Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de l’imagerie multiparamétrique et spectroscopique pour localiser la zone épileptogène
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
325 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'hippocampe pour déclencher une épilepsie, l'implantation d'une pompe sous anesthésie, jusqu'à quatre séances d'IRM et huit jours de médicaments, avant l'analyse de leur cerveau et de leur sang. Le porteur cherche à mieux localiser par imagerie la zone du cerveau à retirer chez les patients épileptiques opérés, les retombées cliniques étant renvoyées à une évaluation en préparation. Il indique qu'une recherche bibliographique n'a révélé aucune alternative in vitro et que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la communication entre cellules.
Objectifs
Un tiers des patients épileptiques ne répondent pas correctement aux médicaments antiépileptiques et, parmi eux, 1/4 peuvent bénéficier d'une chirurgie résective. L'identification des zones du cerveau à enlever par chirurgie (la zone épileptogène (ZE)) est un processus difficile. Il nécessite un ensemble d'outils complexes comprenant des examens cliniques, d'imagerie et neurophysiologiques, y compris des enregistrements électroencéphalographiques intracrâniens. Cependant, même en combinant toutes les informations actuellement disponibles, la chirurgie de l'épilepsie ne fonctionne pas correctement chez 20 à 60% des patients. Il est donc nécessaire développer de nouvelles méthodes pour délimiter la ZE. La neuro-imagerie, non invasive et largement disponible dans le contexte clinique, apparaît comme un candidat naturel pour aborder cette question. A terme, l'objectif est d'améliorer la chirurgie chez les patients.
Bénéfices attendus
Les données recueillies dans cette étude nous permettrons de caractériser l'impact de différents médicaments anti-épeliptique sur les mesures IRM (mqMRI et GABA-MRS). Ces informations seront utilisées pour modéliser l'impact attendus des médicaments chez l'homme lors de l'évaluaton clinique qui est en cours de préparation.
Procédures
- Procédures chirurgicales sous anesthésie : i) Injection intra-hipppocampique (induction de l'épilepsie) : durée maximum 1h30. ii) Implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie (durée maximum 30min). Maximum deux procédures / animal. - IRM sous anesthésie : maximum 2h30/session IRM, maximum 4 sessions IRM / animal. - Administration de médicaments : durée de quelques minutes / jours pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
i) Douleur modérée au moment de l'induction de l'épilepsie, procédure conduite sous anesthésie, ii) Crises épileptiques pendant la phase d'épileptogenèse iii) Douleur modérée au moment du traitement pharmarcologique iv) Douleur légère au moment de l'examen IRM, procédure conduite sous anesthésie
Devenir
Le tissu cérébral et le sang des animaux utilisés dans ce projet est analysé en fin de projet (sauf pour les animaux utilisés pour l'optimisation des protocoles IRM). Tous les animaux sont mis à mort au court du projet.
Remplacement
Nous avons effectué une recherche approfondie sur Pubmed et Google Scholar afin de nous assurer de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre malformations du développement corticale, crises épileptiques et fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des combinaisons de mots-clés tels que épilepsie, crise, électroencéphalographie, dysplasie, cerveau, neurone, modèles animaux, in vitro et tests animaux alternatifs. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 15 animaux par groupe sont prévus ainsi que deux groupes pour l'optimisation du modèle animal et de l'imagerie, pour un total de 325 souris sur 5 ans. De plus, nous commencerons ce projet par un groupe préliminaire qui permettra la mise au point du protocole : si cette étude préliminaire révèle que le nombre de rats par groupe est surévalué, nous le réduirons de façon à atteindre un nombre d'animaux nécessaire et suffisant.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Les animaux utilisés pour ce projet sont nés et élevés en Europe. Leur nombre a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des données suffisantes pour évaluer l’efficacité de cette stratégie d’imagerie pour définir la zone épileptique en cas de prise de médicaments anti-épileptiques.
Choix des espèces
Notre projet propose l'utilisation de petits animaux in vivo (souris). Les souris ont été choisies à cause de leurs caractéristiques neuro-vasculaires et profils électroencéphalographiques bien étudiés. Ils expriment les mêmes marqueurs neuronaux, gliaux et péricytaires que l'Homme. Ils constituent donc un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'entité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des malformations corticales et des crises. La littérature fournit des preuves de la fiabilité du monitoring électroencéphalographique in vivo et IRM in vivo pour l'évaluation des modifications pathophysiologiques des tissus. De plus, un fort taux de survie est observé lorsque les rongeurs sont utilisés dans ce type d'étude par rapport à d'autres espèces.
Mise au point d’une méthode d’administration orale non invasive chez le rat
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
52 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 36 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 16 modéré. Ils reçoivent des administrations orales répétées pendant 21 jours, soit par gavage soit par une micropipette à l'excipient sucré, subissent deux tests comportementaux (labyrinthe en croix surélevé et openfield), puis sont tués pour doser dans leur sang les substances et les marqueurs de stress. Le porteur présente le projet comme une amélioration du bien-être des rats de laboratoire, la micropipette étant moins stressante que le gavage. Il affirme que cette mise au point doit se faire chez le rongeur puisqu'elle vise à remplacer une technique déjà pratiquée sur lui.
Objectifs
Les études précliniques sont indispensables au développement et à l’évaluation d’une substance active mais également à la détermination d’éventuels effets indésirables de médicaments. Chez le rongeur, il existe de nombreuses méthodes permettant l’administration de principes actifs. Invasives par nature, ces méthodes peuvent entrainer des infections ou lésions au site d’injection. La probabilité de survenue de telles lésions est d’autant plus vraie que la contention – nécessaire à l’administration du principe actif - est mal maitrisée ou moins bien réalisée. De plus, cette contention entraine un stress chez l’animal – qui peut venir à se répéter lorsque le protocole d’administration est chronique. Dans le cas d’étude pharmacocinétique, les modifications des paramètres cardiovasculaires associés à cet état de stress peuvent biaiser l’analyse des données. L’objectif de cette étude est de mettre au point et de valider une méthode non invasive d’administration orale chez le rat ; cette méthode devra non seulement respecter le bien-être animal et de surcroit être comparable à la voie orale chez l’homme. La méthode que nous allons utiliser s’inspire d’une technique décrite et validée chez la souris qui est appellée MDA pour Micropipette-guided Drug Administration (méthode d’administration orale par micropipette). La validation se fera au travers d’une étude pharmacocinétique comparative (gavage versus MDA) de substances actives aux propriétés pharmacologiques et physico-chimiques différentes (prégabaline et aripiprazole). La compatibilité de la méthode à des régimes chroniques d’administration ainsi qu’avec des études comportementales utilisant un nombre d’animaux important seront vérifiées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de développer un protocole décrivant une méthode d’administration respectant le bien-être animal pouvant être utilisée plus largement en recherche préclinique (notamment chez le rat). La méthode MDA administre à l’aide d’une micropipette, un excipient suffisamment sucré (lait concentré sucré dilué au 3/10ème) pour que les animaux ingèrent son contenu volontairement et que leur motivation reste constante au cours du temps. Cette méthode d’administration peut donc aussi bien être utilisée pour des administrations aiguës de substances actives que pour des administrations chroniques, et ainsi remplacer les techniques conventionnelles plus à risque et plus stressantes. Les bénéfices attendus par rapport aux méthodes conventionnelles sont la diminution du stress dû à la manipulation des animaux (pas de contention) et au fait que cette méthode n’est pas une méthode invasive, la diminution des risques liés aux lésions/irritations des méthodes conventionnelles. De plus, cette méthode étant une méthode d’administration par voie orale, elle se rapproche de la cinétique d’administration la plus utilisée chez l’homme (la voie orale). Cette méthode permet également de minimiser la manipulation des animaux puisque la micropipette peut être présentée aux rats directement à travers la grille de leur cage.
Procédures
Les gestes techniques qui seront réalisés sur les animaux sont des administrations orales : - Administrations aiguës soit par la méthode MDA (micropipette) soit par gavage - Administrations chroniques (1 administration par jour pendant 21 jours) soit par la méthode MDA (micropipette) soit par gavage chronique. En ce qui concerne le gavage, la durée totale de la manipulation de l’animal est de moins de 3 minutes. Pour la méthode MDA, la manipulation de l’animal durera environ 1 minute. Ces administrations sont précédées d’une pesée des animaux.
Impact sur les animaux
Nous souhaitons comparer la méthode testée à une méthode de référence, le gavage, qui peut entrainer un stress chez les animaux notamment du fait de la contention ; mais également des irritations, voire lésions des voies aéro-digestives supérieures. Deux tests comportementaux seront effectués durant l’étude : labyrinthe en croix surélevé et le test de l’openfield. Ces tests peuvent entrainer un stress chez les animaux. Concernant les molécules utilisées pour les administrations, elles ne devraient normalement peu ou pas engendrer d’effets indésirables (risque d’étourdissement, de somnolence ou de légers effets locomoteurs).
Devenir
La mise à mort d’une première partie des animaux permettra d’obtenir des échantillons sanguins pour doser les concentrations en substances actives et vérifier l’équivalence pharmacocinétique entre la méthode MDA et le gavage. La mise à mort de l’autre partie des animaux permettra d’obtenir des échantillons sanguins pour doser des taux de corticostérone et de glucose afin de comparer les niveaux de stress entrainés par les 2 méthodes citées ci-dessus en aigu et en chronique mais également d’évaluer l’impact de l’utilisation d’un excipient sucré sur la glycémie des rats.
Remplacement
L’objectif de cette étude est d’améliorer le bien-être animal, notamment des rongeurs (animaux les plus utilisés lors des essais pré-cliniques), dans la recherche scientifique médicale : diminution du stress, diminution des risques de lésion/irritations par rapport aux méthodes d’administration conventionnelles chez le rongeur. Cette étude vise à améliorer les conditions de manipulation des rongeurs en laboratoire et doit donc par conséquent être effectuée chez le rongeur. De plus, la méthode MDA a déjà été validée chez la souris mais n’a jamais été décrite chez le rat.
Réduction
Le nombre de rats prévu dans les expérimentations a été réduit à son strict minimum. Un seul sexe sera testé afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la première partie de l’étude (étude pharmacocinétique), des groupes de n=4 rats seront formés (2 méthodes d’administration et 2 molécules testées par méthode) pour un total de 16 rats. Pour la deuxième partie de l’étude, en aigu, 3 groupes de n=4 rats seront également formés (groupe MDA, groupe gavage et groupe témoin). En chronique, il y aura 2 groupes de n=10 pour les groupes MDA et gavage. Le groupe témoin a été, quant à lui réduit à n=4. De plus, en utilisant des rats, nous pouvons réduire le nombre d’animaux utilisés car le rat possède un volume sanguin plus important que celui de la souris et nous permet donc de pouvoir effectuer tous les dosages sanguins en un seul prélèvement.
Raffinement
Diverses mesures seront prises pour raffiner les expérimentations qui ne seront réalisées que par du personnel formé et ayant un livret de compétences à jour. Après leur arrivée au laboratoire, les animaux seront stabulés dans des cages par 2 de surface de 1 092cm2 avec une Longueur de 42cm, une largeur de 26cm et une hauteur de 18,5cm, avec un rouleau en carton et des lamelles de papier kraft afin d’assurer un enrichissement minimum, permettant aux animaux de trouver un abri en cas de conflit et d’avoir une activité minimale (construction de nid). Ils seront laissés au repos sans intervention (hormis la surveillance quotidienne et le change de cage bi-hebdomadaire) durant 1 semaine, ensuite ils seront manipulés quotidiennement (handling) durant 1 semaine afin de les habituer petit à petit au contact humain et à la future expérimentation. Les principaux raffinements de cette expérience concernent les méthodes d’administration. En effet l’objectif de cette étude est de mettre au point une méthode d’administration non stressante qui ne nécessite aucune contention : la méthode MDA (Micropipette-guided Drug Administration). Une partie des animaux sera donc traitée par cette méthode. L’autre sera traitée par gavage (méthode comparative). Afin de raffiner la méthode de gavage, nous utiliserons des sondes de gavage en silicone, qui de par leur souplesse, sont moins susceptibles d’entrainer des irritations et/ou lésions chez l’animal. Les animaux seront pesés tous les jours (suivi de poids individuel). Les méthodes d’euthanasies seront adaptées afin de diminuer au maximum la souffrance chez les animaux. Pour une partie des animaux, l’euthanasie par percussion crânienne sera effectuée, celle-ci est rapide et évitera tout stress. Pour l’autre partie des animaux, l’utilisation d’un anesthésique, le pentobarbital par voie intrapéritonéale sera effectuée pour chaque mise à mort, afin de réduire la douleur de la procédure de dislocation cervicale pour le groupe de rats concerné.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la rat (Rattus norvegicus), il s’agit avec la souris, d’espèces très utilisées en recherche pré-clinique. Le rat est une espèce facile à maintenir, en termes de coût et de place, son comportement est bien connu et détaillé dans la littérature et sa proximité génétique avec l’espèce humaine permet d’accéder à des mécanismes cérébraux communs et à des fonctions cognitives et des comportements en beaucoup de points similaires et mesurables (anxiété, locomotion). Du fait de sa taille supérieure, le rat possède un plus grand volume sanguin que la souris et permet donc d’augmenter le nombre d’analyses sanguines réalisées tout en diminuant le nombre d’animaux utilisés. De plus, la méthode que nous cherchons à mettre au point n’a jamais été décrite chez le rat. A leur arrivée, les rats seront âgés de 6 semaines, afin qu’ils atteignent l’âge adulte pour le début de la phase de traitement (après les 2 semaines d’acclimatation).
Incorporation d’acides aminés encapsulés dans l’aliment des porcs et effets sur le microbiote digestif et la santé des porcs en période de postsevrage
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Maladies animales
144 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit trois prises de sang sous contention manuelle, décrite comme stressante, autour du sevrage à quatre semaines, pour tester un aliment enrichi en acides aminés encapsulés censé agir sur le microbiote digestif. 36 porcs sont tués dix jours après le sevrage pour prélever leurs tissus digestifs, les 108 autres partant à l'abattoir pour la consommation humaine une fois le poids d'abattage atteint. Le porteur situe le bénéfice attendu du côté de la réduction des antibiotiques en élevage et affirme que la réponse ne peut se mesurer que sur un animal vivant.
Objectifs
Le développement de solutions nutritionnelles a depuis de nombreuses années mobilisé les acteurs de l’alimentation animale et de la recherche pour accompagner la réduction de l'utilisation des antibiotiques lors du sevrage des porcelets. Parmi ces solutions nutritionnelles, celles ciblant le microbiote digestif et la production de métabolites bactériens d’intérêt peuvent aider à renforcer la santé digestive lors du sevrage. Les acides aminés sont des nutriments essentiels à la croissance et à la santé des porcs. Ce sont aussi des nutriments pour les microorganismes présents dans le tube digestif. La fermentation de certains acides aminés par les micro-organismes produit des métabolites exerçant des propriétés antiinflammatoires, trophiques, anti-oxydantes, etc. sur la muqueuse digestive. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’intérêt d’apporter dans l’alimentation du porc des acides aminés encapsulés dans une structure lipidique (particules) pour ne pas être absorbés par l’intestin grêle et être disponibles pour produire, par fermentation, des métabolites dans le gros intestin. Des effets positifs de ces métabolites sur la physiologie et les défenses intestinales et in fine sur la santé du porcelet au sevrage sont attendus.
Bénéfices attendus
Outre d’être des nutriments pour l’animal, les acides aminés sont aussi des nutriments pour le microbiote digestif. Il est attendu que les acides aminés testés arriveront dans le gros intestin pour y être utilisés par la flore digestive et ne seront pas ou peu absorbés par l'intestin grêle. Il est également attendu que ces acides aminés vont modifier la composition du microbiote et leur fermentation par ce microbiote pour produire des métabolites bactériens qui peuvent exercer des effets bénéfiques sur la physiologie intestinale et ainsi préserver la santé des porcelets au cours du sevrage. Nos résultats permettraient d'accompagner les efforts importants des éleveurs de porcs en termes de réduction de l'utilisation des antibiotiques lors de cette période critique de l'élevage des porcs charcutiers.
Procédures
Trois prises de sang seront effectuées sur les porcelets avant le sevrage, 10 jours puis 4 semaines après le sevrage en utilisant du matériel stérile à usage unique. A chaque fois 8 ml de sang seront prélevés par du personnel expérimenté.
Impact sur les animaux
Ce projet a pour finalité de tester une solution nutritionnelle visant à atténuer les effets du sevrage des porcelets tel qu'il est effectué en élevage commercial de porc: les porcelets sont sevrés à un jeune âge (4 semaines) , un âge où les porcelets sont encore immatures du point de vue immunitaires et digestifs et sont donc particulièrement susceptibles aux troubles digestifs se traduisant par des diarrhées. Trois prises de sang seront réalisées en assurant la contention des porcs manuellement. Cette contention est une action stressante pour les porcs.
Devenir
Les 108 porcs laissés en vie sont destinés à la consommation humaine. A l'issue de la procédure ils seront élevés jusqu'au poids d'abattage, abattus dans un abattoir commercial avant de rejoindre la chaine alimentaire. Les 36 porcs de la procédure 2 seront euthanasiés 10 jours après le sevrage pour réaliser des prélèvements de tissus et de contenus digestifs nécessaires aux mesures prévues par le protocole.
Remplacement
L'objectif de ce projet est d'évaluer in vivo l'intérêt d'utiliser des acides aminés encapsulés pour modifier le microbiote du porcelet après le sevrage. Le projet fait suite à des projets réalisés sur des modèles in vitro afin de sélectionner les acides aminés qui seront testés et leur comportement dans des systèmes digestifs artificiels. Il constitue une première étape permettant de confirmer sur animal vivant la modification du microbiote dans les parties basses de l'intestin (gros intestin). La finalité étant la préservation de la santé et la croissance des porcelets au cours de la période critique du sevrage, notre projet a aussi pour objectif d'évaluer un ensemble de réponses mesurables uniquement sur un animal vivant comme le poids, des concentrations sanguines d'indicateurs de la santé et la prévalence des diarrhées.
Réduction
3 lots de 48 porcs (144 au total) seront impliqués dans ce projet. 108 de ces animaux permettront d'évaluer l'effet des traitements expérimentaux sur la vitesse de croissance et l'évolution d'indicateurs sanguins de la réponse au sevrage (inflammation, statut oxydant, intégrité digestive). De précédentes expériences ont montré qu'entre 20 et 40 porcelets étaient suffisants pour mettre en évidence un effet de l'alimentation sur la croissance et les indicateurs sanguins mesurés en postsevrage. L'effectif utilisé ici est dans la fourchette haute car nous nous attendons à des effets très faibles des acides aminés encapsulés sur la croissance dans la mesure où l'aliment témoin non supplémenté est formulé pour couvrir les besoins les porcs. 36 porcs (3 x 12) seront abattus dix jours après le sevrage pour collecter les contenus et tissus digestifs. La littérature montre des effets de supplémentations nutritionnelles avec des effectifs très variable. Dans nos conditions expérimentales, un effectif de 12 est un optimum pour prendre en compte l'influence de facteurs autres que le lot expérimental (mère, sexe).
Raffinement
Les animaux seront suivis et les actes expérimentaux réalisés par du personnel expérimenté en restectant des points limites pour chaque procédure. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter et corriger, si cela n’interfère pas avec le protocole expérimental, les problèmes de santé par des mesures adéquates (prise en charge médicale et exclusion du protocole ou bien euthanasie). Les prises de sang sont réalisées avec une contention manuelle et du matériel vétérinaire à usage unique conformément aux bonnes pratiques.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé sur le porc qui est l'espèce cible du projet. Le projet vise à apporter des éléments scientifiques sur le mode d'action des acides aminés médié par le microbiote. Une finalité est d'utiliser ces connaissances en élevage de porc pour accompagner la réduction déjà très conséquente de l'utilisation des antibiotiques au moment du sevrage des porcelets, l'additif étant supposé limiter le risque de dysbiose favorisant les troubles digestifs et diarrhées infectieuses. Les porcs seront impliqués dans ce projet pendant une période qui correspond à la période dite de postsevrage débutant à l'âge moyen de 4 semaines, âge où les porcelets sont séparés de leur mère, jusqu'à l'âge de 10 semaines. Cette pratique est conforme aux pratiques dans les élevages de porcs.
Etude de l’activité thérapeutique de deux anticorps pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique
- Recherche appliquée
- Cancers
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques de patients, trois injections intraveineuses sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal, pour tester l'association de deux anticorps au rituximab contre la leucémie lymphoïde chronique. Le porteur situe le bénéfice thérapeutique observé in vitro et renvoie au long terme le développement en clinique humaine. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit cette maladie et conclut au recours à la souris.
Objectifs
La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie touchant des cellules du sang appelées les lymphocytes B (LB). Comme toutes les cellules, les lymphocytes B ont normalement une durée de vie limitée, de l’ordre de quelques jours à quelques mois. Au cours de la LLC, une partie des LB ne meurt plus. Leur cycle de vie est en quelque sorte bloqué lorsqu’ils parviennent à maturité. Comme leur production se poursuit, ces LB finissent par s’accumuler dans le sang, dans les ganglions, la rate et la moelle osseuse. La LLC reste une maladie fréquente avec 4500 nouveaux cas chaque année. Pour les patients, le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie et l’immunothérapie utilisant des anticorps monoclonaux dont le rituximab. Certains patients ne répondent pas au traitement initial et d’autres rechutent après l'administration des anticorps. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc nécessaire pour pallier aux mécanismes d'échec et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients. Nos études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association de deux anticorps au rituximab renforce son activité thérapeutique. Ce projet a pour objectif de montrer in vivo que la combinaison du rituximab à un nouvel anticorps thérapeutique améliore l'activité du rituximab. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons la souris immunodéfiente NSG (NOD Scid Gamma) qui permet de greffer des cellules primaires de patients atteints de LLC pour modéliser cette pathologie. Nous évaluerons à J5 la maladie résiduelle (nombre de cellules malignes persistant après traitement et qui est le critère le plus puissant pour prédire la rémission ou la rechute après traitement). Les résultats permettront de savoir si la combinaison des deux anticorps administrés de façon séquentielle permet de détruire plus efficacement les cellules de LLC.
Bénéfices attendus
A court terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et confirmer que l'injection des deux anticorps confère un bénéfice thérapeutique pour le traitement de la LLC, synergie observée in vitro. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement notre nouvel anticorps en clinique humaine. Ce dernier pourra venir renforcer l'activité du rituximab déjà utilisé en clinique chez l'homme mais qui présente des limites d'efficacité.
Procédures
Les souris seront soumis à 3 pesées durant moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile), à 3 injections intraveineuses réalisées sous anesthésie gazeuse durant moins de 30 secondes puis elles seront repositionnés dans leur cage. La récupération après l’anesthésie est très rapide, en moins de 2 minutes les souris retrouvent le réflexe de marche dans la cage. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, durée de 1 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, trois pesées d'une durée d'environ 30 secondes, seront réalisées durant le suivi (J0; J2 et J5). Du stress pourra également être généré au moment de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes et lors de l'injection intrapéritonéale pour réaliser l'anesthésie chimique pour le prélèvement sanguin terminal, durée de 1 minutes maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Afin de réaliser les analyses histologiques et de cytométrie en flux, des prélèvements d’organes et de sang terminaux seront effectués sur les souris.
Remplacement
La LLC est une maladie multifactorielle impliquant les cellules circulantes et les organes lymphoïdes secondaires. L’étude des mécanismes qui provoquent ou contribuent à l'activité des anticorps thérapeutiques nécessitent la mise en place de protocoles in vivo car il n’est pas possible aujourd'hui de reproduire la LLC par l’utilisation de modèles in vitro. Cependant, l'activité des anticorps a été au préalable évaluée in vitro sur des cellules cancéreuses, sur cellules primaires de LLC de patients et sur cellules saines. Les études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association de nos nouveaux anticorps au rituximab renforce son activité cytotoxique direct. De plus, ces études ont permis de déterminer les posologies optimales qui seront utilisées dans le projet in vivo chez la souris.
Réduction
Il s'agit d'une étude sur petit effectif d'animaux, 30 animaux au total, 5 par groupes, 6 groupes d'animaux. Nous utiliserons le test non paramétrique de test de Kruskal-Wallis pour comparer les 6 moyennes.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
Nous utiliserons comme modèle, la souris NSG (NOD Scid Gamma). Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, lymphocytes B et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules humaines primaires de LLC et modéliser cette pathologie. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules primaires humaines de LLC.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs doses de vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 66 modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec mise en barre d'oreille et craniotomie, l'injection d'un virus AAV dans le striatum, puis des tests moteurs répétés (openfield, rotarod, analyse de la marche) de 4 à 12 mois et un prélèvement de sang et de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Le porteur teste une thérapie génique contre la maladie de Huntington, les retombées pour les patients restant renvoyées à un futur essai clinique. Il affirme que seuls les modèles murins miment fidèlement la pathologie et que la preuve de concept chez les rongeurs est exigée par l'ANSM.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient et un inhibiteur du gène qui permettra de réduire l’expression délétère de ce gène déficitaire. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN avec cette inhibiteur au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but est de tester l’efficacité des AAV exprimant un gène témoin ou des gènes thérapeutiques (pour éteindre l’expression de la protéine huntingtine mutée) sous contrôle des promoteurs qui ciblent de façon spécifique les neurones dans différentes régions du cerveau des modèles murins pour la MH
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui va être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique.
Procédures
Les animaux commerciaux seront soumis à 8 semaine d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. A 11 semaines d’âge, les animaux seront euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus. A partir de 6 mois d’âge, les animaux modèles de la maladie d’Huntington développeront un phénotype dommageable. Ces animaux seront soumis à 2 mois d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux modèles pour la maladie d’Huntington seront soumis à tests comportementaux des 4 mois d’âge. L’openfield sera réalisé a 4, 6 , 8 et 11 mois avec une session de 10 minutes a chaque fois. Le rotarod est réalisée en 3 session pendant 3 jours et est réalisés a 4, 5, 6, 7 , 8 , 9, 10, 11 et 12 mois d’âge. Enfin le gait analysis est réalisé a 12 mois + 1 semaine et consiste en 3 sessions de 10-30 secondes. A 12 mois d’âge, un prélèvement unique de sang et de LCR seront effectués avant euthanasie pour l’analyse post mortem des tissus.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. L’injection de AAV avec le gène thérapeutique améliore l’état général de l’animal ; améliore les performances motrices, présente un effet trophique au niveau des neurones.
Devenir
Les animaux d’intérêt produits/commerciaux seront maintenus en vie pour la chirurgie stéréotaxique et/ou les tests comportementaux. Les souris seront euthanasiées de 3 semaines a 10 mois après les injections décrites , pour continuer les différentes études moléculaires et cellulaires.
Remplacement
A ce jour, seuls les modèles murins de la MH permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAVs. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (354) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les barres d’oreilles de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines 32G de type 3 non biseautés acquise avec l’expérience de nos études précédentes).. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon mensuelle (période de repose d’une semaine entre chaque test, il favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale de notre produit dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider l'expression de notre produit , dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle de souris de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris âgée de 2 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité, de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs pour la réparation et le remplacement articulaire, ligamentaire et musculo-tendineux
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cochons : 25
Chèvres : 50
Moutons : 50
140 chiens, cochons, chèvres et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité va de légère à sévère, 37 étant opérés puis tués sans réveil. Ils subissent des implantations chirurgicales, des prélèvements et des séances d'imagerie répétées pour tester des dispositifs de réparation des articulations, ligaments et tendons destinés au marché. Le porteur présente le suivi comme calqué sur le "cheminement d'un futur patient" et une obligation réglementaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et qualifie l'expérimentation sur "l'organisme entier" d'"indispensable" et d'"incontournable".
Objectifs
L’évaluation et le développement des nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement chirurgical des affections articulaires tendineuses et ligamentaires, par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessite une phase de recherche et développement qui permet de mettre au point le dispositif et/ou la technique développées. En effet, les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Le raffinement des prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) est la phase initiale du projet, elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
L’avantage escompté est une amélioration des capacités diagnostiques ou par exemple de la durabilité des implants, en permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci (et ainsi en éviter les réopérations parfois multiples des patients), réduire le traumatisme tissulaire, permettre une récupération plus rapide. Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences médicales / techniques mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, et plateau technique de bloc opératoire et d’imagerie de pointe). La chronologie classique d’implantation et de suivi clinique et d’examens complémentaires permettra d’assurer un cadre d’évaluation scientifique pertinent mais aussi un suivi rapproché et poussé de l’évaluation de l’état de santé générale et du bien-être des animaux implantés impliqués dans ces procédures.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Des prélèvements sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine. -Des procédures d’imagerie telles décrites dans la procédure n°1. La fréquence des examens d’imagerie post-implantation (de contrôle) pouvant être couramment d’un examen par semaine. -Une procédure d’implantation chirurgicale telle que décrite dans la procédure n°2, pour une partie des animaux du projet -Une procédure d’évaluation finale avec euthanasie et autopsie telle que décrite dans la procédure n°3, pour l'autre partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont en tous points similaires à ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun de l’animal préalablement à l’anesthésie, la préparation de l'animal à l’anesthésie (quelques minutes), - le réveil de l’anesthésie avec états de confusion possibles (quelques minutes) -les suites post-opératoires (inflammation, douleur : quelques minutes à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), des mesures de raffinement sont mises en place pour minimiser ces effets (voir plus haut).
Devenir
A l'issue de la procédure d'imagerie non invasive, tous les animaux sont maintenus en vie. Cette procédure consistant en une étape de sélection (screening) ou de contrôle (suivi fonctionnel) des animaux utilisés dans le projet. Pour les autres procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit une évaluation complète des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients represente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasive sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Cette étape de screening permise par l'imagerie, permet de selectionner les animaux présentant l'anatomie la plus adaptée et de ce fait de réduire le risque de procédures infructueuses ou dont les résultats seraient scientifiquement contestables.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). Durant les interventions sous anesthésie, les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe ou individuellement pour les besoins de l'étude et ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire, physique). La plateforme d'imagerie permettant les screenings et les contrôles fonctionnels est située sur le site d'hebergement afin de supprimer le stress induit par des transports.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Evaluation de l’immunogénicité de deux candidats vaccins lentiviraux chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des immunisations et jusqu'à trois prélèvements de sang, pour mesurer la réponse immunitaire à deux candidats vaccins, l'un anti-COVID par voie nasale, l'autre thérapeutique contre le papillomavirus. Le porteur indique que ces rats immunisés ne peuvent être ni réutilisés, ni adoptés, et seront donc tués. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'établir l'immunogénicité d'un vaccin et qualifie les futures études réglementaires d'"indispensables".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer de façon préalable l’immunogénicité, chez le rat, des produits suivants: 1- un candidat vaccin anti-COVID à administrer par la voie nasale. Ce vaccin est plus efficace que les vaccines à base d’ARN messager et présente l’avantage d’être administrable par la voie nasale et donc de protéger directement les voies respiratoires, de réduire la transmission virale et dont l’efficacité n’est pas affectée par les mutations qui s’accumulent dans l’antigène Spike des variants émergeants du SARS-CoV-2, et 2- un candidat vaccin à usage thérapeutique contre le papillomavirus humain qui est responsable de tous les cancers du col de l’utérus, ainsi qu’une grande proportion des cancers oro-pharyngés. Ce candidat vaccin permet une éradication totale tumorale dans le modèle préclinique. Ce projet permettra de valider l’espèce animale rat pour sa capacité à répondre à la vaccination par les produits développés. Une fois l’immunogénicité établie chez le rat, un organisme indépendant réalisera les expériences précliniques réglementaires chez cette espèce animale. Les futures expériences réglementaires, qui ne font pas partie de ce projet, sont nécessaires pour établir l’innocuité de ces produits et sont requises pour l’obtention de l’autorisation des autorités réglementaires avant d’administrer ces produits chez l’humain.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’obtenir l’autorisation de réaliser les deux essais cliniques que nous mettons en place: un pour un candidat vaccin de seconde génération contre le COVID et un autre pour une immunothérapie des cancers de col de l’utérus et des cancers oro-pharyngés liés à l’infection par HPV. Il est à noter que les vaccins anti-HPV actuellement disponibles sont des vaccins préventifs et n’ont aucun effet bénéfique sur les tumeurs déjà développées. En effet, une fois l’immunogénicité établie chez le rat selon le projet présenté ici, un organisme indépendant réalisera les expériences précliniques réglementaires chez cette espèce animale pour établir l’innocuité de ces deux candidats vaccins. Ces futures expériences précliniques réglementaires sont indispensables pour l’obtention de l’autorisation des autorités réglementaires pour réaliser les essais d’administration chez l’humain.
Procédures
Prise de sang (quelques secondes) sur animal vigile, maximum de 3 prélèvements espacés au moins de 10 jours.
Impact sur les animaux
Bien que les procédures proposées soient de classe légère et qu’aucune souffrance animale particulière ne soit attendue, la grille d'évaluation de la douleur nous permettra d'établir des points limites qui entraineraient la mise à mort des rats dès l'apparition de critères définis. Il n’est pas attendu que les injections/administration nécessaires pour l’anesthésie générale ou immunisation génèrent de la douleur particulière. De même, aucune perte de poids, inactivité, réduction de la mobilité, manifestation de stress notable ou de comportement anomal n’est attendue chez les animaux suite aux traitements envisagés.
Devenir
Les animaux des procédures 2 et 3 seront mis à mort, ce que le prélèvement d’organe oblige. Tous les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, ces animaux traités et immunisés peuvent difficilement être réformés pour d’autres expériences. Nous n’aurons par ailleurs pas d’autres utilisations possibles de ces animaux rarement utilisés dans nos projets.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les expériences in vivo d’immunisation et l’étude de l’immunogénicité par d’autres type d’expériences. En effet, aucune méthode alternative in vitro n’est disponible pour établir l’immunogénicité d’un candidat vaccin. Cependant le modèle animal envisagé reste un modèle de petit rongeur qui évitera l’utilisation d’animaux de plus grande taille.
Réduction
Le nombre de rats utilisés est réduit tout en conservant un minimum d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et interprétables. Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminé avec l’aide d’un biostatisticien et des tests statistiques recommandés seront réalisés pour déterminer la significativité des résultats.
Raffinement
Bien que les expériences envisagées soient de classe légère et qu’aucune souffrance particulière ne soit attendue, la grille d'évaluation de la douleur nous permettra d'établir des points limites qui entraineraient la mise à mort des rats dès l'apparition de critères définis. Une réhydratation sous-cutanée avec NaCl (1ml) sera réalisée entre les épaules après chaque prélèvement sanguin. Les rats ne seront pas hébergés seuls, mais - 2 rats de 350 g/cage - 3 rats de 300 g/cage - 4 rats de 200 g/cage Après l’anesthésie générale, donnée par la méthode gazeuse, une surveillance renforcée sera planifiée jusqu’à ce que les animaux se réveillent.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale de choix pour valider les expériences précliniques réglementaires en vaccinologie en vue d’obtention des autorisations nécessaires pour réaliser des essais cliniques. Dans les essais envisagés, l’espèce animale doit être différente par rapport à celle chez laquelle le développement du produit a été réalisé, en l’occurrence souris. Un second rongeur de petite taille est parfaitement accepté pour les autorités réglementaires pour établir l’innocuité du produit. L’étude de l’immunogénicité est aisée chez ce petit rongeur, ce qui évite également l’utilisation d’animaux de plus grande taille. De nombreux outils immunologiques sont disponibles pour réaliser l’étude envisagée de façon complète. Par ailleurs, les rats Sprague Dawley ont été utilisés auparavant pour d’autres études impliquant des vecteurs lentiviraux. Nous avons donc une expérience précédente qui nous indique que ces animaux répondront bien à une immunisation par nos nouveaux candidats vaccins proposés. Les rats de 6 semaines d’âge seront commandés. Après au moins une semaine de stabulation, la première injection sera réalisée. Les rats de 7 semaines sont considérés comme adultes et leur système immunitaire sera mature à partir de cet âge pour répondre à l’immunisation envisagée.
Développement et validation par des composés modèles d’une procédure expérimentale pour évaluer des effets de perturbateurs endocriniens suspectés sur le système thyroïdien et l’immunité de la truite arc-en-ciel, Oncorhynchus mykiss
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
3 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 400 un niveau léger. Dès la fécondation et pendant six mois, elles sont exposées à deux perturbateurs de la thyroïde, puis infectées par un virus, l'infection pouvant provoquer une exophtalmie, une perte d'équilibre et la mort. Le projet vise à valider un protocole d'évaluation des perturbateurs endocriniens sur la thyroïde et l'immunité du poisson. Le porteur affirme que les tests in vitro ou sur embryons ne peuvent se substituer à l'étude sur un organisme complet.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer et valider un protocole d’évaluation des effets potentiels de différentes substances perturbatrices endocriniennes chez un poisson d’eau douce modèle, la truite arc en ciel (TAC), en utilisant 2 composés modèles, le propylthiouracile (PTU) et la triiodothyronine (T3) dont les effets perturbateurs ont été décrits. Ce protocole sera mis en œuvre sur les premiers stades de développement de la TAC, en ciblant de manière originale et novatrice les effets sur le Système Hormonal Thyroïdien (SHT) et le Système Immunitaire (SI) ainsi que les interactions entre ces deux systèmes. Les essais intègreront un suivi de différents paramètres (morbidité/mortalité, suivi des modifications morphologiques, modification du comportement, taux d’hormones thyroïdiennes, réponse immunitaire, histopathologie) et de la résistance à une épreuve infectieuse au virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (vNHI) après une exposition chronique aux composés modèles de plusieurs mois.
Bénéfices attendus
Afin d’évaluer le danger de composés suspectés d’avoir des effets perturbateurs endocriniens, il est nécessaire de disposer d’un système expérimental in vivo validé avec des composés modèles connus pour leurs effets positifs ou négatifs sur le système thyroïdien (hyper- et hypo-thyroïdie). En plus d’apporter des informations sur le lien entre le système immunitaire et le système thyroïdien, ce projet apportera des données de toxicité du PTU qui permettront d’approfondir l’évaluation de sa dangerosité comme perturbateurs endocriniens (PE).
Procédures
Pour chacune des deux procédures, les poissons seront exposés partir de la fécondation et pendant les 6 premiers mois de vie à différentes concentrations de deux substances perturbatrices du système thyroïdien : le PTU (procédure 1) et T3 (Procédure 2). A la fin de cette exposition chimique les poissons seront soumit à une épreuve infectieuse via une infection au vNHI (viruse de la Nécrose Hématopoïétique Infectieuse) par balnéation puis observé pendant 6 a 8 semaines. Au cours de ces expositions et infections 5 prélèvements (P) seront faits post-mortem aprés 1 mois (P0), 3 mois (P1), 6 mois (P2) d’expositions chimique, 96h post infection (P3) et au termes de l'expérimentation (P4) afin d’obtenir des données de morphométrie, d’histologie, de dosage d’hormones thyroïdiennes, d'immunologie et de comportement.
Impact sur les animaux
- Induction possible d’un léger stress des animaux du fait des conditions expérimentales. - Peu d’effets indésirables visibles attendus sur les animaux qui seront exposés à de faibles concentrations de contaminants (doses dites sublétales). - Comportements et symptômes caractéristiques de l’infection virale (exophtalmie importante, perte d’équilibre, …), avec une mortalité débutant en moyenne à 5-7 jours post-infection.
Devenir
Les animaux restants seront mis à mort, pesés et conservés à -80°C pour analyse.
Remplacement
L’étude des perturbations endocriniennes nécessite la mise en place de systèmes biologiques représentatifs de la complexité du fonctionnement d’un organisme. Elle ne peut pas être substituée, notamment pour l’étude des effets sur différents systèmes et des interactions entre ceux-ci, par des méthodes alternatives (tests in vitro ou embryo larvaires).
Réduction
Ces procédures expérimentales seront menées en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique et statistique. Le nombre maximum de poissons a été estimé à 3600, répartit comme suit : - 1800 pour la procédure 1 (150 poissons x 3 réplicats x 4 conditions (Contrôle + 3 concentrations de PTU) ; - 1800 pour la procédure 2 (150 poissons x 3 réplicats x 4 conditions (Contrôle + 3 concentrations de T3). Le nombre d’individus a été déterminé statistiquement.
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - à réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle des animaux présentant un comportement de nage anormal et/ou des signes de cannibalisme (œil en moins, nageoires abîmées, blessures sur le dos, ...) et/ou de détresse respiratoire.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce idéale : (1) elle est d'un grand intérêt économique et représente un modèle environnemental pertinent proche des espèces endémiques (c.à.d, Salmo trutta fario) des eaux européennes, (2) les caractéristiques spécifiques de cette espèce, notamment la présence de follicules thyroïdiens dans les tissus rénaux, un organe hématopoïétique-lymphoïde important chez les poissons téléostéens, en font un organisme très intéressant pour les études fonctionnelles, (3) c'est une espèce facile à élever en laboratoire, avec un cycle de développement plus long que le poisson-zèbre, ce qui permettra par la suite des expositions chroniques aux stades embryonnaires, larvaires et juvéniles, et (4) son génome, entièrement séquencé, est disponible, facilitant ainsi les analyses génétiques. Les animaux seront utilisés du stade « embryon » au stade « alevin/juvénile » (de 0 à 8 mois post-éclosion), stades qui sont connus pour leur grande sensibilité aux contaminants chimiques.
Tests précliniques chez la souris modèle de leucémie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 700 un niveau modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines, des traitements à évaluer et jusqu'à huit prélèvements de sang, avec un suivi de la maladie par imagerie sous anesthésie. Le porteur agit comme prestataire de services pour des laboratoires publics ou privés qui testent leurs candidats-médicaments. Il affirme que le passage au modèle in vivo est "indispensable" et que la souris est le rongeur le plus utilisé pour modéliser cette maladie.
Objectifs
Les leucémies et maladies apparentées, en forte augmentation et affectant aujourd’hui 2,3 millions de patients dans le monde, sont le plus mortel des cancers du sang et touchent environ 9 000 personnes chaque année en France. Ce sont aussi le premier cancer de l’enfant. Le besoin médical insatisfait est donc considérable. Dans ce contexte, notre plateforme propose à ses partenaires de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de leurs différentes stratégies thérapeutiques innovantes les plus prometteuses in vitro. L’objectif de cette demande est donc de développer des modèles précliniques robustes, pour évaluer l’effet anti leucémique in vivo de thérapies innovantes en utilisant des modèles de lignées cellulaires et des échantillons de patients leucémiques déjà bien caractérisés.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Unje partie des animaux subiront une transplantation de cellules leucémiques humaines (1 injection durant 1 min / animal) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 8 sur 6 mois) réalisés sous anesthésie volatile ( 5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 15 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, lorsque possible, le développement de la leucémie sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules leucémiques et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L'administration des traitements à évaluer constituera une nuisance sur les animaux. L'anesthésie ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex-vivo le développement leucémique en fonction des conditions expérimentales.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance leucémique. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué ni les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et de faire un suivi de croissance leucémique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de 3500 souris, cependant ces études seront menées avec un système de GO/No GO. Une première étape permettra de vérifier l’absence de toxicité des composés à évaluer. Si des problèmes de tolérance sont identifiés, l’étude de cette molécule sera interrompue. Dans le cas contraire, l’étude sur lignées cellulaires leucémiques transplantées sera initiée =étape 2. Pour l’étape 3, s’agissant de l’étude à partir de greffes de prélèvements de patients, seuls les composés ayant des résultats positifs à l’étape 2 seront lancés. Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux, un calcul d’effectif pour chaque groupe sera réalisé sur la base de notre expérience et de la littérature scientifique du domaine. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés peu ou pas invasifs (dosages sur prélèvements sanguins ou d'imagerie optique). De même, l’ensemble de ces procédures de prélèvements et d'imagerie sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température ; renouvèlement d’air ; éclairage artificiel avec alternance jour/nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.
Fonction cardiaque (hémodynamique et rythme)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1000
Cochons d'Inde : 1000
Lapins : 180
Chiens : 300
Cochons : 200
3 180 animaux non-humains, souris, rats, cobayes, lapins, chiens et cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. On leur pose des cathéters et des électrodes ou un implant de télémétrie, sous anesthésie, pour enregistrer l'effet de nouvelles molécules sur le cœur avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que 1 750 de ces animaux, soumis à des procédures modérées, peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire, tandis que 1 430 sont tués sans réveil. Il conclut que les tests in vitro et in silico ne remplacent pas l'évaluation dans un organisme intact.
Objectifs
Dans le cadre des études précliniques, les nouvelles molécules en voie de développement doivent être étudiées pour leur efficacité par rapport aux cibles thérapeutiques visées. Quel que soit le contexte d’étude de ces nouvelles substances, une difficulté majeure liée aux études de pharmacologie préclinique est de disposer de modèles suffisamment sensibles et/ou prédictifs afin de garantir la pertinence des résultats expérimentaux par rapport à l’utilisation thérapeutique des futurs médicaments. Les études précliniques menées dans le cadre réglementaire de la Pharmacologie de Sécurité ont pour objectifs de déterminer les effets secondaires possibles de nouvelles molécules en développement, avant ou au moment de leur passage en phase clinique et en vue de l’obtention de leur autorisation de mise sur le marché. Les études précliniques doivent au minimum étudier les possibles effets indésirables des nouveaux médicaments sur les trois systèmes vitaux que sont le système nerveux central, le système cardiovasculaire et le système respiratoire. Au niveau du système cardiovasculaire notamment, il est capital de pouvoir dépister toute molécule pouvant présenter un risque arythmogène, détectable par l’allongement de l’intervalle QT. En effet, de nombreux médicaments, anciens ou nouveaux, ont dû être retirés du marché suite à un taux de mortalité inquiétant constaté après administration chez des patients ayant développé des arythmies cardiaques. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets cardiovasculaires de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments ou de s'assurer qu'ils n'induisent pas eux-mêmes des effets secondaires.
Bénéfices attendus
Les modèles mis en place ont pour objectif d’évaluer les effets pharmacologiques principaux de substances en développement par rapport aux cibles thérapeutiques visées ou de s’assurer que ces substances n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus avant leur passage chez l’homme. Ils entrent comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in vitro.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrode (électrocardiogramme ou ECG) sont positionnés dans/autour d’artères/veines et/ou en sous cutané, pour la mesure de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, débit sanguins/cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (juste avant l'euthanasie). La procédure sous anesthésie n'excède généralement pas 2 heures (rat, cobaye, lapin) ou 6 heures (chien, porc) et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase équipés (sous anesthésie) d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum chez les petits animaux et deux semaines au minimum chez les gros animaux), les paramètres sont enregistrés en continu avant (baseline d'au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par session). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires.La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée à l’administration des substances. Dans les modèles éveillés, certaines périodes d'hébergement en cage individuelle (avec enrichissement) sont cependant nécessaires: 1) pendant la phase de récupération post-chirurgicale, afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères (généralement pour un période d'une semaine); 2) pendant les mesures (généralement un peu plus de 24h), car soit le système de télémétrie ne fonctionne qu'avec une fréquence d'émission des signaux (petits animaux, un hébergement groupé ne permet donc pas d'identifier la source d'émission d'un signal ; interférence entre les implants), soit les animaux ne reçoivent pas le même traitement ce qui nécessite l’isolement pour éviter les contaminations croisées et donc un biais dans l’interprétation des résultats de l’étude. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…).
Devenir
Pour les procédures modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Pour les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés (ou même requis d'un point de vue réglementaire). Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les effets dans un environnement biologique et physiologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Dans les procédures mises en place chez l'animal anesthésié et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Dans les procédures mises en place chez l'animal éveillé et dans la mesure du possible (dépend de la durée d'action de la substance testée), plusieurs doses d'une même substance peuvent être testées chez le même animal à des jours différents, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nos analyses statistiques (basées sur des analyses de variances et test de Dunnett) indiquent qu’un effectif de 4-8 animaux par groupe (nombre de groupes variables, 2 en standard) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux (dans l’application de la règle des 3R), certains animaux issus des procédures chez l’animal éveillé (étude par télémétrie) sont également réutilisés aux strictes conditions qu’ils n’aient pas subis de procédures sévères et après accord du vétérinaire.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur la fonction cardiaque de rongeurs (rats, souris), de lapins, de cobayes, de chiens ou de porcs est prédictif de leur efficacité et/ou inocuité en clinique. Principalement rongeurs, cobayes et lapins sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques. Chiens adultes et porcs sevrés, conformément aux données historiques.
Impact du jeûne intermittent sur les épilepsies de type absence chez la souris: modèle pharmacologique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle pharmacologique d'épilepsie infantile, elles subissent une chirurgie de 45 minutes pour implanter des électrodes d'électroencéphalogramme, restent isolées en cage individuelle et donnent des prélèvements de sang. Le projet teste si le jeûne intermittent réduit les crises et permet de baisser les doses de médicaments antiépileptiques. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux animaux pour évaluer un modèle épileptique.
Objectifs
Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime riche en protéine et gras, et faible en sucres, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 1 modèle pharmacologique d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Ce modèle présente des crises dites "absence atypiques", retrouvées chez des pathologies infantiles graves telle que le syndrome de Dravet ou Lennox-Gastaut. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique, en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications qui accompagnent le régime IF.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que deux prélèvements sanguins. L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement. Les animaux implantés avec des connecteurs pour enregistrement EEG courent le risque de se les arracher mutuellement. Ils sont donc isolés en cage individuelles pour la durée du protocole et seront surveillé deux fois par jour. Ils auront un enrichissement spécifique (sizzle, nid en carton, coton), ils seront en contact visuel et olfactif avec les congénères et seront manipulés régulièrement.
Impact sur les animaux
Le régime du jêune intermittent ou intermittent fasting (IF) a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que le modèle d'épilepsie que nous utilisons n'induit pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui induisent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant , dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).
Raffinement
Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille de carton, igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques afin d'intervenir si besoin.
Choix des espèces
L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur le modèle d'épilepsie utilisé.
Evaluation de l’utilisabilité d’un dispositif médical d’analyse des caillots dans le traitement des AVC par thrombectomie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
23 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil, chaque intervention durant de quatre à huit heures. On leur implante des caillots dans les vaisseaux et on y navigue un guide instrumenté, pour tester un dispositif d'analyse des caillots destiné à la thrombectomie de l'AVC. Le porteur indique viser le marquage CE et l'autorisation FDA, soit une finalité commerciale et réglementaire. Il décrit avoir écarté les essais in vitro, ex vivo et in silico et juge le test sur l'animal "essentiel".
Objectifs
Le projet vise à développer et valider pour l’utilisation clinique un dispositif médical, un guide intelligent, qui aidera les médecins dans le traitement des Accidents Vasculaires Cérébraux (AVC) par trombectomie.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’améliorer la prise en charge des patients avec AVC ischémique éligibles à la thrombectomie. Les résultats obtenus sur animaux, en complement d’une étude de recherche clinique, seront directement utilisés pour améliorer la performance de détection du guide vasculaire instrumenté et seront inclus dans le dossier technique réglementaire en vue de l’obtention du marquage CE pour une autorisation de mise sur le marché en Europe, de même pour les USA (FDA).
Procédures
Chaque animal est anesthésié et soumis à une chirurgie sans réveil de 4 à 8 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles pour les animaux sont en lien avec l’intervention chirurgicale : -Anesthésie : nausées et désorientation pendant l’induction, apnée pendant l’intubation, hyperthermie maligne (hypersensibilité aux gaz halogénés d’origine génétique). -Pose de cathéter artériel : saignement, hématome. -Navigation endovasculaire et injection de caillots : vasospasme, occlusion vasculaire, saignements.
Devenir
les animaux sont mis à mort à la fin de l'opération, sans réveil de l'anesthésie. Des prélèvements post mortem sont réalisés à des fins d'analyses histologiques.
Remplacement
Avant de débuter ce projet, toutes les possibilités de méthodes alternatives ont été étudiées et prises en comptes. Des études in vitro ont permis de confirmer la possibilité de discriminer des thrombi de différentes compositions. Cependant, il est impossible de reproduire au laboratoire des conditions vasculaires physiologiques, notamment vis-à-vis de l’interaction entre le thrombus et la paroi artérielle (friction entre le thrombus et la paroi, interactions cellulaires et moléculaires, contraintes spatiales, flux perturbé autour du caillot). Ces paramètres sont tous susceptibles de modifier la mesure électrique effectuée par le capteur. De plus, des données préliminaires laissent penser que le guide se positionne entre la paroi artérielle et le thrombus, augmentant la complexité de la mesure réalisée par le capteur puisqu’il doit être capable de distinguer les deux signaux provenant des deux tissus, et ce à quelques microns près. Des expériences d’artères cultivées ex vivo ont été réalisées mais ne sont pas satisfaisantes, en particulier vis-à-vis de la physiologie endothéliale. Des analyses in silico ont été réalisées pour simuler la portée des mesures électriques mais sont d’une efficacité limitée pour la prise en compte systémique des interactions biologiques, biochimiques et mécaniques entre la paroi et le caillot. Il est donc essentiel de tester les performances du capteur in situ en vue d’une utilisation efficace chez le patient.
Réduction
Le nombre total d’animaux nécessaires pour cette étude est de 23. Les données in vitro ont permi d'établir le nombre minimal de mesures nécessaires pour une efficacité satisfaisante de classification des caillots avec une approche statistique basée sur des méthodes d’apprentissage machine. L’effectif animal a été réduit au mieux en exploitant plusieurs artères, en augmentant le nombre de caillots implantés par sujet et en testant plusieurs fois les dispositifs avec des médecins différents sur un même animal, sans réveil à l’issue de l’intervention.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe social dans de larges box enrichis de jeux à macher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiances sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation de quelques jours permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés avant d’être transportés dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant toute la procédure. Des points limite sont établis pour arrêter l'intervention en cas de souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est celle dont les paramètres physiologiques cardiovasculaires sont les plus proches de l’Homme : fréquence cardiaque de 90-110 batt/min contre 60-100 chez l’Homme, pression aortique systolique de 90-120 mmHg contre 100-140 chez l’Homme, dimensionnement du système vasculaire comparable. De ce fait, le porc est largement reconnu comme modèle de choix pour toutes les études cardiovasculaires. De plus, la composition du sang de porc est très similaire à celle de l’Homme, permettant des mesures électriques similaires. Les porcs seront utilisés à un poids compris entre 20 et 25 kg. En effet, la taille de leurs carotides sera ainsi proche de celle des artères cérébrales humaines que l'on veut mimer pour l'AVC, soit 2 mm environ.