inhibition des crises fébriles aidera à contrôler le phénomène d’état de mal épileptique (status epilepticus) et ainsi à limiter ses conséquences délétères sur le développement des patients.
Procédures
Induction de crises fébriles sur animal vigile: protocole d’induction durant au maximum 1h avec prise de température par sonde rectale, tous les animaux : 224 souris Injection i.p. pour la 2ème partie : une seule injection (max 30s), 168 souris. Ces procédures seront effectuées par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Une survenue de crises myocloniques et convulsives 2) un stress dû à l’isolement des jeunes animaux et à la prise de température par sonde rectale (pendant une heure au maximum) 3) un stress et une douleur dus à l’administration intrapéritonéale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales induites par les crises ne peuvent être étudiées chez l’humain de façon éthiquement acceptable. (2) La culture cellulaire ne reproduit pas l’ensemble des propriétés des crises d'épilepsie survenant dans un cerveau entier. (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore manquantes.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord des animaux de différents âges pour sélectionner l’âge avec le plus de crises fébriles et une latence d’induction la plus faible. Selon le Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals, il nous faut au minimum 10 animaux par groupe. Cependant, les animaux étant livrés avec leur mère, leur nombre peut varier selon les portées. Nous envisageons ainsi d’utiliser au maximum 14 souris par groupe (et au minimum 10) pour utiliser tous les animaux d’une portée. Ainsi, avec 3 mères gestantes, nous attendons d’avoir entre 10 et 14 petits à utiliser.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées (une mère et sa portée par cage), enrichies avec du sizzle dry. La température et l’hygrométrie sont contrôlés. Le cycle jour nuit est de 12h, changeant à 7h et 19h. Lors de l’induction de crises fébriles, les animaux seront observés de façon continue afin de caractériser ces crises et définir l’apparition d’un état de mal épileptique (status epilepticus). Si cet état de mal dure plus de 15 minutes, cela constituera un point limite. Les administrations i.p. seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
L’espèce que nous avons choisie (souris) est le modèle animal décrit dans la littérature comme reproduisant au mieux l'épilepsie induite par la fièvre. Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les crises fébriles apparaissent chez les nouveaux nés humains, ainsi nous utiliserons des souris juvéniles entre P8 et P20 (stade de développement correspondant à la période péri-natale chez l’humain): dans un premier temps pour définir l’âge optimal pour la survie de crises fébriles; puis à cet âge optimal, afin de tester des traitements dans le but de réduire ou éliminer le nombre de crises. La souris C57Bl6 présente des crises fébriles à partir de P8 jusqu’à P20, ce qui justifie son emploi.
Etudes précliniques non-réglementaires de candidats médicaments combinés ou non à des nanotechnologies après administrations intraveineuses, intracérébrales ou sous-cutanées chez des souris adultes saines ou porteuses de glioblastome.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.
Bénéfices attendus
La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.
Procédures
Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.
Remplacement
L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.
Réduction
L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.
Raffinement
La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.
Choix des espèces
Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.
Maintien et suivi d’une lignée murine avec phénotype dommageable (lignée P301S-PS19, modèle de maladie d’Alzheimer)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
275 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 92 tuées à l'issue et 183 réorientées vers d'autres projets. Cette lignée transgénique développe vers 7-8 mois des lésions cérébrales entraînant faiblesse musculaire, paralysie partielle des membres postérieurs et amaigrissement, que le projet se limite à surveiller par pesée et observation hebdomadaires. Le porteur présente ce suivi comme un progrès de "bien-être animal", alors que la souffrance provient du phénotype dommageable entretenu par l'élevage de la lignée. Il affirme que l'étude de la maladie d'Alzheimer "nécessite" ces souris et qu'aucune alternative non animale ne peut les remplacer.
Objectifs
Le présent projet a pour but de mettre en place une stratégie pour la production et l’élevage, dans le respect strict du bien-être animal, de souris nécessaires à des travaux expérimentaux sur la maladie d’Alzheimer (MA). Ces souris transgéniques miment les lésions cérébrales de la MA et seront utilisées dans différents projets de recherche qui ont été examinés par les comités d’éthique pour l’expérimentation animale et qui sont déjà validés par les instances du ministère de l’enseignement supérieur, de la recherche et de l’innovation (MESRI). Les souris utilisées développent au cours du vieillissement des symptômes neurologiques invalidants nécessitant un suivi rapproché et constituant l’objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
Le projet concerne le maintien dans notre animalerie d’une lignée murine modèle de MA. Ce modèle reproduit de façon unique les dégénérescences de la MA. L’implantation de la lignée sur site permettra aux équipes de chercheurs de mieux comprendre les mécanismes de la MA et de développer des thérapies innovantes pour cette affection. Le présent projet a pour unique but d’assurer les meilleures conditions d’élevage et de préservation des souris produites, dans le strict respect des règles du bien-être animal. On veillera en particulier à détecter de façon précoce l’apparition de symptômes neurologiques (problème moteurs) et à mettre en place des procédures pour limiter le caractère dommageable de ces manifestations cliniques.
Procédures
Le suivi des animaux implique des gestes zootechniques mineurs (toutes les semaines, à partir de l’âge de 6 mois : observation de l’état général, prise de poids). Aucune intervention invasive ne sera réalisée au cours de ces visites de suivi.
Impact sur les animaux
Les souris étudiées peuvent développer vers l’âge de 7-8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une faiblesse musculaire et parfois une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. La procédure expérimentale associée à ce projet consiste en un suivi rapproché de la colonie de souris afin de minimiser l’apparition des signes cliniques et, le cas échéant, d’appliquer une réponse adaptée lorsque que les symptômes sont détectés.
Devenir
Les animaux de 6 mois et plus qui feront l’objet de la procédure de suivi de lignée et qui n’atteindront pas les points limites, seront réutilisés. Ils seront alloués à 3 projets expérimentaux en cours et validés par le ministère, ou utilisés en procédure hors champ (prélèvement d’organe).
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale.
Réduction
Le nombre d’animaux produits et maintenus sur site est réduit au maximum. La taille des groupes d’animaux produits pour les études expérimentales est définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature afin de permettre de générer des données reproductibles et donc solides. Les lots produits tiennent compte de la variabilité de la lignée (par exemple la densité des lésions cérébrales peut varier d’un animal à l’autre) et des mesures biologiques effectuées (par exemple les performances comportementales des souris dans des tests de mémoire peuvent montrer un degré important d’hétérogénéité d’un animal à l’autre). Ce projet de suivi de lignée concernera 275 souris.
Raffinement
L'animalerie où sont hébergés les animaux est agréée, avec des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, un abreuvage automatique et de la nourriture à volonté. Les animaux sont hébergés par groupes de 4-5 souris et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Le maintien de la lignée de souris s’articulera sur un ensemble d’actions : surveillance accrue des animaux âgés afin de détecter le plus précocement possible l’apparition de troubles neurologiques invalidants, mise en place de mesures pour limiter l’impact des symptômes moteurs et faciliter l’alimentation des animaux, euthanasie des souris dès l’atteinte de points limites. La mise en place du présent projet de maintien de lignée renforcera le bien-être animal et constitue donc une étape supplémentaire dans l’application et le respect du principe de Raffinement.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris transgéniques qui surexpriment une mutation et développent des lésions cérébrales similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs des différents projets nécessitant la mise en place d’une procédure de suivi de lignée globale (objectif du présent projet). Le présent projet sera réalisé sur des animaux adultes.
Exploration de l’implication des récepteurs cholinergiques dans les processus nociceptifs associés aux neuropathies périphériques chimio-induites – Explorations biologiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'anticancéreux (oxaliplatine, paclitaxel, bortézomib, vincristine) pour induire une neuropathie douloureuse, puis subissent chaque semaine des tests comportementaux de douleur (test du von Frey électronique, test d'immersion de la patte), avant un prélèvement terminal du système nerveux. Le porteur reconnaît que l'induction de la neuropathie est une nuisance qu'il qualifie d'"indispensable", et que les anticancéreux réduisent le gain de poids des animaux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace encore l'animal vivant pour explorer la douleur, la retombée pour les patients restant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
La neuropathie périphérique chimio-induite (CIPN) est un effet indésirable classique et dose limitant des anticancéreux neurotoxiques (sels de platine, taxanes, vinca alcaloïdes, bortézomib), qui altère profondément la qualité de vie des patients et dont la prise en charge thérapeutique reste très limité. Aucun traitement préventif ne peut être recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée sur les douleurs associées. En conséquence, les oncologues sont fréquemment contraints de diminuer voire d’arrêter les anticancéreux neurotoxiques lors de l’apparition des premiers symptômes de CIPN. Des travaux récents au sein de notre équipe de recherche ont démontré l’efficacité analgésique du donépézil sur des modèles animaux de CIPN. L’effet analgésique du donépézil (inhibiteur de cholinestérase) implique l’activation des récepteurs muscariniques M2 (m2AChRs) au niveau spinal. Cependant, l’action anticholinestérasique du donépézil pourrait être responsable de l’activation d’autres récepteurs cholinergiques et le mécanisme analgésique des m2AChRs n’est pas totalement connu (à priori inhibition des cellules excitatrices et pronociceptives glutamatergiques). Ainsi, l’objectif de ce projet sera d’évaluer l’implication du système cholinergique (m2AChRs) au niveau spinal et du système nerveux périphérique (ganglions spinaux - DRG) dans des modèles animaux de CIPN : mesure de l’expression génique et de la localisation des récepteurs cholinergiques au niveau spinal et des DRG, et exploration de l’effet analgésique d’agonistes spécifiques des m2AChRs.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques des CIPN. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des CIPN est très limitée (aucun traitement préventif et seule la duloxétine modérément recommandée sur les douleurs). Nos précédents travaux ont démontré l’intérêt analgésiques du donépézil sur ces modèles animaux de CIPN, et ont permis la mise en place d’une étude clinique évaluant l’effet analgésique du donépézil chez des patients souffrant de neuropathie induite par l’oxaliplatine. Le projet proposé vise à préciser l’implication des m2AChRs comme nouvelle cible thérapeutique, et dont l’objectif à terme sera de développer des agonistes de ces m2AChRs pour le traitement des CIPN, et qui pourront être testé chez l’homme à moyen terme.
Procédures
Tous les animaux recevront des injections d'anticancéreux ou du véhicule. Le nombre d’injection et leur voie d’administration sera fonction du modèle animal : - Oxaliplatine : 2 injections par semaine (lundi et vendredi) pendant 4 semaines, voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) - Paclitaxel : 4 injections (J0, J2, J4, et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Bortézomib : 5 injections (J0, J1, J3, J4 et J7), voie intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max) - Vincristine : 5 Injections (J0, J2, J4, J7 et J9), voie intraveineuse, durée injection de 20 secondes (max) Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaire et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - Test du von Frey électronique : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal (stabulation dans des portoirs (box) individuel pour 24 rats) - Test d’immersion de la patte : durée du test pour un animal 5 minutes (max)
Impact sur les animaux
L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux nécessitent un bon état général des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera, in fine, de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies d’expression des récepteurs à l’acétylcholine dans une perspective thérapeutique.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais pour le moment ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexicité de la physiopathologie des CIPN, qui n'est elle même pas encore élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer de nouvelles stratégies pharmacologiques et par le biais de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nosu devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire.
Choix des espèces
Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche (Ferrier et al. J Neurosci 2015 ; Selvy et al. Biomed Pharmacother. 2022), ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de test comportementaux. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.
Validation d’un dispositif implantable de thérapie cellulaire de la régénération ostéochondrale pour la prévention de l’arthrose précoce chez la brebis
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Dix des 13 brebis, opérées du genou, seront tuées pour prélever les condyles portant l'implant, et seules les 3 donneuses de moelle osseuse "pourront être replacées dans l'élevage". Âgées de deux à quatre ans, ces brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chaque geste étant réalisé sous anesthésie générale : ponction de moelle, implantation en 45 minutes d'un biomatériau chargé de cellules souches dans des lésions du genou, trois séances d'IRM. Après l'opération, elles peuvent souffrir des genoux, une douleur traitée par antalgiques, et restent dans un box de 3,5 mètres sur 3,5 pendant la cicatrisation. Le bénéfice annoncé à court terme est la validation de ces cellules "chez la brebis", le porteur précise que "Ce travail fera l'objet d'une publication", et il avance pour l'humain une économie "en termes de coût de la santé".
Objectifs
Les pathologies ostéo-articulaires sont aujourd’hui un problème de santé publique dont la prévalence augmente avec l’augmentation de l’âge de la population avec plus de 10 millions personnes qui souffrent de l’arthrose en France aujourd’hui . Actuellement, les possibilités thérapeutiques proposées chez l’homme ne permettent pas de régénérer un tissu cartilagineux articulaire normal, et de ce fait, sont incapables de restaurer la fonction de l’articulation. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité de ce biomatériau en termes de régénération tissulaire et avons également confirmé ces résultats après implantation chez le petit rongeur. Une étude in vitro réalisée sur le modèle ovin a permis de montrer l'efficacité de notre implant associé une autogreffe de cellules souches mésenchymateuses autologues pour la régénération de lésions ostéocartilagineuses. Dans l’étude actuelle, nous souhaitons confirmer ces résultats chez la brebis, en utilisant le même modèle d’étude que précédemment pour la régénération cartilagineuse avec comme différence l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) allogéniques de brebis et d’une membrane déposée en superficie du matériau composite utilisé dans l’étude précédente, au niveau de lésions intra-articulaires du genou. Nous avons développé des biomatériaux résorbables hybrides dans le but de régénérer à la fois le tissu ostéochondral mais également le cartilage articulaire. Ces matériaux sont d’une part nanofibreux et équipés de nanoréservoir contenant de l’hydroxyapatite, pour régénérer l’os sous-chondral et d’autre part, ils sont recouverts d’un hydrogel d’alginate contenant des CSM allogéniques pour la réparation du cartilage articulaire en surface. Une couche superficielle supplémentaire nanofibreuse contenant de la chondroitine sulfate et de l’acide hyaluronique vient recouvrir l’ensemble du biomatériel dans certains groupes à tester. L’hypothèse est que les données apportées par cette étude nous permettrons ainsi de confirmer le potentiel de réparation ostéo-chondrale de ces biomatériaux associés à des CSM allogèniques. L’objectif de cette étude sera d’évaluer l’efficacité sur la régénération du cartilage articulaire de ces implants hybrides.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court terme est la validation de l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans la réparation des lesions du cartlilage articulaire chez la brebis. Ce travail fera l’objet d’une publication. Le bénéfice à long terme concerne essentiellement l’être humain. Le but est de traiter les lésions cartilagineuses pour éviter qu’elles aboutissent à une arthrose évoluée nécessitant une intervention de type prothèse. Ce serait un bénéfice (une économie) en termes de coût de la santé. Il est nécessaire de tester cette hypothèse sur un modèle gros animal avant de proposer ce type de traitement chez l’être humain (principe de précaution) car les tests sur des petits animaux ne sont pas transposables pour des raisons évidentes de taille, d’anatomie et donc de contraintes mécaniques. Les principaux avantages de l’utilisation de cellules allogéniques par rapport aux cellules autologues sont : a/ d’éviter le prélévement de moelle osseuse 2 à 3 semaines avant l’intervention sur le cartilage b/ de pouvoir administrer un nombre connu à l’avance de cellules.
Procédures
Il n'est pas prévu de prélèvement sur animaux vigiles. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. 3 procédures seront utilisées .1. ponction de moelle osseuse (5 min). 2. intervention pour implantation du dispositi (45 min). 3. IRM (3 x15 min)
Impact sur les animaux
Une intervention sur les genoux et douleur post-opératoire au niveau des genoux opérés, traitée par antalgiques adaptés. Tout geste sur une articulation peut entraîner des complications : -Anesthésiques : difficultés à l’intubation, troubles du rythme cardiaque etc … Moyens mis en œuvre = surveillance permanente de l’animal -Per-opératoires : pas de complications per-operatoires prévisibles car - pas de risque de hémorragique puisqu’on est à distance des gros vaisseaux qui sont à la face postérieure du genou. L’hémostase des petits vaisseaux sera faite au bistouri électrique et la brebis n’est pas sous anticoagulant. - Pas de risque de fracture car aucune contrainte sur l’os, seul un geste sur le cartilage - Post-opératoires : comme pour tout geste chirurgical sur une articulation les risques sont : - Une douleur post-opératoire, qui n’est pas certaine mais dont la présence sera détectée par l’observation de l’animal - Un retard de cicatrisation : surveillance quotidienne - Infection : surveillance quotidienne et geste chirurgicale adapté si nécessaire ou euthanasie Déambulation libre en box de 3,5 m x 3,5 m pendant la période de cicactrisation puis jusqu’au 6ème mois, Déambulation quotidienne sur un périmétre plus large.
Devenir
Les 3 brebis prévues pour le prélèvement de moelle osseuse, pourront être replacées dans l’élevage. Ce prélèvement ne modifie en rien leur état. Les 7 brebis opérées devront être euthanasiées pour pouvoir prélever les condyles en vue de l’analyse des implants et de leur effets sur la régénération du cartilage, ainsi que les 3 brebis surnuméraires demandées dans cet avenant.
Remplacement
Ce protocole d’étude respecte la règle des trois R de l’expérimentation animale (Replacement, Reduction, Refinement) grâce à la possibilité d’imagerie non invasive de l’IRM qui permet de suivre l’évolution des lésions sans avoir à faire de prélèvement chez l’animal. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques évite une anesthésie supplémentaire car il n’est plus nécessaire de prélever de moelle osseuse autologue. Il n’y a pas d’alternative non animale pour étudier le cartilage articulaire. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité des implants 3D des chondro-, ostéo-inducteurs et des CSM en termes de régénération ostéochondrale. La principale limite des études-in vitro est l’absence de contrainte biomécanique et son effet sur l’implant et la cicatrisation. Le passage sur animal vivant est ensuite indispensable pour valider notre approche. Il n’est actuellement pas légal de tester chez l’homme une technique innovante sans l’avoir testé chez l’animal quand cela est possible (principe de précaution)
Réduction
Une première étude a été faite sur ce même schéma avec 4 brebis mais en utilisant des CSM autologues, confirmant leur utilité dans la réparation des lésions cartilagineuses.
Raffinement
Dans le protocole actuel le même schéma est reproduit avec comme différence l’utilisation des CSM allogéniques et dans un des groupes une membrane superficielle sensée améliorer la cicatrisation du cartilage. Les 4 brebis de la première étude (opérées des 2 genoux) ont pu être toutes suivies jusqu’au terme de l’expérimentation, ce qui a permis de valider le concept de l’implant utilisé. Cependant sur un aussi petit effectif un incident (problème à l’anesthésie, mauvaise récupération post-opératoire, infection du site opératoire) la perte d’un seul animal peut compromettre le résultat de l’ensemble de l’étude et donc finalement avoir inclus inutilement les autres animaux. Pour pallier cela et augmenter les chances d’atteindre les objectifs scientifiques il est prévu d’augmenter le nombre d’animaux à 7 brebis minimum pour pallier aux éventuels incidents rendant inexploitable une implantation chez l’un des animaux. 3 brebis supplémentaires sont demandées afin de comparer l’efficacité des cellules allogénique du premier groupe aux cellules autologues de ce nouveau groupe.
Choix des espèces
La brebis est le modèle gros animal reconnu pour l’étude de l’arthrose. Les brebis agées de 2 à 4 ans sont le modèle animal utilisé habituellement dans les autres études sur le cartilage. Pour ne pas induire une variable supplémentaire par rapport aux études existantes il a été décidé de conserver ce sexe et cette tranche d’age .
Etude de pharmacocinétique et évaluation de la tolérance locale chez le chat aprés administration d’éléments d’essai différents par voie sous cutanée
- Recherche appliquée
- Maladies animales
24 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés en vie. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée et subit une quinzaine de prises de sang sur cinq jours, avec évaluation répétée de la douleur, du gonflement et de l'érythème au site d'injection. Le porteur indique observer grattage et vocalisations dans les minutes suivant l'injection, et vise la mise au point d'un médicament vétérinaire anti-vomitif. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la tolérance locale et juge le recours à "l'animal entier" indispensable.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de trois produits tests différents versus un produit référence aprés une simple administration sous cutanée et d'évaluer la tolérance locale au site d'injection.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que les paramètres pharmacocinétiques de la molécule testée dans les 3 formulations tests différentes sont similaires à ceux de la référence et que ces formulations tests sont également bien tolérées par l'animal. Dans ce projet, le chat est l'espèce cible. Le bénéfice est de générer un nouveau médicament aux propriétés anti vomitives.
Procédures
Les animaux auront une seule administration en sous cutanée volume administré d'environ 0.1 mL/kg. Temps estimé pour une administration : environ une trentaine de secondes. Pendant l'administration et les 5 minutes suivantes, les mouvements de tête, le grattage, les vocalisations, le comportement et la notion d'inconfort seront particulièrement observés chez tous les animaux. Des prélèvements sanguins seront réalisés. Les prélèvements de sang se feront avant administration (jour -3), 15min, 30min, 1h, 2h, 4h, 6h, 9h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h et 120h pour les groupes 1à 3 et avant administration (jour -3), 15min, 30min, 45 min, 1h, 2h, 3h, 4h, 6h, 9h, 12h, 24h, 36h, 48h et 72h pour le groupe 4. Un volume de 1.2 mL sera prélevé à chaque temps pour chaque animal. Temps estimé pour un prélèvement de sang : environ une trentaine de secondes. Une évaluation de la tolérance locale sera effectuée à 1h, 4h, 8h aprés l'injection au jour 1 puis une fois par jour jusqu'au jour 7. Le gonflement, la douleur, la chaleur, l'induration, l'érythème, le grattage seront particulièrement observés et évalués via un système de scoring. Une contention trés légère pour faciliter l'observation du site sera faite à l'animal. Temps des observations de l'ordre de la minute, peut être plus longue en fontion des réactions aux sites d'injections. Les observations et les manipulations des animaux seront faites par un personnel formé pour éviter tout stress à l'animal.
Impact sur les animaux
Ce projet est divisé en 2 phases. Dans la phase 1, 8 animaux seront administrés. En fonction de la tolérance locale observée il sera décidé d'administrer les 16 animaux suivants ou pas. Il n'y a pas de différence entre la phase 1 et 2, les animaux seront soumis à la même procédure. Il est possible d'observer des gonflements, de la douleur à la palpation, de l'induration, de la chaleur , de l'érythème, du grattage au niveau du site d'injection. Une évaluation de la tolérance locale sera effectuée à 1h, 4h, 8h aprés l'injection au jour 1 puis une fois par jour jusqu'au jour 7. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (par exemple: hypersalivation, vomis, comportement anormal, anorexie ...). Si besoin les vétérinaires présents sur sites pourront avoir recours de la médication (analgésie, anesthésie par exemple).
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, ni de mimer la tolérance locale des produits administrés, il est indispensable de recourir à l’animal entier.
Réduction
Dans la phase 1: 2 animaux par groupe soit 8 animaux au total seront inclus. Dans la phase 2: 4 animaux par groupe soit 16 animaux seront inclus Il est donc prévu d'inclure un total de 24 animaux dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.
Raffinement
Les chats seront hébergés par groupe de 2 (2 males et 2 femelles si possible par groupe pendant la periode d'acclimatation de 7 jours) mais seront en condition individuelle pendant la période de prélèvement sanguins suivant l'administration c'est à dire pendant 5 jours au maximum. Durant cette période les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible.
Choix des espèces
Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adulte, age supérieur à 1 an. Animaux de poids supérieur à 2.5 Kg. Nécessaire pour avoir des doses homogènes entre les groupes
Etude du couplage neuromécanique par imagerie ultrasonore
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plupart menées sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une chirurgie puis environ trois heures d'imagerie cérébrale, et 15 d'entre eux reçoivent cinq injections destinées à induire des crises de migraine. Le porteur reconnaît qu'il "n'est pas possible" de soulager les animaux pendant ces crises, la douleur faisant l'objet de l'étude, et applique un test de sensibilité par pression d'un poil sur la face. Il affirme qu'étudier le cerveau "entier et fonctionnel" rend impossible tout recours à l'in vitro ou l'in silico.
Objectifs
Le cerveau, comme les autres organes, nécessite un apport en énergie pour maintenir son activité. Ainsi, lors de l’exécution d’une tâche, l’activation neuronale résultante s’accompagne d’une augmentation locale du flux sanguin, permettant un approvisionnement des neurones en oxygène et nutriments. Ce phénomène physiologique, appelé couplage neurovasculaire, est à la base de plusieurs techniques d’imagerie fonctionnelle. En plus d’une augmentation de la désoxygénation locale, puis de l’afflux sanguin induits par l’activité cérébrale au cours d’une tâche qui sont les éléments clés mesurés dans de nombreux types d’imagerie, cette activité cérébrale pourrait s’accompagner de changements locaux de dureté des tissus. Ce phénomène est appelé couplage neuromécanique, par analogie au couplage neurovasculaire. Le but de ce projet est : 1) de mettre au point une méthode permettant d’étudier l’existence de ce couplage neuromécanique dans le cerveau, puis 2) de l’appliquer à l’étude d’une pathologie vasculaire cérébrale : la migraine. Ces travaux seront réalisés chez le rat anesthésié. Dans la première partie du projet, nous souhaitons développer cette technique de mesure combinée de l’activité neuronale (par suivi du débit sanguin local) et de la dureté du tissu (élastographie). Cette première partie méthodologique définira et optimisera les éléments essentiels expérimentaux de ces expérimentations, c’est-à-dire les paramètres physiques d’imagerie à utiliser pour mesurer ces deux composantes de la réponse cérébrale, mais également les conditions expérimentales permettant une activation optimale. Ces travaux reposent sur une expertise reconnue de notre laboratoire dans l’étude fonctionnelle des zones cérébrales chez le rongeur. Ainsi, 4 grands types d’éléments clefs à optimiser ont été identifiés et chacun d’entre eux sera l’objet d’une étude sur deux types de stimulations. La deuxième partie de ce projet a pour but d’utiliser cette méthologie mise au point et de l’appliquer à l’étude du couplage neuromécanique dans un modèle animal de migraine chez le rat. Nous avons choisi le modèle le moins invalidant et le plus court possible. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience d’imagerie. Cette séance d’imagerie durera environ 3h. Aucune douleur , ni souffrance n’est attendue du fait des mesures mises en place et de l’anesthésie de l’animal au cours de la procédure.
Bénéfices attendus
Le couplage neuromécanique est un sujet qui n’a jusqu’à présent pas fait l’objet de nombreuses recherches et dont l’existence reste encore controversée dans la littérature. Les quelques études faisant état de ce phénomène physiologique utilisent la technique d’élastographie par résonnance magnétique, qui est moins précise temporellement que la technique que nous souhaitons mettre en place et nécessite un plus grand nombre d’acquisitions pour obtenir un signal exploitable. Par conséquent, le projet décrit ici pourrait permettre une observation plus fine du phénomène, sur un plus grand nombre de mesures, et comprendre ainsi le lien fondamental entre activation neuronale et élasticité des vaisseaux. Si la thématique de cette étude est très fondamentale, ce projet est aussi translationnel. En effet, le couplage neuromécanique pourrait, à plus long terme, permettre de diagnostiquer certaines pathologies vasculaires, telles que la HHT (Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia), caractérisée par l’absence de capillaires entre les veines et les artères, ou encore CADASIL, une maladie génétique qui atteint les petits vaisseaux dans le cerveau. La mesure combinée des variations de flux sanguin et de la rigidité dans le cerveau pourrait permettre de discriminer ces pathologies et d’en établir un diagnostic plus complet et plus fiable en clinique.
Procédures
Sous anesthésie générale, les animaux subiront une opération chirurgicale, pendant environ 1h. Cette anesthésie sera ensuite maintenue pour réaliser les mesures d’imagerie (les acquisitions en imagerie dureront environ 3 heures). Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. L’anesthésie prolongée des animaux pour ces séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardique et respiratoire (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Comme nous voulons étudier les mécanismes neuromécaniques cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous devrons induire ce modèle chez 15 animaux et pour cela, réaliser 5 injections intrapéritonéales (une par jour sur 5 jours). Il est possible que certaines de ces injections induisent une douleur aiguë orofaciale transitoire. La crise migraineuse elle-même aura lieu sous anesthésie à la 5ème injection. Les animaux du groupe contrôle recevront une injection de sérum physiologique avec la meme fréquence. Il ne nous est malheuresement pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections d’ISDN. Cet effet devrait être modéré cependant car il a été montré qu’il fallait attendre la 5ème injection pour observer l’induction d’une crise migraineuse. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal si la souffrance devenait incontrôlable). Ce test de sensibilité, qui dure moins d’une heure, sera réalisé avant le développement du modèle, puis au 4ème jour d’induction du modèle. Il implique de laisser les animaux libres de leurs mouvements, seuls dans une cage ouverte. Après une phase d’habituation, l’expérimentateur appliquera un poil calibré sur la face de l’animal afin de réaliser une pression douce de ce poil. Les animaux seront directement mis à mort à la fin de la séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
- Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. - Les seules nuisances envisagées sont celles causées par le modèle de migraine. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, il ne nous est pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections de la molécule induisant la migraine. La douleur associée aux crises migraineuses se mettra en place progressivement suite aux injections de la molécule induisant la migraine et correspond à une douleur modérée. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure). Les animaux seront directement mis à mort après la dernière séance d’imagerie. Notons que la plupart de nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort car ils auront subi une ouverture de leur boîte crânienne donc ne pourront pas être réveillés.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux propritétés hémodynamiques et mécaniques du cerveau en activité, entier et fonctionnel ; il est par conséquent impossible de réaliser ces manipulations ex vivo, in vitro ou in silico. Par ailleurs, les ultrasons n’ont jamais été utilisés pour étudier parallèlement le flux sanguin et la rigidité. Aucune donnée n’a donc été collectée à ce sujet, d’où la nécessité de réaliser les manipulations décrites dans ce projet
Réduction
Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à notre projet, nous avons utilisé un logiciel de statistiques. Le nombre d’animaux ainsi estimé est de N = 10 par groupe pour la première procédure. La mise au point réalisée en manipulation préliminaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la suite du projet. Pour la seconde procédure, en tenant compte du fait que la différence d’effet entre nos deux groupes expérimentaux (rats migraineux et contrôles) n’est pas connue et, de plus, que 20% des animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote étaient non-répondeurs, il sera nécessaire d’inclure N =12 animaux contrôles et N =15 animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote. Au total, le nombre d’animaux nécessaire au projet est de 107.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés deux par deux dans une cage contenant un enrichissement (tube en carton, bois à ronger). Un suivi quotidien sera assuré, contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture (échelle de suivi de la douleur). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures détaillées. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort par administration d’une dose létale d’Euthasol sous anesthésie. Application d’Ocrygel sur les yeux au cours de la chirurgie pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Pendant les acquisitions, monitoring des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température) pour surveiller le maintien du niveau d’anesthésie. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’Euthasol.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionelle transposables à l’Homme. Du fait du développement et de la grande caractérisation morpho-fonctionnelle du cortex chez le rat et la souris, ces deux espèces de rongeurs sont – dans l’absolu – deux espèces de choix pour notre étude fonctionnelle neuromécanique. Cependant, la souris ayant une taille de cerveau significativement plus petite que celle du rat complique grandement la mise au point et l’application à court terme de la technique. En effet, une surface de cortex, ainsi que des distances de transmission de ces ondes de cisaillementvgf sont nécessaire afin de mesurer de façon reproductible ce mécanisme. Ainsi, bien que nous souhaitions à plus long terme étudier ce couplage chez la souris, ce premier projet utilise exclusivement des rats. Les mises au point seront plus faciles car le cortex étant plus grand, il y aura une plus grande place pour la propagation des ondes de cisaillement et leur mesure. Les animaux utilisés dans cette étude seront des rats adultes (7 semaines et plus) car leur cerveau est pleinement développé et d’un grand volume, adapté pour des acquisitions en imagerie.