Recherche appliquée

Selon leur groupe, des souris subissent une ligature des deux veines jugulaires, reçoivent des vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou portent un cathéter intracrânien pendant douze à quatorze jours, seules en cage, avec une injection par jour pendant six jours. 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour l'étude de leur cerveau et de la dure-mère, certaines au terme d'une mesure de pression intracrânienne menée sans réveil. Un régime gras rend une partie d'entre elles obèses pendant quatre à dix semaines, d'autres restent isolées jusqu'à 31 jours en cage d'activité locomotrice, pour tenter de reproduire l'hypertension intracrânienne idiopathique, maladie de la femme jeune en surpoids que l'équipe étudie aussi par IRM chez des patients. Les tests comportementaux, répartis sur deux jours et demi, ne sont pas nommés, et le porteur reconnaît que l'isolement des souris porteuses d'un cathéter "peut occasionner une souffrance de l'animal et des troubles du comportement".

Objectifs

Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de **696 souris non transgéniques.

Bénéfices attendus

D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.

Procédures

Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**

Impact sur les animaux

Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.

Réduction

Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). **A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 (n=36) dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux.** Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. **Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé.** Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de **696 souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.

Raffinement

A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.

Choix des espèces

Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.

Greffées de cellules humaines de sarcome dans un muscle ou dans une veine, des souris immunodéficientes développent une tumeur retirée par chirurgie quand elle atteint 1 000 millimètres cubes, afin de prolonger leur survie le temps de suivre l'apparition des métastases. L'opération peut entraîner une perte de poids et de mobilité pendant une semaine environ, et les métastases pulmonaires peuvent gêner la respiration. Les souris reçoivent des traitements par gavage ou par injection, et certaines subissent cinq irradiations par semaine pendant quatre semaines sur leurs métastases. Au total, 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin des traitements ou à l'atteinte d'un point limite, et leurs organes métastasés sont prélevés.

Objectifs

Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs rares très complexes et hétérogènes (plus de 70 sous-types différents) qui touchent environ 4000 personnes par an en France. Malgré une chirurgie bien conduite suivie de traitements par chimiothérapies ou radiothérapies, plus de 40 pourcent des patients développent des métastases. A ce stade métastatique, peu de médicaments sont efficaces et les progrès depuis les 20 dernières années sont faibles avec une médiane de survie globale qui est passée de 12 à 18 mois seulement. Il existe donc dans cette pathologie un réel besoin de nouvelles thérapies permettant de cibler les processus metastatiques afin d’améliorer significativement les chances de survie des patients. Notre équipe est localisée dans un centre de référence dans le traitement de ce cancer rare, ce qui nous offre la possibilité d'obtenir des tumeurs de patients et ainsi de pouvoir développer des lignées cellulaires et des modèles de souris xénogreffées avec ces tumeurs. A partir de ces modèles, nous avons mis en place une plateforme préclinique qui nous permet d’étudier les effets biologiques et pharmacologiques de nouveaux médicaments en développement. Ces nouveaux composés sont dans un 1er temps testés in vitro sur des cellules en culture et dans la mesure où ils sont concluants, ils sont testés sur des souris de laboratoire préalablement implantées avec des tumeurs de patients quand cela est possible ou des cellules cancéreuses. Cependant, ces modèles sont limités par le fait qu’ils ne font pas de métastases dans la souris du fait de l’injection des cellules en sous-cutanée. Nous souhaiterions développer de nouveaux modèles afin d’optimiser l’apparition de métastases, soit en injectant les cellules directement dans la circulation sanguine, soit en les injectant dans leur organe d’origine pour bénéficier d’un microenvironnement propice. Une fois ces modèles établis, nous testerons l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber ces processus métastatiques.

Bénéfices attendus

Les modèles de sarcomes des tissus mous métastatiques sont quasiment inexistants, or plus de 40% des patients développent des métastases. Il est donc primordial de trouver de nouveaux médicaments ciblant ces processus. Ce projet permettra d’avoir des modèles plus proches de la réalité du patient et de reproduire les processus métastatiques afin de trouver de nouvelles molécules les inhibant. Ces expérimentations s'inscrivent donc dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous.

Procédures

- greffes de cellules humaines en intramusculaire ou intraveineuse (une fois, durée 2min par souris) - Exerese de la tumeur primaire (une fois, durée 5min par souris) - Traitements medicamenteux par gavages / injections intrapéritonéales ou intraveineuses (durée et nombre de fois différents en fonction du traitement > une demande spécifique à chaque traitement sera soumise à la structure en charge du bien-etre animal) - Irradiations des metastases (radiothérapie) (durée 4 semaines à raison de 5 irradiations par semaine)

Impact sur les animaux

La procédure de xenogreffes en intramusculaire pourra provoquer un inconfort léger et diminuer la mobilité des souris. Lorsque que la tumeur primaire atteint une taille de 1000mm3, la souris sera opérée afin d’enlever la tumeur primaire et ainsi prolonger sa survie tout en permettant un suivi plus long de l’apparition des métastases. Cette chirurgie pourra provoquer une perte de poids ainsi qu'une perte de mobilité pendant 1 semaine environ. Dans le cas de métastases pulmonaires, des problèmes respiratoires peuvent survenir. En ce qui concerne l'administration des traitements, les gestes sont réalisés par du personnels expérimentés maitrisant ces injections. Ces gestes sont donc réalisés rapidement et n’entrainent que peu de stress chez l’animal. Cependant, pour les injections intraveineuses, des œdèmes éventuels et nécroses à la queue sont possible ; pour les gavages: cas de fausse route possible ; pour les injections intrapéritonéales: peu de stress

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des traitements, quand les tumeurs primaires atteignent 1000mm3 ou lorsqu’un point limite est atteint. Les souris sont euthanasiées puis leurs organes métastasés sont prélevés pour analyses.

Remplacement

Ces expérimentations s'inscrivent dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous. Nous avons étudié les effets biologiques et pharmacologiques de nombreuses nouvelles molécules en développement sur des lignées de sarcomes in vitro. Nous souhaitons dorénavant étendre ces études à un modèle plus complet qu’est le petit animal. En effet, l’oncogenèse et plus particulièrement l’apparition de métastases sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel avant de pouvoir réaliser les essais chez l'homme.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale des cellules greffées sera suivie tout au long des expériences ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés, le but étant d'obtenir des données significatives d'efficacité du médicament. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées par du personnel qualifié. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, utilisation de tapis chauffant et d'ocrygel, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Le but du projet étant de valider l’efficacité de nouvelles thérapies ciblées afin d'utiliser ces médicaments en clinique chez l'homme, il faut nécessairement un modèle de mammifères pour extrapoler les résultats. Nous avons donc choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes. Ce sont des modèles très immunodéprimés (ne possédant que très peu de système immunitaire) particulièrement adaptés à l'implantation de cellules tumorales. Animaux âgés de 8-12 semaines (jeunes adultes) pour qu’ils puissent supporter la greffe et le développement de la tumeur.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à un régime déficient en méthionine et choline qui déclenche une maladie chronique du foie, avec prises de sang et injection intra-péritonéale, la perte de poids servant de point limite. Le porteur indique surveiller le dos voûté et le poil négligé, et affirme utiliser un nombre "minimum mais nécessaire" d'animaux. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" car les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont associées au syndrome métabolique (surpoids, diabète, obésité, hypertension…). Le spectre de ces complications hépatiques va d’une stéatose simple (foie gras), à la stéatohépatite, puis à la fibrose, voire la cirrhose et au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation hépatique chronique à bas bruit joue un rôle crucial dans le développement des maladies dans cet organe. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à un stress microbien, métabolique et aux signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans le tissu adipeux et l’intestin. Ces organes participent au développement et à l'évolution des complications hépatiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine exprimée à la surface des cellules immunitaires et qui régule leur fonctions, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation. Chez les patients atteints d’une maladie chronique du foie, l’expression hépatique de CD44 est augmentée en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de ces complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle dans ces maladies. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. De plus, leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage (température, hygrométrie), d’hébergement (présence de tige en coton et d'igloo dans les cages), et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou CD8, dans un contexte de complications hépatiques. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces maladies qui actuellement de disposent pas de traitements pharmacologies.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum pouvant durer jusqu'à 1min (en fin de régime et en fin de procédure). Une injection intra-péritonéale sera également effectuée en fin de régime. Cette injection durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Au cours de ce projet, le principal effet indésirable est la perte de poids chez l’animal. Les animaux seront donc surveillés trois fois par semaine. Si des signes de souffrances (dos voûté, poil non-entretenu, indifférence du milieu extérieur…) s’ajoutent à la perte de poids, l’animal sera sacrifié pour limiter toute souffrance inutile.

Devenir

A la fin de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur organes. Ces organes sont ensuite utilisés afin de réaliser des analyses de biologie moléculaire et cellulaire indispensables pour notre étude.

Remplacement

Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel, ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites afin de confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.

Raffinement

Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour cette unique procédure, les souris seront mises sous régime déficient en méthionine et choline à partir de 20 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 30g. Les régimes déficients en méthionine et choline (MCDD) induisent un développement rapide des complications hépatiques. Cependant cette déficience en méthionine et choline induit une perte de poids qui nécessite l’utilisation de souris plus âgées (donc avec un poids plus élevé).

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus du Nil occidental via une injection dans le coussinet plantaire, puis reçoivent chaque jour des candidats médicaments avant prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'infection provoque un affaiblissement des membres postérieurs, une posture voûtée et une perte de poids, et qu'environ 30 % des souris meurent en dix à douze jours. Il présente le projet comme une prestation de service destinée à "répondre aux attentes de différents clients" et revendique un modèle "indispensable" faute d'alternative in vitro.

Objectifs

L'infection par le virus du Nil occidental (VNO) est une zoonose transmise par les moustiques qui est endémo-épidémique en Europe. Le virus se transmet entre les oiseaux par la piqûre de moustiques infectés et, accessoirement, les humains et d'autres mammifères peuvent être infectés. Environ 80 % des infections au VNO chez les humains sont asymptomatiques. La fièvre du Nil occidental (WNF) est la présentation clinique la plus courante. Les personnes âgées et immunodéprimées sont plus à risque de développer la maladie neuroinvasive du Nil occidental (WNND). Actuellement, les vaccins homologués ne sont pas encore prêts pour un usage humain, et le traitement est pour la plupart non spécifique et de soutien. Le développement d'un modèle de souris pour tester l'efficacité de médicaments anti-viraux ou vaccins permettra de contribuer à acquérir des données précliniques indispensables au développement de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

L'utilisation d'un modèle de souris pour étudier la physiopathologie de l'infection humaine par le virus du Nil occidental (VNO) peut contribuer à acquérir des connaissances concernant la cinétique de la réponse immunitaire et des voies spécifiques responsables du contrôle de l'infection par le VNO et de la clairance virale. Ce modèle préclinique in vivo permettra de tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments anti-viraux. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes. La demande d'un modèle préclinique prédictif est forte tant dans les domaines de recherche académique que dans les sociétés pharmaceutiques qui développent les molécules anti-infectieuses de demain, mais se heurte à une offre limitée.

Procédures

Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée mais le nombre de prélèvements est limité. Pour chaque injection (sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse) la durée maximale est de 1min, cela comprend le temps de la contention et de l'injection. Pour les prises de sang, l'animal est anesthésié dans la boite à induction pendant 2 à 3 min, puis la prise de sang est réalisée. L’animal est ensuite remis dans sa cage et surveillé. L’ensemble dure maximum 5 min. Pour des procédures dites « classiques », les souris anesthésiées seront infectées par le virus par injection dans le coussinet plantaire d'une patte arrière et l’administration de candidats médicaments sera réalisée tous les jours pendant maximum 12 jours avant prélèvement d’organes

Impact sur les animaux

Chez la souris, l'infection au WNV induit les signes cliniques habituels d'une maladie infectieuse : affaiblissement des membres postérieurs, posture voûtée, poil rugueux ou non soigné, activité réduite, respiration difficile, perte de poids et la mort dans 30% des cas. La cinétique de l'infection et des signes cliniques doit être établie pour chaque souche de virus car celle-ci varie considérablement d'un virus à un autre. 30% des souris infectées succombent à l'infection dans les 10–12 jours après l'infection, selon la dose d'inoculum.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les différents prélèvements. Il n’y a pas de possibilité de remplacement, vu le contexte hautement pathogène

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Faciles à travailler, les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie

Réduction

Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre estimé est 200 animaux / an. Le nombre d'étude variera en fonction de la demande client. En fonction de la diversité et du nombre des paramètres biologiques à analyser entre 8 et 15 souris seront nécessaires par groupe. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 40, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules à tester, doses différentes de la molécule testée).

Raffinement

Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Des sacs dégradables contenant la litière sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid et une bûchette en bois, comme enrichissement du milieu. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Afin de palier l'inconfort occasionné par l'injection dans le coussinet plantaire, des croquettes imbibées d'eau seront placées dans la cage afin de favoriser la prise alimentaire Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée aux procédures expérimentales par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant tous les gestes douloureux, lors des différentes injections des traitements potentiels (injection intraveineuse, injection intra-musculaire...). Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou stress sera mise à mort. Les critères d’arrêt utilisés sont: - Le suivi quotidien du poids - La combinaison de plusieurs des signes cliniques : posture courbée, piloérection, difficulté respiratoire, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Une grille de scoring (en annexe) permettra le suivi quotidien et une intervention précoce en cas de signes dus à la pathologie.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie Une infection systémique par le VNO est pratiquée chez de jeunes souris adultes (âgées de 6 à 10 semaines)

2 560 oiseaux, 640 poulets, 640 dindes et 1 280 autres oiseaux, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont inoculés avec des coronavirus aviaires puis soumis à des écouvillonnages oraux, cloacaux et trachéaux répétés, à des prises de sang et à la récolte de liquide lacrymal jusqu'en fin d'expérimentation. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhées, prostration et amaigrissement, et précise que le recours aux antidouleurs "n'est pas envisageable" car il interférerait avec l'infection virale. Il présente ces données comme "indispensables" à une meilleure gestion sanitaire des élevages.

Objectifs

L'objectif global de ce projet est de mieux caractériser les différents coronavirus aviaires circulants au sein des espèces principales de volailles d'élevage. Plus précisément, il s'agira d'étudier i) le pouvoir pathogène et infectieux de souches isolées de coronavirus aviaires (virus de la bronchite infectieuse, coronavirus de la dinde, coronavirus de la pintade, coronavirus du canard) sur l’espèce à partir de laquelle le prélèvement d’origine a été obtenu, et ii) la capacité de franchissement de la barrière d’espèces de ces coronavirus aviaires sur diverses espèces d’oiseaux d’élevage.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une caractérisation fine in vivo pour une meilleure compréhension du comportement des souches de coronavirus aviaires inoculées chez l’hôte cible et chez des hôtes voisins afin d’étudier la capacité de ces souches à infecter d’autres espèces aviaires et de pouvoir apporter des éléments indispensables à une meilleure gestion des mesures sanitaires et à un meilleur contrôle de la diffusion de ces agents dans les élevages.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Contention : sur tous les animaux, dès qu’une observation rapprochée des signes cliniques ou dès qu’un prélèvement s’avèrent nécessaires (environ 5 min par animal, dépendra du nombre de prélèvements à réaliser au moment de la contention) - Inoculation : sur tous les animaux, a lieu une seule fois en début d’expérimentation (1 min par animal) - Ecouvillonnages oraux et de l'orifice des voies génitales et urinaires : sur tous les animaux, quotidiens jusque 14 jours post-inoculation puis bi-hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (2 min par animal) - Ecouvillonnages trachéaux : sur tous les animaux, fréquence bihebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (1 min par animal) - Récolte du liquide lacrymal : sur tous les animaux, fréquence bi-hebdomadaire jusque 14 jours post-inoculation puis hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (2 min par animal) - Prises de sang : sur tous les animaux, fréquence bi-hebdomadaire jusque 14 jours post-inoculation puis hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (1 min par animal) - Mise à mort pour récolte d’organes : sur 3 sujets avec une fréquence hebdomadaire sur 5 semaines flexibles durant l’expérimentation, et sur les animaux restants en fin d’expérimentation

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus varient selon les virus inoculés. Cela peut être des râles et des éternuements pour le virus de la bronchite infectieuse, et des diarrhées, de la prostration, une diminution de la motilité et/ou un amaigrissement pour le coronavirus de la dinde, le coronavirus de la pintade et le coronavirus du canard. Outres les signes cliniques attendus suite à l'inoculation du virus, d'autres nuisances pour l'animal sont attendues : irritation passagère des tissus oro-pharyngés, trachéaux, cloacaux et oculaires suite aux écouvillonnages et à la collecte du liquide lacrymal, stress passager lors de la contention, léger hématome suite aux prises de sang, potentielles blessures contre les grillages des parcs d'hébergement.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux restants seront concernés par la mise à mort pour empêcher toute possibilité de répandre dans l'environnement les agents infectieux utilisés dans ces conditions expérimentales.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale n’a lieu que lorsque cela s’avère strictement nécessaire. Même si certains types cellulaires ou des systèmes in ovo existent pour la réplication des coronavirus aviaires, ces modèles ne sont pas applicables concernant la connaissance des maladies provoquées par ces virus chez l’animal et l’étude du tropisme d’hôte.

Réduction

La stratégie pour réduire au minimum le nombre d’animaux est basée sur deux éléments indissociables : l'expérience et les statistiques. Concernant l'expérience, le laboratoire peut s'appuyer sur son expertise dans le domaine en se basant sur de précédentes études utilisant le même type de données générées afin de travailler sur un effectif minimum d'animaux. Pour ce projet, compter par exemple sur 10 animaux en fin d’expérimentation devrait permettre d’avoir suffisamment de relevés du poids vif des animaux et de relevés du poids des organes récoltés post-mortem pour rendre les analyses robustes. Ces analyses se basent sur des tests statistiques où les analyses de variances (qui permettent de déterminer si tel ou tel paramètre étudié est statistiquement différent d'une condition expérimentale à une autre) qui seront réalisées nécessitent un effectif minimal pour permettre l'obtention de résultats fiables.

Raffinement

Le recours aux antidouleurs n’étant pas envisageable à cause de l’interférence générée avec l’infection virale, la stratégie appliquée pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse en cours d’expérimentation est la surveillance quotidienne des animaux, la définition de points limites conduisant à une mise à mort compassionnelle en cas d’atteinte, et la réalisation de prélèvements les moins invasifs possible et uniquement lorsque cela permet de répondre aux objectifs du projet. Pour limiter le stress des animaux, toutes les procédures sont faites individuellement sans que le reste des animaux puisse voir l’intervention.

Choix des espèces

Les espèces d’oiseau choisies sont soit l’espèce cible de l’agent viral étudié, soit une autre espèce qui pourrait être sensible à cet agent. Animaux de 1 jour à 30 semaines d’âge, selon la classe d’âge cible de l’agent viral utilisé.