Recherche appliquée

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voies intraveineuse, sous-cutanée, intra-tumorale et intra-péritonéale, portent une tumeur de mélanome et subissent une radiothérapie interne associée à des immunothérapies. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer perte de poids, nécrose ou infection de la tumeur, et qu'une étude de survie ne permet pas de garder les animaux en vie. Il conclut qu'un "modèle syngénique" est indispensable pour étudier la réponse immunitaire, ce qui "impose" selon lui le recours à la souris.

Objectifs

Au cours de ce projet préclinique évaluant différents schémas d’associations de la radiothérapie interne vectorisée (RIV) par le radioligand de la mélanine avec des inhibiteurs de checkpoints immunitaires (ICI), nous chercherons à déterminer quelle séquence de traitement (concomitant ou séquentiel) et quelles modalités (1 ou plusieurs injections de RIV) donnent les meilleurs résultats en terme de survie, de croissance tumorale et de synergie, dans des modèle in vivo de mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de compléter nos connaissances sur les modifications de laréponse immunitaire antitumorale induite par la RIV et de déterminer la meilleure séquence thérapeutique d’association de la RIV avec l’immunothérapie pour le mélanome métastatique.

Procédures

Sur animal vigile : - Injection intraveineuse veine caudale (1 à 3 injections par animal en fonction des études, 1 minute par injection) Sur animal anesthésié - Injection sous-cutanée (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-tumorale (1 injection par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection) - Injection intra-péritonéale (4 injections par animal pour les animaux concernés, 1 minute par injection)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans cette étude sont principalement liés à la croissance tumorale (perte de poids, altération de l’état général de l’animal, nécrose ou infection de la tumeur, difficulté de mobilisation).

Devenir

Les procédures prévus pour ces études (prélèvement des tumeurs, étude de survie) ne permettent pas de maintenir les animaux en vie à la fin de la procédure.

Remplacement

Les études de l’impact d’un traitement ou d’une combinaison de traitements sur le système immunitaire requièrent des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. Notamment, la mise au point de nouvelles stratégies de combinaisons de traitements anticancéreux demande des études précliniques sur des modèles animaux. Les immunothérapies anticancéreuses requièrent de plus la présence du système immunitaire, imposant donc le recours à un modèle syngénique.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Dans la procédure 1, des groupes contrôle communs à différents modèles ont également été prévus. De plus, la procédure 2 permet également de réduire le nombre d’animaux en ne testant qu’une seule hypothèse en procédure 3. Le nombre total d’animaux est de 736 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisés afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection……). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle souris est adapté pour les études fondamentales et appliquées de développement et traitements des cancers. Un modèle syngénique est indispensable pour étudier in vivo une réponse immunitaire. Les animaux utilisés seront des adultes de 4-5 semaines ayant atteint leur maturité sexuelle afin d'éviter l'influence des variations hormonales liées à la puberté.

40 souris diabétiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réutilisées d'un précédent projet, elles sont mises à jeun quelques heures puis placées de façon répétée en cage individuelle, pour les habituer à consommer des matrices alimentaires devant recevoir un actif régulant la glycémie. Le porteur indique que le jeûne et l'isolement répété peuvent générer un stress, et que ces souris sont mises à mort faute d'autre projet prévu. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer le choix et l'intégration de la nourriture par un être vivant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’habituer des souris diabétiques à la consommation de différentes matrices alimentaires dans lesquelles il est envisagé d’incorporer un actif breveté et commercialisé, un dérivé de lait, permettant de réguler la glycémie en réduisant de manière significative la glycémie postprandiale (après un repas) pour les personnes en pré-diabète. Il faut cependant s’assurer au préalable que les souris consomment ces matrices alimentaires sans présence de l’actif, le plus rapidement possible, nécessitant une habituation à cette consommation d’un aliment différent de leur régime habituel pour lever la réticence et/ou le rejet à manger un aliment nouveau (néophobie alimentaire). Cette habituation sera effectuée en 2 phases successives : au cours de la 1ère phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées directement dans la cage des souris pendant plusieurs jours, en leur laissant accès à leur régime habituel et sans mise à jeun préalable, puis au cours de la 2ème phase d’habituation, les matrices alimentaires seront placées dans une cage d’isolement dans laquelle les souris seront mises individuellement après une période de mise à jeun préalable pour qu’elles s’habituent à consommer les matrices alimentaires qui leur seront proposées, le plus rapidement possible, pendant également plusieurs jours. Pour réaliser ce projet, nous réutiliserons des souris diabétiques issues d’un autre projet autorisé (validité toujours en cours) au cours duquel les souris auront été soumises à une procédure expérimentale de classe modérée, et après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 projets.

Bénéfices attendus

Le diabète correspond à une élévation prolongée de la concentration de glucose dans le sang (hyperglycémie). Dans le cas du diabète de type 2 (90% des cas de diabète), ce phénomène provoqué par une perturbation du métabolisme glucidique apparaît progressivement et insidieusement. En France, en 2019, près de 4 millions de personnes étaient identifiées diabétiques par l'assurance maladie et prenaient un traitement médicamenteux pour leur diabète (soit 5,3% de la population). A cela, s’ajoutent les personnes diabétiques qui s’ignorent. Cette prévalence ne cesse d’augmenter en France, particulièrement chez les hommes, les jeunes (80 ans). Les personnes diabétiques doivent s’astreindre à un régime spécial, avec notamment un contrôle voire la limitation très stricte de la prise d’aliments sucrés, ce qui peut impacter leur moral. Elles vivent parfois des problèmes de santé mentale comme la dépression, l’anxiété et les troubles de l’alimentation, voire ce qui est maintenant appelé l’épuisement diabétique qui est une des complications psychologiques les plus graves de la maladie. Les personnes qui en sont atteintes ressentent une profonde impuissance et un désespoir intense. Les industriels des secteurs pharmaceutiques et agroalimentaires cherchent donc des molécules et ingrédients pouvant agir sur la limitation du passage dans le sang des sucres ingérés lors des repas. Cette étude préliminaire est donc la base d’un projet consistant à développer des aliments fonctionnels pouvant être consommés par toutes les personnes y compris et surtout les personnes diabétiques. Permettre en effet aux personnes diabétiques de consommer à nouveau yaourts, céréales, chocolat ou barres nutritionnelles lors d’activités physiques leur redonnerait un confort de vie plus important et limiterait la survenue de pathologies associées telles que celles décrites précédemment.

Procédures

Aucun prélèvement et aucune procédure chirurgicale ne sera réalisé sur les 40 souris diabétiques nécessaires à la réalisation de ce projet. Elles seront mises à jeun pendant quelques heures puis placées en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, ce qui pourra engendrer un stress. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Impact sur les animaux

La mise à jeun des souris pendant quelques heures ainsi que le placement en cage individuelle sur des temps très courts mais de façon répétée, pourra engendrer un stress pour les souris. La période de mise à jeun correspondra cependant à la phase diurne au cours de laquelle la prise alimentaire est très faible chez la souris. Quant au placement en cage individuelle, il sera nécessaire pour contrôler que chaque souris consomme ou non la matrice alimentaire qui lui a été proposée.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 40 souris diabétiques db/db nécessaires à la réalisation de ce projet, réutilisées d’un autre projet autorisé, seront mises à mort à l’issue des expérimentations, aucun autre projet n’étant envisagé sur ce lot de souris.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo mimant l’alimentation, c’est à dire le choix et l’intégration de la nourriture par un être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre de souris diabétiques minimum nécessaire et suffisant issues d’une expérimentation précédente, après une parenthèse thérapeutique ou "wash out" d’une semaine entre les 2 études, afin d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base d’études précédentes réalisées chez le rat suivant le même protocole expérimental d’habituation qui sera suivi.

Raffinement

Les souris seront observées quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 2 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des modifications du comportement des animaux sont observées (cachexie, vocalises, convulsions…), celles-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des feuilles de papier absorbant seront placées dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris diabétique est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser cette étude dans le cadre d’un projet visant à développer des aliments fonctionnels pour les personnes diabétiques. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur cette pathologie Les animaux seront des souris diabétiques âgées de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour évaluer l’effet de composés pharmaceutiques et alimentaires sur le diabète

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinquante d'entre eux reçoivent sans anesthésie une injection de parois bactériennes déclenchant une inflammation générale, suivie de traitements répétés, de prises de température rectale toutes les heures et d'une évaluation comportementale, pour tester quatre formulations anti-inflammatoires. Le porteur indique que l'inflammation induit une souffrance modérée et que la contention répétée génère un stress chez tous les animaux. Il affirme que le remplacement par des modèles in vitro n'est pas envisageable pour mesurer des paramètres physiologiques et comportementaux.

Objectifs

L’inflammation est une réaction de défense immunitaire stéréotypée du corps à une agression : infection, brûlure, allergie…. L'inflammation chronique est reconnue comme une réponse à de nombreuses transformations de l'environnement et du comportement modernes (sédentarité, malbouffe, pollution,…) et un facteur important dans le développement de maladies de civilisation telles que la résistance à l'insuline, l'obésité, les maladies cardiovasculaires, les maladies immunitaires, et même les troubles de l'humeur et du comportement. L’inflammation se manifeste par différentes phases successives au niveau des vaisseaux avec leur dilatation et une augmentation de leur perméabilité, et des cellules de l’organisme, notamment des globules blancs. Cela permet d’augmenter la circulation du sang afin d’éliminer les cellules mortes et les toxines responsables de cette inflammation, et d’apporter les éléments nécessaires à la guérison, notamment des globules blancs (lymphocytes) pour combattre les corps étrangers. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des bactéries appelées lipopolysaccharides ou LPS. Les 4 formulations testées ont été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer les effets anti-inflammatoires de 4 formulations administrées de façon répétée sur l’inflammation générale induite chez le rat par des parois bactériennes. Les données physiologiques et comportementales générées par l’ensemble des paramètres mesurés au cours de l’expérimentation et les analyses qui seront effectuées sur le sang, ainsi que les analyses qui seront effectuées sur les organes prélevés, en fin d’expérimentation, permettront de sélectionner une ou plusieurs formulations afin de poursuivre leur développement et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettrait à terme de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour le traitement de pathologies inflammatoires aiguës mais également chroniques.

Procédures

50 des 60 rats seront soumis à l’induction d’une inflammation générale par injection de parois bactérienne, les 10 rats restant recevant l’injection de placebo. L’induction de l'inflammation générale est effectuée 1 seule fois sans anesthésie, le geste étant très rapidement en quelques secondes. Les rats seront observés toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Les 60 rats seront traités avec chacune des 4 formulations anti-inflammatoires à évaluer, immédiatement après induction de l’inflammation générale puis 6 heures, 12 heures et 18 heures après celle-ci. Les injections seront effectuées sans anesthésie après placement des rats dans une boîte de contention spécifique adaptée à leur poids et leur taille, celles-ci étant effectuées en moins d’1 minute. Une prise de température corporelle au niveau rectal sera effectuée sur les 60 rats toutes les heures pendant 12 heures ainsi qu'à 18 heures et 24 heures après induction de l’inflammation générale. Les mesures seront faites sur animal vigile. A la fin de l’expérimentation une évaluation comportementale sera effectuée en plaçant chacun des 60 rats dans un dispositif expérimental spécifique pendant 5 minutes pour déterminer les effets de l’induction de l’inflammation générale et des traitements réalisés sur leur comportement locomoteur. Cette évaluation sera faire sur animal vigile. Enfin un prélèvement de sang sera réalisé sur les 60 rats, sous anesthésie générale, effectué une seule fois et en une minute environ avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation générale affectant l’organisme entier va induire une souffrance modérée pour 50 des 60 rats utilisés pour ce projet, se traduisant par des modifications dans leur comportement et dans leurs paramètres physiologiques. La mise en cage de contention pour effectuer les traitements avec les 4 formulations à évaluer et la réalisation de celles-ci, ainsi que les mesures répétées de température corporelle, vont induire un stress pour la totalité des animaux. Le placement des animaux dans le dispositif expérimental pour la réalisation de l’évaluation comportementale à la fin de l’expérimentation pourra également générer un stress léger mais très limité dans le temps, la durée du test étant de seulement 5 minutes.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, après réalisation d’un prélèvement de sang, les rats seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes et de pouvoir ainsi réaliser un ensemble d’analyses permettant d’étudier les effets de l’inflammation générale induite et des traitements avec les 4 formulations évaluées sur ces organes.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules) ou ex vivo (organes isolés) pour évaluer les effets anti-inflammatoires de formulations au travers de paramètres physiologiques tels que la température corporelle et surtout de paramètres comportementaux. Les 4 formulations qui seront évaluées dans ce projet ont cependant été sélectionnées sur la base d’études in vitro ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires qu’il est donc nécessaire de confirmer in vivo sur un modèle animal avant d’envisager un développement chez l’Homme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir de résultats d’études antérieures et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour 6 groupes de traitement. Nous utiliserons donc des groupes de 10 rats.

Raffinement

Les administrations et les mesures de température corporelle ne pouvant pas être effectuées sous anesthésie afin de ne pas impacter la physiologie et le comportement des rats, et de ne pas intérférer avec l’interprétation des résultats de l’étude, les rats seront observés quotidiennement depuis leur arrivée jusqu’au démarrage des expérimentations, et toutes les heures pendant les 24 heures de l’expérimentation. Leur poids sera mesuré avant l’induction ou non de l’inflammation générale et 24 heures après. Si des modifications importantes du comportement sont observées suite à l’induction de l’inflammation générale ou les administrations des traitements, ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de la réponse à l’induction d’une inflammation générale, sa facilité de manipulation pour la réalisation d’injections en condition vigile et pour l’évaluation comportementale largement décrite dans la littérature scientifique sur cette espèce. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge moyen de rats décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur ce modèle d’inflammation générale, et de rats utilisés lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats probants.

448 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit l'implantation chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis des sessions répétées d'auto-administration intraveineuse de nouvelles drogues de synthèse ou de cocaïne, pour évaluer le pouvoir addictif de ces substances. Le porteur indique que la prise chronique peut induire un état émotionnel négatif, avec poil hérissé, irritabilité et agressivité envers l'expérimentateur. Il affirme que ce type de recherche ne peut être mené que sur un animal vivant, l'étude du comportement exigeant des "réseaux neuronaux intacts et fonctionnels".

Objectifs

Ce projet a pour but principal de dépister et caractériser les effets récompensants de nouvelles substances psychostimulantes de synthèse. En effet, depuis vingt ans, l’usage de ces produits n’a pas cessé d’augmenter ainsi que le nombre de cas d’accidents liés à leur usage. Par exemple, à la fin de 2019, le « Observatoire Français des Drogues et des Tendances addictives pour l’Europe » (OFDT) avait recensé plus de 700 nouvelles substances psychostimulantes. Le problème majeur avec ces nouvelles substances est qu’elles miment l’effet des drogues psychostimulantes traditionnelles (ex. amphetamines) mais qu’elles ont des nouvelles structures chimiques qui ne sont pas connues et classifiées par la législation française et européenne et donc, qu’elles peuvent être librement achetées et utilisées. Ainsi, il existe un important décalage temporel entre l’apparition des intoxications et les fatalités liées à leur usage, et le moment où elles sont déclarées illégales et que leur vente et leur usage sont interdits. Le but principal de ce projet est d’identifier et caractériser précocement les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse qui présentent un risque d’abus important afin d’informer le législateur sur les mesures à mettre en place le plus rapidement possible pour limiter les risques associés à leur usage. Ce projet fait partie d’un projet international financé par l’Union Européenne qui prévoit l’interaction étroite entre des spécialistes de différents domaines allant de la chimie en passant par les modèles d’addiction in vivo. Notre rôle dans le projet est de tester chez le rat le pouvoir addictogène de nouvelles substances psychostimulantes en utilisant l’auto-administration intraveineuse. Pour cela, nous allons tester les effets récompensants de 8 nouvelles substances psychostimulantes de synthèse sélectionnées par le consortium européen en fonction de leur risque d’abus prédit sur la base « théorique » d’une comparaison de la structure chimique des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse avec celle des molécules connues.

Bénéfices attendus

Les nouvelles substances psychostimulantes de synthèse constituent un risque majeur pour la santé humaine. Ce projet permettra d'être en capacité d'anticiper les risques d'abus de ces nouvelles substances psychostimulantes de synthèse ce qui permettra aux autorités judiciaire et policière de mettre en place des contre-mesures pour limiter les dégâts induits par ces molécules. Ce projet, financé par l’Union Européenne, devrait permettre de coordonner les efforts de lutte contre ces nouvelles drogues.

Procédures

Tous les rats (448) seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir suivre les sessions d’auto-administration de drogue. 224 rats suivront 21 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (20 sessions de 2h et 1 session de 5h à raison d’1 session par jour). 224 rats suivront 20 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session de 2h par jour) et 15 sessions d’auto-administration de nouvelle substance psychostimulante de synthèse (12 sessions de 2h et 3 sessions de 5h à raison d’1 session par jour). Tous les rats (448) seront pesés 16 fois (2 fois par semaine, 10 secondes par pesée, pendant 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - cathéter : gène légère - auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « dépendant » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur, mais pas d’agressivité vis-à-vis des congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - stress léger lié à l’isolement temporaire (2jours) des animaux au cours du projet

Devenir

Tous les animaux, à l’issue de tous les tests d’auto-administration, seront mis à mort pour le prélèvement de leur cerveau pour pouvoir étudier les mécanismes cérébraux des nouvelles substances psychostimulantes de synthèse.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les effets comportementaux des drogues d’abus, peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude du comportement nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques . Ainsi 14 animaux par lot seront nécessaires à notre étude, avec 32 lots, soit 448 animaux au maximum. Les cerveaux seront prélevés après la mise à mort à la fin des procédures afin de constituer une banque de tissus utilisable si besoin.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal. En cas d’apparition de signes de mal-être, et suivants des points limites établis, une prise en charge adaptée et sans délai sera appliquée et un traitement antalgique sera mis en place si nécessaire. Le bien-être animal est également assuré pendant la chirurgie par le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques. De plus, pendant la chirurgie l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs expérimentés et compétents.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux car les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Les rats Sprague-Dawley sont les plus utilisés dans le domaine biomédical. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet (qui durera environ 3 mois) afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections d'air pour former une poche cutanée, puis une injection infectieuse par la bactérie Cutibacterium acnes, avant un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la réponse inflammatoire à ce microbe impliqué dans les infections de prothèses. Le porteur indique que l'infection peut provoquer gonflement, écoulement, perte de poids et repli de l'animal. Il affirme avoir atteint "les limites des modèles in vitro" et juge indispensable l'étude d'un "hôte complet".

Objectifs

Le projet vise à étudier la réponse de souris mise en contact avec une bactérie causant des infections lors de la mise en place de prothèses (Cutibacterium acnes (C. acnes)). En effet, ce microbe est responsable de nombreuses infections qui ont la particularité ne se manifester que très discrètement, voire pas, au niveau clinique aboutissant à une prise en charge trop tardive. Nous cherchons donc à caractériser la réponse de l’organisme à ce microbe afin de savoir si cette faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte ou bien à la mise en place de stratégies de défense par le microbe. Les microbes utilisés seront de deux types : une bactérie de référence commercialement disponible et trois bactéries récupérée sur des infections humaines cliniques réelles. Ces bactérie ont déjà été étudiées en laboratoire dans le cadre d’interactions avec des cellules du système immunitaires de l'homme et ont permis de mettre en évidence une réponse augmentée lors de l’utilisation des souches cliniques. Cependant, ces conditions d’étude étant extrêmement éloignées de la réalité il est nécessaire d’analyser la réponse du système immunitaire dans un organisme complet afin de pouvoir conforter les réponses obtenues in vitro et pouvoir ainsi envisager de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous proposons donc d’utiliser un modèle d’étude, développé chez la souris, des réponses de l’organisme vis-à-vis d’agents infectieux afin de collecter, quantifier et identifier la réponse de l’organisme. Ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre les cellules de l’hôte et le microbe dans un contexte d’infection sur prothèse et donc à plus long terme mieux lutter contre ce type d’infections. Ce projet nécessitera l’utilisation d’au minimum 126 souris et n’excèdera pas 504 souris. Des procédures de réduction faisant appel à des analyses intermédiaires de la réaction permettront de stopper toute condition d’expérience qui ne fonctionne pas ou génère un mal-être exagéré des animaux et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux exposés.

Bénéfices attendus

Cutibacterium acnes (C. acnes), microbe naturellement présent sur la peau humaine, est surtout connu pour son rôle dans l’acnée. Cependant ce microbe est également identifié comme responsable d’infections au niveau des os, et plus particulièrement autours des prothèses articulaires (IOA). La prise en charge des infections à C. acnes est complexe et coûteuse avec la nécessité de coupler plusieurs antibiotiques et la nécessité d’un changement de prothèse, et donc de nouvelles interventions chirurgicales pour le patient. C. acnes semble pouvoir échapper au système de défense de l'organisme probablement, en partie, grâce à sa capacité à se dissimuler. Peu de données sont disponibles sur l’existence de marqueurs spécifiques de ces infections. Aussi, le projet ici présenté nous permettra d’étudier la réponse de l'organisme, dans un environnement proche de celui qui est retrouvé autour d’une prothèse, induit par diférentes souches de C. acnes. Rapidement, ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre l'organisme et ce microbe. A plus long terme, les résultats obtenus devraient permettre d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’une infection ostéo-articulaire et donc mieux lutter contre ce type d’infections.

Procédures

Chaque animal sera soumis à deux injections d’air sous la peau pour former une poche ainsi qu’à une injection supplémentaire pour l’infection. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé. Chaque injection sera précédée d’une anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nous proposons d’utiliser le modèle de poche a air car il est souvent utilisé en recherche et n’entraine pas de souffrance particulière chez l’animal. Il permet de délimiter physiquement une cavité qui permettra de contenir les agents pathogènes en évitant leur dissémination dans le corps de l’animal. Compte tenu des éléments disponibles dans la littérature, nous n’attendons pas une très forte réaction qui pourrait changer le comportement des animaux. Néanmoins il est possible d’observer un gonflement, un écoulement et/ou une irritation susceptibles d’amener à une diminution de l’activité de l’animal, pouvant l’empécher de se nourrir correctement et donc mener à une perte de poids et un comportement de repli.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour observer le recrutement des cellules immunitaires ainsi que du sang pour d’autres analyses indispensables à l’évaluation de la réponse inflammatoire.

Remplacement

Une phase initiale de recherche in-vitro a permis d’apporter un grand nombre de données concernant les capacités de réponses du système immunitaire face aux infections par C. acnes. Cet agent microbien est incriminé dans de nombreuses infections sur matériel prothétique qui ont la particularité de ne se manifester que très discrètement, voire de façon paucisymptomatique, au niveau inflammatoire. Cette diversité a été retrouvée in-vitro. Les 4 souches étudiées ont déjà été étudiées in-vitro dans le cadre d’interactions avec des cellules de l’immunité et ont permis de mettre en évidence des réponses inflammatoires différentes. Nous cherchons maintenant à caractériser la réponse d’un hôte complet afin de déterminer si cette très faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte voire à une réponse complexe faisant intervenir les différents acteurs du système immunitaire ou bien à la mise en place de stratégies particulières par le microorganisme, les modèles de culture cellulaire étant assez éloignés de la réalité physiologique. Dans ce cadre, nous pensons avoir atteints les limites des modèles in vitro disponibles concernant les informations que nous pouvons obtenir. Aucun test alternatif ne peut remplacer l’étude in vivo de l’intégralité des systèmes physiologiques de l’hôte impliqués dans la réponse inflammatoire aigüe vis-à-vis des infections bactériennes

Réduction

Des méthodes de réduction du nombre d'animaux impliqués dans l'expérimentation (mise en place d'expérimentation sur un nombre réduit d'animaux avec poursuite uniquement si l'expérimentation fonctionne, arrêt précoce des conditions jugées non exploitables, analyse/projection mathématiques à mi-parcours avec arrêt de l’étude si aucun résultat exploitable ne peut être envisagé) seront appliquées. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables du point de vue statistique un nombre minimum de 6 animaux par groupe sera utilisé. Les données quantitatives obtenues seront analysées par des tests permettant la comparaison d’échantillons de faible taille. Une logique d’arrêt des procédures est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe de points limites, la procédure sera interrompue.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés pendant une semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les cages seront enrichies de divers matériaux permettant aux animaux d’exprimer des comportements variés dans leur lieu d’hébergement. Tout au long de l’étude, un suivi régulier sera effectué de façon à observer l’apparence, le comportement des animaux et à contrôler l’absence de points limites tout au long de l’étude. A chaque manipulation les animaux seront anesthésiés afin de limiter le stress et la douleur. Un suivi rapproché sera effectué dès les premiers signes d’inconfort détectés. Un protocole de suivi définissant des points limites aisément mesurables ainsi que les mesures à prendre en cas d’atteinte est réalisé conformément aux études de prise en charge des éventuelles souffrances exprimées. Ainsi, en fonction du résultat, une prise en charge adaptée sera réalisée. En cas de situation non connue l’appel à un vétérinaire sera réalisé.

Choix des espèces

Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris C57Bl6 utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines.

4 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections quotidiennes de molécules anticancéreuses pendant trois semaines, avec un suivi de la tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte de poids, diarrhée et cachexie, et que la croissance tumorale peut entraîner des métastases. Il affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable" parce que la réponse immunitaire à la chimiothérapie ne serait pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les lysosomes sont des compartiments cellulaires impliqués dans la dégradation et le recyclage du matériel de la cellule. Les lysosomes ont un rôle important dans le bon fonctionnement des cellules mais une fois endommagés ils peuvent déclencher la mort des cellules. Depuis quelques années, un intéret important est porte en médecine sur les composés qui ont la capacité d’endommager les lysosomes et provoquer la mort des cellules cancéreuses en induisant la perméabilisation de la membrane lysosomale. Nous avons sélectionné in vitro plusieurs nouveaux composés capables d’induire la mort des cellules cancéreuses via la perturbation des lysosomes. Ce projet vise a tester le potentiel anti-cancéreux de ces molécules dans des modèles murins de croissance et vaccination anti-tumorale. Nos objectifs sont : i) déterminer les molécules les plus efficaces dans les modèles tumoraux; ii) étudier la réponse de l’immunité tumorale; iii) explorer l’effet thérapeutique des molécules en monothérapie ou en combinaison avec d’autres thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des nouvelles molécules anti-tumorales efficaces dans plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d’autres thérapies.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront injectées via sous-cutanée (1 fois) avec des cellules tumorales afin d’induire la croissance d’une tumeur. Les injections s.c. seront effectuées sur l’animal anesthésié (via anesthésie gazeuse) pour une durée maximale de 2 minutes. Les traitements anti-tumoraux seront administrés (maximum 1 fois par jour sur 3 semaines) via des injections intra-péritonéales, qui ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile pour une durée maximale de 30 secondes. La mesure des tumeurs s’effectuera sur souris vigiles au moins 3 fois par semaine avec une durée maximale d’une minute à l’aide d’un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Les traitement anti-tumoraux peuvent induire une perte de poids/d’appetit et de la diarrée. Le site des injections pourrait s’infecter. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (apparition de métastases, cachexie).

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, la réponse du système immunitaire à la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4776 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, tapis chauffants,). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour nos études, nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé́).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection d'un virus et implantation d'une fibre optique, puis des enregistrements en champ ouvert après administration de cocaïne pendant cinq jours, avant leur mise à mort pour analyses post-mortem, pour étudier le rôle du transporteur PMAT dans les effets de la cocaïne. Le porteur indique que la chirurgie peut causer un œdème et une douleur post-opératoire, prises en charge sous anesthésie et analgésie. Il affirme que les effets des drogues d'abus se produisent à l'échelle de l'"organisme entier" et ne peuvent être évalués que sur l'animal entier.

Objectifs

Les transporteurs de recapture des neurotransmetteurs exercent un contrôle étroit de la transmission synaptique dans le cerveau en assurant l'élimination des transmetteurs libérés dans la fente synaptique et leur recyclage dans les terminaisons des neurones. A ce titre, ils interviennent dans des processus importants pour les comportements liés à l’humeur et certaines maladies psychiatriques, comme la dépression et l’addiction. PMAT (Plasma Membrane monoAmine Transporter) est un transporteur atypique, dont le rôle dans le cerveau est encore mal connu. In vitro, il transporte préférentiellement la dopamine et la sérotonine. Il est exprimé dans le cerveau des humains et des rongeurs dans diverses régions et divers catégories de neurones, tels que des neurones glutamatergiques, GABAergiques et cholinergiques. Il module des comportements reflétant le niveau d'anxiété, l'activité locomotrice et les effets des drogues d'abus. Des anomalies importantes des taux des neurotransmetteurs aminergiques dans le cerveau ont été mises en évidence dans plusieurs régions cérébrales chez les souris mutantes pour le gène correspondant. Le projet présenté ici vise à préciser le rôle de ce transporteur dans l'activité de certains circuits cérébraux à l'aide d'une technique de photométrie par fibre.

Bénéfices attendus

Les addictions sont des désordres psychiatriques caractérisés par la dépendance physique et/ou psychologique à une substance ou une activité, avec des répercussions délétères sur l’individu. Les informations récoltées par ces expériences précliniques devraient clarifier le rôle d’un transporteur peu connu, PMAT (Plasma membrane monoAmine Transporter), dans les effets d’une drogue d'abus, la cocaïne. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de cette drogue sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris invalidées pour certains gènes (tels que PMAT ici) permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Les approches utilisées dans le projet permettent d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés. Ces connaissances pourront permettront d’approfondir les mécanismes qui sous-tendent les processus addictifs, afin d’élaborer à terme des thérapies plus efficaces pour traiter ces troubles psychiatriques. Ces travaux sont originaux et les expériences ne sont pas réalisées par d'autres laboratoires.

Procédures

Toutes les souris subiront 3 étapes séquentielles: 1- Une chirurgie stéréotaxique (classe modérée; durée 30-40 min). 2- Des enregistrements par fibre optique dans un champ ouvert, à l'état basal ou après administration de cocaine (classe légère; durée 1h30 min par session sur 5 jours consécutifs). 3- Une euthanasie, afin de valider les expériences (classe sans réveil; durée 20 min). La chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. L'administration par injection intra-péritonéale de cocaïne ou de saline n'engendre pas d'effets secondaires et n'altère pas les poids des animaux. Les souris sont surveillées pendant toute la procédure. L’effet hyperlocomoteur de la cocaïne est très rapide et dure 20 min. La cocaïne n’est pas associée à des effets secondaires indésirables notables. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Nous n'envisageons pas d'autres nuisances possibles lors des expériences proposées.

Devenir

A la fin de la procédure tous les 80 animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements et analyses post-mortem nécessaires au projet (immunofluorescence et analyse anatomique).

Remplacement

De manière générale, les effets à court ou long terme des drogues d’abus se produisent à l’échelle de l’organisme entier et donc ne peuvent être évalués de manière définitive qu’in vivo, sur l’animal entier. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de ces drogues sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris mutées pour des transporteurs de neurotransmetteurs permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Cette approche permet d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces aspects intégrés ne sont pas reproduits dans des modèles de substitution, comme des cellules en culture, et il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés.

Réduction

Afin d’en limiter le nombre, tous les animaux (80 en tout) sont soumis aux enregistrements en photométrie par fibre, puis ces mêmes animaux en bonne santé sont euthanasiés en vue des études anatomiques ou immunohistochimiques. Des groupes de 10 minimum doivent être utilisés afin d’obtenir des résultats statistiquement concluants sur les effets biologiques. La taille de ces effectifs est déterminée sur la base des études antérieures et de calculs de sensibilité.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les procédures sont optimisées pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique et l’implantation de la fibre optique sont réalisées simultanément sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris (4 par cage) sont hébergées dans une animalerie de stabulation ventilée (température 19-21 degrés C, cycle jour-nuit 12h-12h) avec accès à l’eau et croquettes ad libitum, et la litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Les animaux d’origine extérieure sont acclimatés pendant au moins une semaine avant le début des procédures. Nous travaillons en étroit lien avec l’équipe vétérinaire pour s’assurer que l’animal ne souffre pas face à une gêne, une détresse, une douleur ou une blessure. Si un animal est en souffrance, il est rapidement euthanasié.

Choix des espèces

L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine, et son système nerveux présente de multiples analogies avec celui des humains. Ceci nous permet d’identifier des processus transposables en physiologie humaine et médecine, y compris en ce qui concerne les mécanismes qui sous-tendent l'addiction. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé, avec une histoire fournie d’études pharmacologiques et comportementales en rapport avec l’addiction, ce qui permet de construire des hypothèses valides et pertinentes. Enfin, l'utilisation de la souris comme modèle autorise l'application de techniques moléculaires sophistiquées très informatives, telles celles mises en oeuvre dans ce projet (recombinaison homologue, transfert de gènes au moyen de virus), permettant d’aborder la fonction des gènes de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (âge entre 10 et 20 semaines). Il s’agit du stade pertinent pour évaluer l'effet des drogues addictives, les études chez les juvéniles sortant du cadre de ce projet de recherche.