Recherche appliquée

5 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales pour développer des tumeurs pédiatriques, puis des traitements par voie orale et par injection pendant une quinzaine de jours, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et leurs tumeurs, dans une étude de molécules inhibitrices d'épissage contre les cancers de l'enfant. Le porteur limite la description des effets indésirables aux tumeurs sous-cutanées du flanc et aux traitements. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du comportement tumoral dans toute sa complexité.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer l’impact de modificateurs de la traduction des protéines comme immunomodulateurs sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé huit molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine cancers très graves de l'enfant.

Bénéfices attendus

Ces résultats démontreront les composants biologiques importants dans la traduction des protéines ont un potentiel dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus utilisés pour étudier l’effet des médicaments sur la croissance tumorale. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l’injection des cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes afin de pouvoir etudier nos molécules sur des cancers pédiatriques.

1 862 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un agent de chimiothérapie, puis subissent des tests comportementaux de douleur mécanique ou thermique sur trente-cinq jours, pour mettre au point un modèle de neuropathie chimio-induite. Le porteur indique s'attendre à une perte de poids, de la constipation, de l'alopécie et une piloérection, et rester vigilant aux signes d'anémie et de déshydratation. Il présente ce modèle comme une offre commerciale destinée à ses clients pour développer des candidats médicaments, et affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la douleur.

Objectifs

Ce projet porte sur le développement d’un modèle de neuropathie chimioinduite, causé par des administrations répétées de paclitaxel chez la souris. Cet agent chimio-thérapeutiques est utilisé dans le traitement des cancers colo-rectaux, pulmonaires, ovarien, ainsi que dans le traitement du cancer du sein. Toutefois, il induit des douleurs neuropathiques chez 40 à 92% des patients conduisant à la limitation ou l’arrêt du traitement. Le nombre de procédures, ainsi que le nombre d’études au sein de ces procédures et le nombre d’animaux sont basés sur l’expérience du laboratoire dans le développement de modèles de douleur chez le rongeur et sur l’expérience acquise dans le même modèle chez le rat . Le laboratoire souhaite mettre en place des modèles au plus proche de la clinique afin de permettre le screening de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre au laboratoire de mettre au point un nouveau modèle au plus près des conditions cliniques. Le laboratoire peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel, actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ceci va ainsi permettre une meilleure prise en charge de neuropathie due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer.

Procédures

Les animaux auront 4 ou 5 injections intrapéritonéale de paclitaxel (tous les jours pendant cinq jours ou tous les deux jours pendant 7jours) et auront un test comportementale de douleur (mécanique ou thermique) Les procédures feront des cinétiques de test sur du long terme pour voir l'induction (tous les 3 à 4 jours pendant 35jours un seul point de mesure) ou un seul jour de test (selon résultats des premières procédures) sera testé mais avec une cinétique de cinq points de mesures le même jour.

Impact sur les animaux

Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Malgré tout, un article nous permet de nous attendre à une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie et de la piloérection. Ces observations seront incluses dans nos points limites. Nous serons aussi vigilants aux signes d’anémies et de déshydratation, signes que nous avons pu observer dans ce modèle chez le rat. Le cadre de ce projet est de travailler sur un modèle de neuropathie, les animaux subissent donc des tests de douleur aiguë (thermique ou mécanique). Les animaux peuvent être isolés pendant la durée des tests. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets secondaires tel que la constipation, la baisse de tonus… Ces effets secondaires disparaissent quelques heures après administrations. Les injections répétées de paclitaxel peuvent créer un hématome dans la zone d’injection. Les animaux sont injectés en alternance de chaque côté de l’abdomen.

Devenir

Le modèle de neuropathie chimioinduite par administration de paclitaxel semble être un modèle stable dans le temps. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De plus, les processus biologiques causés par l’administration de paclitaxel pourraient interférer avec d’autres modèles. L’âge de ces animaux à la fin des procédures sera bien plus important que pour l’ensemble de nos modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement d’un modèle permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent pour la majorité des valeurs maximales (cut-off, ou temps d’application maximale, intensité lumineuse maximale, température la plus basse possible) à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance supplémentaire. Ces mises au point ont pour objectif de raffiner au maximum les conditions expérimentales.permettant de montrer une allodynie/hyperalgésie. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement (tunnel et matériel pour nidifier) et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein ddu laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de leur capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore dévelopés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) les médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente chez la souris (ex. : duloxetine) ce qui permet la validation des modèles et suggère l’existence de mécanismes biologiques communs. Les sujets jeunes sont à favoriser pour le développement d’une neuropathie périphérique après administration répétée de paclitaxel. Cet article met en évidence des marqueurs physiologiques et des tests comportementaux (similaire à ce que nous réaliserons ici)

430 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte du kaolin ou du liquide cérébrospinal dans la grande citerne pour provoquer une hydrocéphalie, puis ils subissent des chirurgies intrathécales répétées, jusqu'à cinq IRM sous anesthésie et une perfusion intracardiaque terminale, pour évaluer la toxicité d'oligonucléotides antisens administrés dans le système nerveux central. Le porteur indique que le modèle kaolin peut entraîner des sécrétions nasales et orbitales de sang et une euthanasie dans les cinq jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne récapitule la complexité des mécanismes en jeu et qu'il est "indispensable" d'évaluer cette toxicité avant les études cliniques.

Objectifs

L'hydrocéphalie est une pathologie neurologique dans laquelle une quantité excessive de liquide cérébrospinal (LCS) s'accumule dans le cerveau (au niveau des ventricules, cavités naturelles de cet organe). Il se produit alors une dilatation et les tissus environnants sont compressés entravant le bon fonctionnement cérébral. Les causes d’hydrocéphalie sont multiples : elles peuvent être congénitales, infectieuses, hémorragiques tumorales ou médicamenteuses. L’hydrocéphalie est souvent diagnostiquée avec des tests d’imagerie tels que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) qui est devenue l’examen de référence pour ce type de pathologie. En clinique, de nouvelles thérapies utilisant l’administration de molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO) sont actuellement proposées. Il s’agit de petites molécules d’acide nucléique qui vont venir réprimer l’expression protéique d’un gène d’intérêt. Ces composés ne franchissent pas aisément la barrière hématoencéphalique; d’où la nécessité, dans le cadre du traitement des atteintes du système nerveux central, d’administrer les candidats-médicaments par voie intrathécale (dans l’espace où circule le LCS). Or, quelques cas d’hydrocéphalie ont été rapportés suite à des injections réalisées par voie intrathécale de ce genre de composés. Dans ce contexte, il apparaît important d’évaluer le profil sécurité des candidats-médicaments en préclinique sur ce point de vigilance. Dans ce contexte, nous proposons d’évaluer en IRM, chez le rat, le risque d’hydrocéphalie associé à l’injection intrathécale d’ASO amenés à être proposés au développement clinique chez l’humain, pour le traitement d’atteintes cérébrales spécifiques. Ce projet se décompose en deux parties. Dans un premier temps, nous chercherons à reproduire, chez le rat, un modèle d’hydrocéphalie déjà bien caractérisé de façon à optimiser l’acquisition et le traitement des données imagerie IRM pour la détection d’anomalies cérébrales associées à cette pathologie. Puis, nous chercherons ensuite à évaluer l’effet de différents ASO administrés par voie intrathécale sur les paramètres volumétriques tels que le volume des ventricules cérébraux, la taille globale du cerveau, et/ou déformations des différentes structures cérébrales. Ce projet permettra de sécuriser l’approche en développement clinique de ces produits qui pourraient être proposés comme traitement de maladies invalidantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de valider les méthodologies pour la sélection des meilleurs candidats médicaments nécessitant une injection par voie intrathécale pour le passage en développement clinique.

Procédures

• Imagerie IRM sur animal anesthésié : jusqu’à 5 sessions d’imagerie/animal espacées au moins d’une semaine d’intervalle sur une durée maximale de 5 mois. Durée maximale d’une session IRM/animal : 1 heure • Injection unique (CSF ou kaolin) au niveau de la grande citerne. La durée de la procédure n’excèdera pas 20min • Chirurgie intrathécale pour administration des ASO : 3 administrations à une semaine d’intervalle. C’est ce qu’on appelle le « bolus de charge » et qui sera la méthodologie préconisée chez l’humain. La procédure chirurgicale n’excèdera pas 30min • Prélèvements sanguins et de LCS chez animal anesthésié juste au moment du sacrifice (stade terminal sans réveil) • Perfusion intra-cardiaque PFA 4% pour permettre l’analyse histologique post-mortem des tissus cérébraux. La durée de la procédure n’excèdera pas 15min

Impact sur les animaux

Ce projet permettra justement de définir quels peuvent être les effets indésirables associés à l’administration répétée par voie intrathécale (dans l’espace où circule le liquide cérébrospinal) d’un traitement par oligonucléotides antisens (ASO) destiné à traiter des atteintes du système nerveux central ; voie d’administration préconisée chez l’humain. Effets indésirables liés à l’apparition d’une hydrocéphalie chez le rat. Possibilité de sécrétions nasales et orbitales de sang et de liquide clair dans les quelques jours suivant l’induction. Selon la littérature, ces évènements n’ont pas été rapportés dans le modèle kaolin (euthanasie dans les 5 jours suivants l’injection) que nous souhaitons évaluer en imagerie IRM. Effets indésirables liés à l’administration intrathécale de composés. Paralysie des membres postérieurs, inflammation locale au niveau du site d’injection, paralysie motricité vésicale ou digestive. L’administration des composés est réalisée en conditions d’aseptie optimale de façon à limiter la survenue d’effets indésirables associés à cette voie d’administration. Effets indésirables liés aux anesthésies successives Anesthésie gazeuse (isoflurane) durant les examens IRM et procédure chirurgicale. Aucun effet indésirable n’est attendu. Surveillance des paramètres physiologiques (température, respiration) durant toute la session d’acquisition des données imagerie ou chirurgie. Surveillance des animaux (en chambre thermostatée) jusqu’à leur réveil avant réintroduction dans leur cage.

Devenir

Pour chaque procédure les animaux doivent être euthanasiés pour analyse post-mortem (analyse immuno-histochimiques et dosages biochimiques) et corrélation avec les données d’imagerie acquises in vivo.

Remplacement

Il est indispensable de pouvoir évaluer la toxicité de candidats médicaments et définir la marge sécurité pour les futures études cliniques. Actuellement les études in vitro permettent de sélectionner une grande partie des composés et de restreindre drastiquement le nombre de produits qui seront testés in vivo. Cependant, il n’existe aucun modèle in vitro ou synthétique qui récapitulerait la complexité des mécanismes déclenchés par l’administration d’un candidat médicament dans un organisme ; Le recours à l’animal reste donc obligatoire et nécessaire pour envisager les études réglementaires qui permettront de poursuivre le développement du produit jusqu’à l’autorisation de mise sur le marché.

Réduction

Dans ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour garder une puissance statistique raisonnable et s’assurer que les résultats puissent être exploitables en vue de la variabilité inter-individuelle. Généralement, un minimum de n=10 animaux/groupe est nécessaire quand nous cherchons à mesurer des paramètres en imagerie pour lesquels nous n’avons pas d’expérience au préalable. Le fait d’envisager un suivi continu en imagerie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans les études en limitant l'euthanasie à différents temps.

Raffinement

Les composantes physiologiques seront surveillées durant les examens d’imagerie : respiration, température corporelle. Le réveil de l’animal se fera en chambre thermostatée avant sa réintroduction dans sa cage L’alimentation et l’eau de boisson seront disponibles à volonté Les procédures de chirurgie intrathécale seront accompagnées par des injections d’analgésiques (avant et après la chirurgie) Les animaux seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt tout signe d’inconfort ou de douleur qui pourraient survenir, et administrer le soin correspondant

Choix des espèces

La réglementation impose que les études de toxicologie soient effectuées sur une espèce de rongeur au minimum. Dans ce projet, le choix du rat est privilégié du fait que l’injection intrathécale des composés est possible chez cette espèce, à la différence de la souris. Les volumes des prélèvements (sang, LCS) pour l’identification de biomarqueurs sont potentiellement également plus importants chez le rat que chez la souris; ce qui facilite les dosages sans à priori. L’évaluation de la tolérance chez le rat de l’administration intrathécale de candidats médicaments préalablement sélectionnés (criblage in vitro/études chez la souris) aidera aux choix des doses à évaluer sur une espèce non rongeur avant le début des essais cliniques où la voie d’administration intrathécale est celle qui sera préconisé chez l’humain. Dans ce projet, nous utiliserons des rats Wistar pour lesquels nous disposons déjà de données historiques concernant les analyses biochimiques et de formulation sanguine. Dans ce ce projet, nous utiliserons des rats jeunes ou adultes, conformément aux requis réglementaires

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe sous-cutanée diffusant en continu de la phényléphrine ou de l'angiotensine II, ce qui provoque une hypertension artérielle, puis elles subissent jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin à la queue, pour caractériser un modèle de fibrose cardiaque et tester de nouveaux traceurs d'imagerie. Le porteur indique que la chirurgie mène à un stress et une douleur au réveil qu'il évalue comme modérés. Il affirme que l'étude de la fibrose cardiaque ne peut se passer de l'animal, les modèles cellulaires ne reflétant pas l'environnement neuro-hormonal.

Objectifs

Il existe à l’heure actuelle peu de méthodes permettant un diagnostic précoce de la fibrose interstitielle cardiaque et par conséquent peu de traitements disponibles. L’objectif de ce projet est donc de mettre en place et caractériser un modèle de fibrose cardiaque interstitielle chez la souris, puis d’évaluer de nouveaux traceurs d’imagerie diagnostique précoce de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra dans un premier temps de caractériser un modèle de fibrose interstitielle cardiaque avant d’explorer de nouvelles stratégies de diagnostic précoce. Par la suite, des études visant à évaluer de nouveaux traitements seront possibles avec à terme une possible translation à la clinique grâce à l’utilisation ici des mêmes imageries que celles réalisées chez l’homme.

Procédures

les animaux subiront les actes suivant : * implantation d’une pompe sous-cutanée sous anesthésie générale Durée : 15 à 20 minutes * prélèvement sanguin (procédure 1 seulement) sur souris vigiles : Durée : 30 secondes * Imagerie in vivo avec injection intraveineuse sous anesthésie isoflurane. L’imagerie se déroulera au maximum sur 1h. La procédure d’imagerie n’est pas répétée dans la procédure 1 et sera répétée 5 fois à une semaine d’intervalle dans la procédure 2.

Impact sur les animaux

la chirurgie d’implantation d’une pompe sous la peau fermée par une suture mènera à un niveau de stress et douleur évalué comme modéré au réveil de l’animal. L’infusion continue de 2 composés par cette pompe (phenylephrine / angiotensine II) provoquera une hypertension artérielle également évaluée à un niveau modéré. Le prélèvement sanguin (procédure 1 uniquement) nécessitera une contention de quelques secondes et la réalisation d’une piqure à la queue et est évalué comme léger. Enfin la procédure d’imagerie pourra engendrer un stress léger au moment de la mise sous anesthésie et du réveil de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir réaliser différentes analyses complémentaires sur le tissu cardiaque.

Remplacement

L’étude de la fonction et de la fibrose cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal présent physiologiquement, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de construire notre projet en 2 étapes et d’y associer des analyses in vitro. De plus, en comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit/plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Enfin le geste chirurgical appliqué dans ce projet est assez peu invasif (pose d’une pompe sous cutanée) et sera associé à une couverture analgésique.

Choix des espèces

Le rongeur est le modèle de référence en cardiologie car l’environnement neuro-hormonal et la physiologie cardiaque sont proches de l’humain. Les animaux seront commandés à l’âge de 8-9 semaines et seront traités de 10 à 14 semaines comme décrit précédemment dans la littérature

430 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés en vie puis envoyés à l'abattage pour la vente commerciale des carcasses. Ils subissent un écornage, jusqu'à onze prises de sang, des prélèvements de fèces et deux biopsies de tissu adipeux, pour mesurer l'efficacité alimentaire et des marqueurs de qualité de la viande selon les régimes d'engraissement. Le porteur revendique un "besoin constant d'animaux" et présente le projet comme une source de références techniques pour la filière et sa valorisation économique. Il affirme que le recours aux bovins est "obligatoire" puisqu'ils sont l'espèce cible de l'élevage étudié.

Objectifs

L'agriculture est depuis toujours en constante évolution. Pour l'aider dans cette mutation la recherche agronomique a initié de nombreux programmes de recherche, auparavant orientée vers l'augmentation des performances et de l'amélioration de la productivité des espèces animales élevées et destinées à produire du lait et/ou de la viande. Aujourd'hui, elle s'orienterait plutôt à maintenir le niveau de production des animaux (ovins, bovins...) tout en prenant plus en compte les contraintes du milieu, les risques environnementaux (production des gaz à effet de serre, polution des sols...) ou attentes sociétales (bien être animal, qualité des produits, traçabilité de l'alimentation...). Pour répondre à une partie de ces enjeux, notre établissement utilisateur a un besoin constant d'animaux. Pour réaliser des études fines des mécanismes physiologiques d'ingestion et de la digestion des aliments chez les ruminants , les animaux modèles utilisés sont ici des bovins issus du troupeau allaitant.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à acquérir des références techniques sur les pratiques en élevage pour engraisser les bovins avec le maximum d’herbe et de fournir des repères sur la qualité des viandes ainsi produites. Ces pratiques seront mises en perspective avec les coûts de production et d’opportunité que leur application engendre. Il s’agira aussi d’identifier au sein de la filière des solutions pour mieux valoriser la qualité des viandes issues d’une finition maximisant l’herbe et porteuses d’une meilleure répartition de la valeur ajoutée.

Procédures

Ecornage : 1 fois /animal en début d'expérimentation et d'une durée de quelques minutes (100 animaux max). Prises de sang : 4 fois /animal durant l'expérimentation (180 animaux) et 11 fois/animal durant l'expérimentation (250 animaux) (intervalle entre chaque prélèvement minimum une semaine) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Prélèvement de féces : 2 fois /animal en début et milieu d'expérimentation (180 animaux) et 6 fois/animal (250 animaux) et d'une durée de moins d'une minute à chaque fois. Biopsie de tissu adipeux : 2 fois /animal (430 animaux max) en début et milieu d'expérimentation et d'une durée d'une dizaine minutes à chaque fois. Digestibilité : 1 fois /animal en milieu d'expérimentation et de maximum 13 jours (80 animaux).

Impact sur les animaux

Faible risque de troubles digestifs (acidose). Risques modérés liés à la manipulation des animaux lors des interventions (accident de pesée etc..)

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de toutes les procédures mais seront destinés à l'abattage pour vente commerciale des carcasses à la fin des expérimentations.

Remplacement

Le contexte du projet est l'élevage de ruminants où l'animal est, par conséquent, au centre des préoccupations. Le projet a pour objectif la recherche d’indicateurs peu on non invasifs capables de traduire la variabilité observée chez l’animal en croissance/engraissement. De fait avoir recours à des bovins (animal cible) est obligatoire.

Réduction

Les procédures pour réduire le nombre d'animaux seront mises en oeuvre dès que possible et serviront à limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et la sévérité des procédures appliquées. Dans certains cas une approche en carré latin pourra être utilisée (dans ce cas l'animal est son propre témoin et soumis aux différents régimes alimentaires expérimentaux) pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour raffiner les procédures expérimentales, les conditions d'hébergement et l'utilisation des animaux par exemple en limitant la durée d'hébergement en stalles de digestibilité, en ayant des temps de repos suffisant entre procédures pour les animaux. De plus les animaux seront suivis quotidiennement pour s'assurer de la bonne santé des animaux.

Choix des espèces

Le contexte du projet est la prédiction de l’efficience et de la qualité des carcasses en fonction des régimes alimentaires en phase d'engraissement, d’où l’intérêt à travailler avec des bovins en croissance/engraissement.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.

Bénéfices attendus

Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal

Impact sur les animaux

Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.

Remplacement

Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

213 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés perfluorés par voie intraveineuse ou orale, séjournent 24 heures en cage à métabolisme, puis sont tuées après un prélèvement de sang important, l'appareil chauffant utilisé pour l'injection dans la queue pouvant provoquer des brûlures. Le porteur cherche des stratégies pour accélérer l'élimination des PFAS accumulés dans l'organisme. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de l'animal, le devenir d'une molécule n'étant pas prévisible par des études in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer et évaluer une ou des stratégies de remédiation pour augmenter l’élimination corporelle des composés alkyl perfluorés (PFAS) accumulés dans l’organisme et réduire ainsi les niveaux d'exposition systémique des PFAS et leurs impacts sur la santé Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de caractériser les processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et conduisent à leur accumulation. La clairance rénale jouant a priori un rôle majeur par rapport à la clairance biliaire, nous analyserons ensuite les mécanismes qui contrôlent l’élimination rénale des PFAS dont les propriétés de la liaison des PFAS aux protéines plasmatiques et les processus de filtration glomérulaire, de sécrétion et de réabsorption tubulaires des PFAS. Les résultats orienteront les approches exploratoires de remédiation vers l’utilisation d’inhibiteurs de la réabsorption rénale des PFAS. L’étude de la relation entre l’exposition systémique aux PFAS et un ou des biomarqueurs prédictifs de leurs effets perturbateurs métaboliques pourra être utilisée comme critère de jugement de la capcité des approches exploratoires à réduire les concentrations au-dessous des seuils d’expression des effets délétères des PFAS.

Bénéfices attendus

La prévention des effets délétères des contaminants environnementaux repose essentiellement sur la réduction des expositions externes via l’établissement de doses sans danger. Cette approche ne permet cependant pas de protéger l’homme des substances chimiques dont la principale source d’exposition est interne, comme certains des composés alkyls perfluorés (PFAS). La très faible capacité d’élimination corporelle de ces composés serait à l’origine de la demi-vie plasmatique élevée, de certains d’entre eux qui s’élève à plusieurs années chez l’homme, et est à l’origine de leur bioaccumulation. L’augmentation de l’élimination de ces composés représente le moyen de diminuer l’exposition des tissus aux effets toxiques de ces substances. Pour cela, notre approche basée sur la caractérisation des processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et leurs effets toxiques permettra d’identifier des méthodes de remédiation.

Procédures

Dans le cadre de la procédure 1, 84 souris recevront une administration intraveineuse unique (N=42) ou une administration orale unique (N=42). Les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme. Un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Six autre souris (contrôles) seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme et à l'issue des 24h, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Au cours de la première étude de la procédure n°2, un prélèvement unique de sang sera réalisé chez l’animal anesthésié (n=15) et immédiatement suivi de la mise à mort. Au cours de la deuxième étude de la procédure n°2, toutes les souris (n=36) recevront une administration orale quotidienne d’un mélange de composés alkyl perfluorés pendant 4 jours et, 3 jours après le début des administrations orales, une administration unique intraveineuse d’iohexol seul (n=12), avec du mannitol (n=12) ou avec un inhibiteur des transporteurs rénaux (n=12). Suite à l'administration intraveineuse, les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme afin de recueillir les urines et les fèces. Trois prélèvements sanguins de sang seront réalisés au cours des 24h chez l’animal anesthésié. Le dernier prélèvement sera immédiatement suivi de la mise à mort. Les 60 souris de la procédure 3 recevront une administration orale quotidienne pendant 28 jours. Au bout des 28 jours, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Les administrations orales seront réalisées par gavage. La durée du gavage varie de 10 à 30 secondes. Les administrations intraveineuses seront réalisées dans une veine latérale de la queue à l’aide d’une seringue à insuline de 0.5ml avec aiguille sertie (0.30mm x 12mm, Aniject 0.5ml INS 100U Pentafine, 30Gx1.2). Les souris seront placées dans le tube de contention de l’appareil illuminateur de queue pour permettre une bonne contention de la queue qui sera placée dans la gouttière prévue à cet effet de façon à ce qu’elle soit éclairée, et forme un angle de 45° entre l’aiguille et la queue. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 10 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une brûlure de la queue pourrait être induite par l’appareil illuminateur de queue utilisé pour les administrations dans la veine caudale. Cet appareil illumine efficacement la queue mais du fait de la température élevée, la queue ne doit pas être maintenue en continu plus de 2-3 minutes dans la gouttière d’éclairage pour éviter les brûlures

Devenir

Les souris seront mises à mort après le prélèvement d’un volume de sang important qui est requis pour l’ensemble des dosages réalisés pour chacune des procédures du projet (dosage des PFAS, dosage de l’iohexol, évaluation des marqueurs métaboliques).

Remplacement

Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (pharmacocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale, …).

Réduction

Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PFAS en mélange. En effet, l’administration simultanée des 10 PFAS permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PFAS et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse des données qui sera mise en œuvre permettra de réduire à un seul, le nombre de prélèvement par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d’analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des milieux enrichis : tunnels et papier pour faire des nids. Excepté lors de l'hébergement en cage à métabolisme, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des souris par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des souris dans les cages à métabolisme. Les animaux seront également habitués à entrer dans le tube de contention et à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Durant toute l'étude, les animaux seront surveillés deux fois par jour afin de s’assurer de leur prise alimentaire et de leur accès au système de distribution d’eau. Une pesée réalisée toutes les deux semaines permettra de s’assurer de leur prise normale de poids au cours de l’étude. Les procédures n’induisant que peu de souffrance, un animal dont l’état est préoccupant (présentant au moins un des facteurs répertoriés ci-après) serait éliminé et mis à mort car considéré comme anormal par rapport aux autres : mauvais état du pelage, pâleur des yeux ou des extrémités, perte de poids, anorexie prolongée, difficultés respiratoires sévères ou prolongées (particulièrement si accompagnés de cyanose), difficultés digestives (diarrhée prolongées, …), diminution marquée de l’activité ou décubitus latéral, léthargie, hémorragie sévère incontrôlée, déshydratation sévère ou prolongée, signes neurologiques sévères (ex : tête penchée, tremblements, grincement de dents, convulsions, paralysie, incoordination motrice, etc.).

Choix des espèces

La souris est choisie au titre de modèle de référence en toxoicologie. Le choix du modèle des souris femelles C57BL6 s’appuie sur des résultats préliminaires qui montrent la pertinence de ce modèle pour évaluer les effets des PFAS sur le métabolisme énergétique hépatique. Ainsi, une étude récemment réalisée au laboratoire a montré qu’une stéatose hépatique était induite par un traitement par voie orale des souris C57BL6 avec du PFOA à une dose très faible (5 ng/kg.j). De plus, la comparaison des résultats avec ceux précédemment obtenus chez des souris femelles C57BL6 invalidées pour les récepteurs CAR (Constitutive Androstane Receptor) et PXR (Pregnane X Receptor) apportera des informations très importantes sur le rôle de ces récepteurs nucléaires dans les mécanismes de contrôle de la réabsorption rénale des PFAS. Le projet sera réalisée chez des souris adultes âgées de 10 semaines. L’étude toxicocinétique se déroulant sur une période de 120 jours, il est important que les animaux soient au même stade physiologique (adulte) tout au long de l’étude.

14 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés ensuite pour un autre projet ou placés. Ils reçoivent un probiotique dans leur alimentation pendant 31 jours, avec trois prises de sang sous sédation et des séjours en cage à métabolisme jusqu'à seize heures pour recueillir les fèces. Le porteur évalue l'effet de ce complément, "FlorEquilibre", sur la digestibilité et la flore intestinale. Il affirme que l'effet sur le microbiote peut difficilement être reproduit hors de l'animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet, chez le chat, de la distribution dans l'alimentation d'un probiotique, FlorEquilibre, sur la digestibilité et la flore intestinale. Les paramètres mesurés pour évaluer l'efficacité du probiotique seront la consistance et les analyses chimiques et microbiologiques des fèces, les paramètres hématologiques et biochimiques, la digestibilité, la prise alimentaire et le poids corporel.

Bénéfices attendus

Chez le chat, la flore intestinale peut être perturbée: - lors du sevrage, de la croissance, - lors de changements d'environnement comme l'arrivée dans un nouveau foyer ou un séjour en chatterie, - lors de situations potentiellement stressantes comme un voyage, l'arrivée d'autres animaux dans le foyer, une hospitalisation, - lors d'une vaccination ou de prises de médicaments comme des antibiotiques, - lors d'un changement d'alimentation ou de l'ingestion d'aliments inhabituels par exemple pour les chats qui ingèrent différentes proies. Les animaux âgés, et certaines races prédisposées comme le Sphinx ou le Bengal, ont également une plus grande sensibilité digestive. L'administration de probiotiques présente alors un avantage pour rééquilibrer la flore intestinale et aider l'animal à mieux surmonter ces perturbations.

Procédures

1. Alimentation individuelle pendant toute la durée de l'étude, 1 fois par jour (environ 10 minutes après habituation), 2. Traitement avec un complément alimentaire pour un des groupes, 1 fois par jour pendant 31 jours avec l'alimentation (environ 10 minutes), 3. Examen clinique effectué par un vétérinaire, 1 fois par période x 3 périodes (avant traitement, pendant traitement et post-traitement) (environ 15 minutes), 4. Pesée une fois par semaine (environ 5 minutes), 4. Prélèvement de fèces en cage à métabolisme, 24h maximum x 17 jours (pour la plupart des chats, les fèces seront émises entre 16h la veille et 8h le matin du jour de prélèvement soit 16h en cage à métabolisme), 5. Prélèvements de sang, 1 fois par période x 3 périodes (environ 1 minute).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont: douleur et stress suite aux trois prises de sang (même si le stress sera réduit par une sédation préalable), placement en cage à métabolisme pour le prélèvement de fécès. Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des troubles digestifs liés au traitement probiotique même si la formulation est déjà disponible sur le marché et administré à la dose recommandée.

Devenir

Les animaux auront subi une procédure modérée avec un très faible risque d'effet indésirable. Sauf avis contraire du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur, les animaux pourront être réutilisés pour un autre projet. Cependant, s'il s'avère qu'un animal a du mal à se laisser manipuler et/ou n'est pas très à l'aise dans un environnement avec plusieurs autres congénères, il pourra être placé.

Remplacement

Il est nécessaire pour déterminer l'efficacité d'un probiotique de déterminer son effet sur le microbiote intestinal, un mélange complexe de micro-organismes qui peut difficilement être reproduit en totalité in vitro. De plus, les interactions avec l'organisme, la matrice alimentaire lors de l'administration conjointe à l'aliment, la variabilité interindividuelle, ne pourraient pas être prises en compte. Enfin, pour des contraintes réglementaires, il est impératif de mener trois études indépendantes sur l'espèce cible. Il n'est donc pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En revanche, vu que le probiotique est déjà mis sur le marché, il y a peu de risques d'effets indésirables avec un tel traitement.

Réduction

Le nombre de groupes, soit un sans traitement et un traité avec la dose recommandée, est défni par la guideline de l'EFSA (European Food Safety Authority) "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives". Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé lors des deux essais précédents. Ce nombre de 7 animaux par groupe ne peut donc pas être modifié, les trois essais devant obligatoirement être les mêmes. Cependant, compte-tenu de la procédure effectuée sur ces chats et de l'absence d'effets indésirables du traitement, ces chats pourront ensuite être soit réutilisés pour une procédure légère ou modérée, soit proposés à l'adoption à la fin du projet.

Raffinement

Bien que les prélèvements de fèces soitent réalisés en cage à métabolisme, les cages seront aménagées pour réduire au maximum l'inconfort de l'animal : grille des cages recouverte de tapis caoutchouc et de VetBed, litière pour la récolte des fèces nettoyée immédiatement, jouets et brosses dans la cage, possibilité de sortir chaque chat sous surveillance pour qu'il puisse intéragir avec les manipulateurs et d'autres chats. Les chats seront également habitués aux cages à métabolisme pendant la période de pré-traitement. De plus, si un chat n’a pas fait de fèces le matin, il pourra être sorti des cages à métabolisme après le repas et isolé dans une des parties de la volière commune où ils sont hébergés habituellement jusqu’à récupération des fèces. Pendant toute la durée du projet, les chats seront suivis quotidiennement par un vétérinaire. La douleur et le stress qui pourraient être engendrés par les prises de sang seront attenuées par une sédation préalable. Même si le traitement est administré à la dose recommandée, des effets indésirables liés au traitement probiotique pourraient survenir. Cela devrait être essentiellement des troubles digestifs transitoires. Si les troubles persistent plus de trois jours, l'animal sera exclu de l'étude et des soins adaptés seront mis en place le cas échéant par le vétérinaire en charge du suivi quotidien des animaux.

Choix des espèces

L'espèce choisie est l'espèce cible pour laquelle le probiotique est mis sur le marché Les animaux seront des chats adultes âgés de 1 à 7 ans, comme dans les deux essais précédents. La guideline de l'EFSA "Guidance on the assessment of the efficacy of feed additives" recommande en effet que les animaux utilisés pour les essais soient des animaux en bonne santé et appartenant à un groupe homogène. D'où le choix d'écarter les animaux trop jeunes (en croissance avec un microbiote non mature, non stérilisés) et trop âgés (risque de problèmes de santé accrus).

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur applique un produit allergisant et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles pour déclencher un eczéma, et jusqu'à huit injections d'anticorps sur trois semaines. Le porteur analyse les mécanismes immunitaires de l'eczéma et sa récidive, maladie qu'il dit toucher plus de 15% de la population. Il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule la complexité de la réaction immunitaire de la peau et que les cellules primaires doivent être prélevées post-mortem sur des souris.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus, a été mise en évidence. Ces cellules particulières ne re-circulent pas dans l’organisme et patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Les traitements actuels préconisés pour ces eczémas consistent notamment en l'application cutanée d'anti-inflammatoires (corticoïdes). Toutefois, ce type de traitement, bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permet pas d’empêcher les récidives. Ce projet a donc pour but de tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour lutter contre les eczémas et d'évaluer son effet sur la formation, la survie, la prolifération et la réactivation des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Ainsi, 6 anticorps, dont l'efficacité et la sureté ont déjà été démontrées dans d'autres modèles, seront testés dans ce projet. Grâce à cette stratégie, une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source, pourrait voir le jour.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les cellules immunitaires mémoires résidants dans la peau pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. Enfin, l'objectif final de ce projet serait de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique innovante, permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas, grâce aux résultats de ce travail.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 40 minutes. Les animaux seront également être traités (8 injections de traitement au maximum) avec un anticorps (ou anticorps contôle) sur une durée maximale de 3 semaines. En effet, dans certaines procédures, 7 injections de traitement sont nécessaires pour observer un effet de l'anticorps, comme démontré dans la littérature. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Ce modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; nous savons donc que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisées. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que nos expériences durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. En effet, des statistiques intermédiaires pourront être réalisées afin de déterminer la puissance de nos tests et de revoir à la baisse nos effectifs d’animaux si possible.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. Lors des injections par voie intrapéritonéale, nous veillerons consciencieusement à ne pas toucher les mammelles des souris afin de ne pas blesser les animaux. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur lèse un muscle de la patte arrière par injection d'une toxine, puis on leur injecte des cellules immunitaires génétiquement modifiées par voie intramusculaire ou dans la veine de la queue. Le porteur cherche à mettre au point une stratégie pour délivrer des molécules thérapeutiques aux muscles dans les maladies musculaires. La mise à mort sert des analyses des tissus, et le porteur précise que tout animal tué peut fournir des prélèvements à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont répartis dans tout l'organisme et représentent plus de 40% de la masse totale chez l’adulte. Ce projet vise à développer une nouvelle stratégie de délivrance aux muscles, basée sur l'utilisation de cellules sanguines génétiquement modifiées. La plupart des maladies musculaires provoquent une dégénérescence des fibres, entraînent un recrutement naturel de cellules immunitaires du sang aux sites de régénération, le muscle étant très irrigué. En modifiant ces cellules immunitaires pour les rendre capable de reconnaître les sites de régénération et de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à générer un outil qui puisse cibler le muscle blessé, fusionner avec les fibres nouvellement formées et délivrer des molécules d'intérêt thérapeutique. Les cellules immunitaires utilisées dans ce projet sont des cellules T (lymphocytes) génétiquement modifiées par des virus, afin d'exprimer des molécules de reconnaissance musculaire et des protéines de fusion à leur surface. Des essais de fusion de ces cellules sanguines à des cellules musculaires ont déjà été réalisés dans l’équipe apportant une preuve de principe pour cette stratégie in vitro. Nous sommes prêts à étendre notre étude in vivo, par l'utilisation d’un modèle animal capable de reproduire cet obstacle de délivrance présent chez l'homme. La souris représente un modèle optimal pour ces approches, avec la possibilité d’utiliser des protocoles établis pour la délivrance de cellules par voie intraveineuse, et la possibilité de mimer les phénomènes de réparation des muscles. Les lymphocytes T génétiquement modifiés seront administrés à des souris immunodéficientes, dont le muscle a été lésé par une injection de toxine, induisant un contexte de régénération et d’inflammation aigu. L’objectif du projet est donc d’utiliser les cellules T comme cargo pour véhiculer des molécules thérapeutiques aux muscles en régénération via la circulation sanguine. Les objectifs sont donc multiples : s’assurer qu’après manipulation génétique, les cellules T thérapeutiques fusionnent aux muscles dans un contexte systémique d’organisme vivant, qu’elles peuvent être recrutées aux sites de régénération et qu’une combinaison de ces deux propriétés permette d’avoir un système de transport de molécules thérapeutiques efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet totalement novateur permettrait de prouver la fusion de cellules immunitaires sanguines aux cellules musculaires in vivo et ainsi de mettre en avant l’utilisation de ces cellules sanguines comme outils thérapeutiques dans le combat contre les myopathies ; notamment la myopathie de Duchenne, très étudiée aujourd’hui, pour laquelle pourtant les alternatives thérapeutiques font défaut. Si cette stratégie fonctionne, des systèmes de réparation des mutations génétiques causant la maladie sont en train de faire leurs preuves sur le marché, leur expression par nos cellules immunitaires thérapeutiques pourrait être une avancée majeure dans le domaine. De plus, l’étude de la régénération des muscles dans ce modèle spécifique de souris immunodéficientes n’a jamais été réalisée et elle permettra d’enrichir la littérature.

Procédures

La première intervention commune à tous les animaux sera la lésion musculaire (d’un muscle de la patte arrière), par injection intramusculaire d'une toxine, qui peut occasionnellement entrainer une diminution de la mobilité des souris pendant les heures qui suivent. Cette injection sera unique pour chaque patte de l’animal, le temps d’injection par patte est de 30 secondes, l’anesthésie pour cette procédure est au maximum de 10 minutes par animal et se fait par isoflurane (transitoire par les voies respiratoires). Les animaux subiront également des injections de cellules immunitaires. Certains en intramusculaire, la procédure est la même que pour la lésion. D’autres en intraveineux, qui correspond à une injection unique de cellule dans la veine de la queue, sous anesthésie toujours par les voies respiratoires. L’injection dans la veine dure 1 minute par injection et les animaux seront anesthésié au maximum 10 minutes. Les souris recevront aussi une injection d’analgésique pour éviter les douleurs liées aux injections intra-musculaires et intra-veineuses, en sous-cutanée, au maximum 2 fois (une fois lors de la lésion et une fois lors de l’injection de cellules, si les deux injections sont à des temps différents). Les souris soumises à de l’imagerie in vivo pourront y être soumises tous les 3 jours (injection de réactif, en sous-cutanée, puis anesthésie, par les voies respiratoires pendant maximum 10 minutes le temps de la prise d’image) pendant au maximum 14 jours. Les animaux vont être transportés dans leurs cages d'habitat avant chaque lecture de bioluminescence (dans le même bâtiment), le transport (aller ou retour) dure au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet vont subir des interventions non chirurgicales et les seuls actes effectués seront des injections sous-cutanées et intra-musculaires. L’injection intra-musculaire de cardiotoxine pour léser le muscle porte un risque spécifique et une attention particulière sera portée sur la capacité motrice des souris (même si les animaux présentent une régénération spontanée et totale des muscles après cette technique et qu’elle ne doit en théorie pas les empêcher de marcher, même directement après lésion). L’inconfort lié à la piqûre sera évitée car sous anesthésie et la douleur au réveil sera prise en charge par des analgésiques préventifs. Les injections de cellules intra-musculaire ou intraveineuses (prolifération non contrôlées in vivo) seront à surveiller pour toute apparition de masse dans la patte, l’inconfort et la douleur seront pris en charge de la même manière que lors de la lésion musculaire. Les effets indésirables attendus pour les injections sous-cutanées sont l’inconfort lié à la sensation de piqûre. Les animaux vont aussi être soumis à des inhalations d’isoflurane (anesthésique) plusieurs fois au cours des expériences, une bonne et rapide récupération de l’anesthésie (réveil) est à surveiller. Les animaux vont aussi devoir être transportés (dans le même bâtiment) avant toute imagerie de bioluminescence. L’accès à l’eau et la nourriture ainsi que leurs habitats ou le groupe dans la cage resteront inchangés.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus. En effet, même dans le cas où les images de bioluminescence donnent des résultats positifs, des analyses histologiques des tissus (coupes musculaires) seront effectuées afin de comprendre plus en détail (de façon microscopique) le fonctionnement des phénomènes que l’on voit apparaître tels que la localisation des cellules injectées ou leur fusion aux muscles, ou tout simplement attesté d'une bonne régénération du muscle.

Remplacement

Ce projet vise à tester la capacité de fusion de cellules T modifiées avec les fibres musculaires, suite à leur administration systémique dans la circulation sanguine. Après une preuve de concept de la fusion des deux types cellulaires (sanguine et musculaire) in vitro, il n’existe actuellement aucun moyen de continuer ce projet pour une étude dans un contexte systémique autrement que dans un système animal complet. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.

Réduction

Ce projet a été pensé avec un nombre d’animaux minimum pour avoir un effet statistiquement significatif. Un effort de réduction des animaux est amené par l'utilisation de l'imagerie de bioluminescence in vivo : cela permet de suivre la progression de l'expérience à différents points de temps sans mettre à mort l’animal. De plus tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir des prélèvements nécessaires à d’autres projets de l’équipe (notamment extraction de cellules T pour test in vitro sur ce projet). Lorsque cela est possible, les muscles des deux pattes seront injectés afin réduire le nombre d’animaux en conservant une puissance statistique qui nous permettra de conclure sur l’expérience. Finalement, le projet est découpé en multiples procédures qui vont nous permettre de comprendre le comportement des cellules injectées dans l’animal et d’ajuster certains paramètres avant l’expérience d’intérêt thérapeutique, ce projet ne représente alors pas seulement la recherche d'un résultat mais la compréhension de processus encore non décrits dans la littératures.

Raffinement

Dans un esprit de raffinement du projet, les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiques sont combinés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal lors des procédures de type lésion musculaire et injection de cellules. Les animaux sont surveillés quotidiennement dans les trois jours qui suivent l’injection de cardiotoxine ou de cellules notamment afin de s’assurer de la mobilité des animaux dans les cages. Une grille d’évaluation clinique est mise en place, basée sur le comportement (prostration, aggressivité), l’aspect physique (aspect du poil, prise ou perte de poids) et la physiologie de l’animal (de plis cutanés, signes de déshydrations, de diarrhées). Le niveau d'analgésique (de pallier 1, 2 ou 3) est adapté selon le score total. Un score supérieur à 8 sans effet des analgésiques de pallier 3 constitue un point limite de mise à mort de l’animal. Le raffinement des animaux passe aussi par l’enrichissement de leur habitat spécifique à leur génotype dommageable immuno-déficient comme des aliments et des éléments de jeu irradiés et des manipulations en milieu stérile.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immuno-oncologie (cellules CAR T) et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. De plus, le modèle de lésion aiguë à la cardiotoxine est vastement utilisé et la régénération spontanée et rapide des muscles de souris ce qui en fait un candidat très intéressant pour notre étude. Le modèle murin sert aussi couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques ce qui valide notre approche pour une potentielle étude dans un contexte de lésion chronique des muscles, voire, dans le cadre d’une application thérapeutique chez les patients. Le projet concerne des animaux adultes étant donné que le muscle termine sa croissance aux alentours de 5 semaines. Les animaux sont utilisés préférentiellement entre 7 et 12 semaines. Cependant, afin de réduire le nombre d'animaux pour former des cohortes, les souris peuvent être utilisées jusqu'à l'âge de 5 mois.