Recherche appliquée

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire des épilepsies-absence, elles subissent la pose chirurgicale d'un implant crânien d'enregistrement (EEG) de 45 minutes et des prélèvements sanguins, pour tester si un jeûne intermittent réduit les crises. Le porteur indique que ces crises ne sont ni douloureuses ni convulsives et classe la procédure en modéré à cause de la chirurgie et des prélèvements. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour évaluer un modèle épileptique.

Objectifs

Historiquement, des changements de régime alimentaire ont été utilisés pour soigner les épilepsies. Notamment, un régime cétogène riche en protéines et gras, et faible en carbohydrates, est un traitement de choix pour certains types d’épilepsies pharmacorésistantes. Cependant, ce régime est assez désagréable, surtout pour les enfants, et ses effets secondaires sont très lourds. En nous basant sur des résultats issus d’autres pathologies, nous avons avancé l’hypothèse qu’un régime basé sur le jeûne intermittent (intermittent fasting, IF) consistant à limiter la prise alimentaire à certaines heures de la journée, sans restriction calorique, pourrait avoir des effets bénéfiques sur les épilepsies infantiles: les épilepsies “absence”. Le but de ce projet sera d'évaluer si le régime IF est capable d’améliorer le poids des crises épileptiques (nombre, durée) ainsi que les déficits cognitifs et comportementaux associés. Nous utiliserons 2 modèles d’épilepsie infantile “absence” chez la souris. Nous allons aussi examiner si le régime IF permet de baisser la dose efficace de médicaments anti-épileptiques communément utilisés en clinique (ex. ethosuximide, valproate), en réduisant leurs effets secondaires. En parallèle, nous essayerons de comprendre les régulations des réseaux neuronaux sous-tendant la pathologie, ainsi que les modifications métaboliques, physiologiques et transcriptomiques qui accompagnent le régime IF.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à une réduction des crises d’épilepsie et une amélioration des comorbidités comportementales en agissant uniquement sur la fenêtre de la prise alimentaire, pas sur sa quantité ni sur sa composition. Il s’agit d’une approche facilement transposable dans le cadre clinique et qui pourrait aider les patients atteints d’épilepsie dans leur quotidien. De plus, l’administration de médicaments durant le régime IF pourrait permettre de baisser la dose efficace de ces composés, en limitant ainsi leurs effets secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale, pour la pose d'un implant afin d'effectuer des enregistrements électroencéphalogramme (EEG), ainsi que des prélèvements sanguins à un mois minimum d'interval (voir chronogramme en annexe). L'acte chirurgical dure environ 45 minutes. Le prélèvement sanguin dure 10 secondes max entre la contention et l'acte de prélèvement.

Impact sur les animaux

Le régime IF a été prouvé comme étant bénéfique pour la santé chez l'homme et l'animal. A noter que les modèles d'épilepsie que nous utilisons n'induisent pas de crises convulsives (motrices) mais de perturbations cérébrales qui provoquent un arrêt de l'activité locomotrice pour quelques secondes, plusieurs fois par heure. Les crises ne sont donc pas douloureuses ni fatigantes. La procédure prévoit des prélèvements sanguins ainsi qu'une chirurgie: ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (perte de poids, détachement de l'implant EEG, dégradation de l'apparence physique ou troubles du comportement). C'est pour cela que la procédure est classée modérée. Cependant nous mettrons en place une grille de scores dès l'apparition de signes cliniques. D'autre part, selon notre expérience le type de chirurgie prévue est très bien supporté par les animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision et pertinence un modèle épileptique dans notre projet de recherche.

Réduction

Nous utiliserons un même animal pour l'exploitation de plusieurs tissus, ce qui nous permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l'étude. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé selon Dell et al. (Samplesize determination, Ilar Journal, 2002, 43 :207) et le logiciel G*power, sur la base de publications précédentes et de notre expérience de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences (niveau de significativité: p=0.05).

Raffinement

Des dispositions seront prises pour le raffinement des conditions d'élevage et d'expérimentation. Le maintien d'enrichissement de la naissance à l'expérimentation sera effectif dans toutes les cages. Un enrichissement supplémentaire de type paille en carton ("sizzle"), igloo, ou maison en carton sera mis en place en cas d'isolement des souris pour les besoins des expériences. Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le débuts de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d'anesthésie et analgésie. Une grille de score sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies.

Choix des espèces

L'espèce souris (Mus musculus) est un modèle très étudié dans tout projet de recherche. Les souris fournissent des excellents modèles d'épilepsie de type "absence", au cœur de notre projet. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Nous utilisons les animaux à partir de 6 semaines car c'est l'âge à laquelle les crises d'absence commencent à se manifester. Les animaux seront utilisés à 6 semaines d'âge, âge à laquelle les premiers symptômes épileptiques sont visibles sur nos modèles génétiquement modifiés.

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à six injections intraveineuses sous anesthésie et trois à quatre prélèvements sanguins au sinus rétro-orbital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut léser l'œil, pour évaluer l'immunogénicité d'une protéase modifiée destinée à éliminer des anticorps chez l'humain. À l'issue, elles sont tuées pour prélever le sérum et les organes lymphoïdes. Le porteur annonce peu d'effets indésirables au motif que la protéase agit peu sur les anticorps de souris, et renvoie le bénéfice clinique à de futurs médicaments.

Objectifs

Une protéase nommée IgG-degrading enzyme ou IdeS est produite par la bactérie Streptococcus pyogenes afin d'échapper au système immunitaire de l’hôte. Cette protéase digère les anticorps de type Immunoglobulines G chez l’homme, le lapin ou les primates non-humains, mais n’a pas ou peu d’actions sur les Immunoglobulines G de souris. Plusieurs groupes de recherche ont montré que la protéase IdeS peut être utilisée dans des modèles précliniques de maladies autoimmunes ou chez certains patients, pour éliminer, de manière transitoire, les anticorps de type IgG pathologiques. Cependant, l’utilisation de cette protéase chez l’homme se heurte à deux problèmes: sa courte durée de vie dans l’organisme avec une demi-vie de 3-5 heures et son immunogénicité, c’est-à-dire sa capacité à induire des anticorps neutralisant. Pour cette raison, l’utilisation de la protéase IdeS comme traitement chronique n’est actuellement pas possible chez l’homme. Les objectifs de ce projet sont de générer des protéases IdeS ayant une durée de vie prolongée dans l’organisme, et d’évaluer l’immunogénicité de ces protéases à demi-vie augmentée chez la souris. L’avantage d’une étude d’immunogénicité chez la souris réside dans le fait que les Immunoglobulines G murines sont peu ou pas digérées par l’IdeS ; Ceci devrait donc permettre d’étudier en détail le mécanisme d’action des IgG murines anti-IdeS, et notamment leur capacité à neutraliser l’activité de la protéase IdeS, sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS.

Bénéfices attendus

L'intérêt de l'utilisation de la protéase IgG-degrading enzyme a été démontré afin de lutter contre certaines maladies auto-immunes (Purpura thrombocytopénique, arthrite rhumatoïde), contre le rejet de greffe ou encore afin d'améliorer l'efficacité de la thérapie génique utilisant des vecteurs rétroviraux. L'utilisation de cette enzyme en clinique se heurte toutefois à sa courte demi-vie et à son immunogénicité. La validation préclinique de nouvelles protéases IgG-degrading enzyme recombinantes à durée d’action optimisée ouvrira la voie à la préparation de nouveaux médicaments plus efficaces. Ceci devrait ainsi permettre de réduire les fréquences d’injection de la molécule aux patients et de réduire les doses de molécules injectées, ce qui devrait diminuer la probabilité de développer des réponses immunitaires neutralisantes.

Procédures

Les animaux subiront 1 à 6 injections intraveineuse. Ces interventions (injection) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et ne durent que 10 à 20 secondes. Ils subiront également 3 à 4 prélèvements sanguins maximum. Ces prélèvements seront également réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. Dans certaines conditions expérimentales, les animaux subiront en plus des gestes cités précedemment 1 injection intrapéritonéale en tout début de procédure. Cette injection nécessite 10 à 20 secondes d'immobilisation de l'animal.

Impact sur les animaux

Les risques de lésions au niveau de l'œil existent du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité. Par ailleurs, les lots d’animaux seront divisés en 2 afin de limiter le nombre de prélèvements par animaux. Il n'y a pas d'effets indésirables particuliers attendus suite à l'injection d'IdeS car celle ci est peu active sur les IgG murines (pas de risque d'infection) et nous validerons l'absence d'endotoxine avant injection (pas de risque d'inflammation). L'injection unique d'IVIg par voie intra-péritonale ne présente pas non plus d'effet indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Le sérum et les organes lymphoïdes secondaires seront collectés pour l'évaluation de la réponse immunitaire anti IdeS ou pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment le catabolisme de l’IdeS et l’induction d’une réponse immunitaire anti-IdeS). Toutefois, toute information obtenue par l’expérimentation animale sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.

Réduction

Le nombre de répétition des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Nous prévoyons d'utiliser pour ce projet un nombre maximum de 345 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (5 souris maximum par cage, ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Les lésions au niveau de l'œil sont possibles du fait des cycles d’injections/ prélèvements au niveau du sinus rétro-orbital, mais ce risque est limité car nous maîtrisons ce geste et nous alternerons l'œil concerné. Différents groupes seront par ailleurs constitués afin de réduire le nombre de prélèvements par animal. Des points limites ont été définis, les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce qui permette d’avoir un nombre suffisant d’individus de même âge et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables. Par ailleurs, les IgG de souris étant peu sensibles à l’action protéolytique d’IdeS, cela nous permettra d’étudier plus aisément l'immunogénicité des variants de l'IdeS et la capacité des IgG murines anti-Ides (si présentes) à neutraliser l’activité d’IdeS sans que l’étude ne soit biaisée par leur dégradation par IdeS. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.

1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation entraînant une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent une injection intra-oculaire d'un composé à tester sous anesthésie, puis des examens du fond d'œil, une tomographie et un électrorétinogramme, avant d'être tuées au CO2 et par dislocation cervicale pour prélever les yeux. Le porteur signale que les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires. Il présente le travail comme une preuve de concept dont le passage en clinique reste renvoyé au conditionnel.

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est d’identifier des composés ayant un effet neuroprotecteur sur la dégénérescence des photorécepteurs dans un modèle murin de rétinite pigmentaire autosomale dominante. La finalité étant le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de maladies rétiniennes héréditaires, pouvant bénéficier au plus grand nombre de patients possibles.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’un ou plusieurs composés sur notre modèle de rétinite pigmentaire autosomale récessive. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique ce/ces composé(s) à visée thérapeutique pour des maladies héréditaires rétiniennes induisant une dégénérescence des photorécepteurs, pour lesquelles le développement de traitement spécifique à chaque mutation identifiée n’est aujourd’hui pas possible.

Procédures

- Injection intra-oculaire : tous les animaux de l’étude (1296) recevront une injection intra-oculaire (injection sous-rétinienne ou intravitréenne) de la thérapeutique à évaluer ; néanmoins l’injection est rapide (5 à 10 minutes) et se fera sous anesthésie générale. - Fond d’œil : suite à l’injection sous-rétinienne, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est très rapide (2 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude (1296) seront soumis à cet examen. - Tomographie à cohérence optique (OCT) : l’OCT permet de visualiser la structure anatomique de la rétine. L’acquisition d’images dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris. - Electrorétinogramme (ERG) : l’ERG permet d’évaluer la fonction de la rétine en conditions photopique et scotopique. L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée 4 semaines et 12 semaines après l’injection intra-oculaire de l’élément thérapeutique d’intérêt sur les animaux dont l’injection a été évaluée « correctement réalisée » lors de l’examen du fond d’œil, soit un maximum de 1296 souris.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). A l’issue de la procédure, les animaux seront sacrifiés par inhalation de CO2 et dislocation cervicale afin de prélever les yeux pour des analyses histologiques post-mortem.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que dans un modèle in vivo car les propriétés pharmacologiques du traitement ne peuvent être évaluées que dans des conditions physiologiques, pour notamment étudier l’interaction entre les vecteurs AAV et le système immunitaire de l’hôte. De même que le fonctionnement de la rétine et la vision ne peuvent être évalués qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (12 souris/groupe x 108 groupes = 1296 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). - Une anesthésie gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent, notamment pour les procédures courtes comme les injections sous-rétiniennes, les injections intravitréennes, les fonds d’œil et les OCT. Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intra-oculaires et les ERG. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéales/sous-cutanées. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’ERG), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux commerciaux observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Le modèle murin transgénique utilisé dans ce projet reproduit la pathologie étudiée : la rétinite pigmentaire autosomale dominante. Comme chez l’Homme, la mutation induit une dégénérescence progressive des photorécepteurs. Ces souris présentent une dégénération sévère des photorécepteurs dès l’âge de 3 semaines et une quasi absence totale de photorécepteurs vers 2 mois. Le but de cette étude étant de tester l’effet neuroprotecteur de nouveaux composés thérapeutiques au cours de la dégénérescence rétinienne, l’intervention thérapeutique interviendra avant que la dégénérescence des photorécepteurs n’atteigne un stade avancé, soit chez des souris âgées de 7 jours, 14 jours ou un mois.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en intraveineuse des vésicules extracellulaires portant la molécule CD146 sous anesthésie gazeuse, subissent une mesure du temps de saignement à la queue, avant mise à mort pour prélever la moelle osseuse. Le porteur indique attendre un stress physique ou thermique et une douleur légère, et présente l'étude comme la vérification des effets indésirables d'une thérapie déjà jugée efficace contre l'athérosclérose. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne permet d'évaluer les effets hors cible d'une thérapie sur l'organisme.

Objectifs

Ce projet permettra d'étudier les effets indésirables d'une thérapie constituée de vésicules portant une molécule d'adhésion ; le CD146. En effet, un protocole précédemment accepté a testé le bénéfice d'une nouvelle thérapie dans l'atherosclérose. : l'apport de CD146 sur les macrophages de la plaque d'athérosclérose par des vésicules extracellulaires. Nos études en cours montrent un effet significatif des ces vésicules dans la régréssion de la maladie athéromateuse. Les vésicules extracellulaires étant décrites comme pouvant être pro-coagulantes ou pro-inflammatoires, il est essentiel de vérifier que la vésiculothérapie proposée n'entraîne pas de phénomènes de coagulation ou d'inflammation qui pourraient être délétères dans l'athérosclérose. Ainsi, nous allons étudier l'effet de ces vésicules sur le phénotype inflammatoire des macrophages qui sont leurs cellules cibles privilégiées. Nous étudierons également le temps de saignement des modèles expérimentaux soumis à cette thérapie.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique dans la lutte contre l'athérosclérose.

Procédures

1/ injection dans la veine de vésicules extracellulaires après anesthésie gazeuse 2/Temps de saignement : Prélèvement de quelques gouttes de sang à la queue après anesthésie gazeuse 3/Extraction des cellules de la moelle osseuse sur animal euthanasié.

Impact sur les animaux

L'animal subit une injection, une anesthésie ainsi qu'une biopsie de la queue. Cela pourra entrainer par exemple : un stress physique léger, un stress thermique ou une douleur légère chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, en effet il est necessaire d'avoir un animal euthanasié pour récolter la moelle osseuse des tibias et des péronés.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucune autre alternative à l'utilisation d'un modèle murin pour tester le bénéfice global d'une thérapie dans l'athéroslérose, l'évaluation des effets indésirables hors-cibles ne pouvant pas se faire in vitro.

Réduction

Les souris seront observées avant d’initier le protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, deux protocoles différents seront testés sur le même animal sans que cela ne perturbe les données scientifiques. Ainsi, les souris qui seront soumises à un test de saignement pour évaluer l'effet de la thérapie sur l'hémostase, seront ré-utilisées pour leur extraction de moelle osseuse afin d'isoler et de mettre en cuture les macrophages in vitro.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages contenant de l'enrichissement. Aussi, si les animaux présentant des symptômes type infection, ils seront écartés des protocoles. Nous serons attentif à toute souffrance animal lors de l'élevage. En effet, si l'animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait l’analgésie peut être envisagée par administration d'un médicament anti-inflammatoire tant que les signes de douleur persistent.

Choix des espèces

La meilleure façon d'appréhender les effets indésirables et 'hors cibles' d'une nouvelle stratégie thérapeutique est de l'étudier dans un modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, seul le modèle murin adulte développe des plaques d'athérosclérose semblables à celle de l'homme.

1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des vecteurs viraux ciblant le tissu adipeux, par injection intrapéritonéale ou par chirurgie, certaines étant rendues lipodystrophiques par le tamoxifène ou obèses par un régime gras, puis subissent échographies, mesures de glycémie et tests de tolérance mensuels. Le porteur indique que la chirurgie comporte un risque d'infection et que les prélèvements répétés à la queue causent une douleur légère. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" pour observer les réponses physiologiques intégrées, les cibles ayant été identifiées en culture cellulaire.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que des altérations de la fonction du tissu gras dit tissus adipeux jouent un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. En effet, chez l'obèse, le tissus adipeux a dépassé sa capacité de stocker du gras, et ce gras va aller se déposer dans différents organes comme le coeur et le foie. Le tissu gras est composé de cellules spécialisées appelées les adipocytes. Notre équipe cherche à décrire les mécanismes qui font qu'un adipocyte en bonne santé devient malade. Au cours de ces 10 dernières années, nous avons identifié plusieurs cibles moléculaires impliquées dans la bonne santé des adipocytes. Afin de moduler l’expression de ces cibles dans le tissu adipeux (TA) nous collaborons avec une équipe américaine qui a développé des vecteurs viraux spécifiques du tissu adipeux.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de tester si les vecteurs viraux spécifiques du TA sont des bons moyens pour exprimer des protéines d’intérêt dans le TA dans une visée thérapeutique. D'autre part, plusieurs travaux s'intéresse à des structures qui se trouve dans les adipocytes et qui participe à la comunication intra cellules. Ces structures sont des points de contact entre deux organelles cellulaires majeurs, les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Ces structures sont appellées les MAM. Nous émettons l'hypothése que ces structures sont noeuds de comunications importants qui contôlent l'état de santé des adipocytes. Ainsi, le deuxième but est de savoir si la modulation des MAM peut être une cible thérapeutique contre les dysfonction métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

La lipodystrophie partielle est induite par 5 jours d’injection intrapéritonéale d'un agent pharmaceutique, le tamoxiféne. Pour les souris HFD nous commençons à nourrir des C57bl6 avec un régime gras à l’âge de 8 semaines. Nous nourrissons les souris pendant 1 mois puis nous démarrons les interventions génétiques. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, 100 µl d’une solution d’AAV sera injectée en intrapéritonéal. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, l’injection se fait directement dans le dépôt par une chirurgie. Cette procédure a lieu1 fois pendant et dure 20 minutes Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Pour l'induction de la lipodystrophie partielle, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour les souris HDFD, le régime gras entraîne une prise de poids mais n’a pas d’effet néfaste sur le bien être des souris. Pour cibler spécifiquement le tissu adipeux gonadal, les injections intrapéritonéales donnent une douleur légère associée à l’administration d'un produit non néfaste sur le bien être des animaux. Pour l’administration dans le tissu adipeux sous-cutané inguinal, la chirurgie comporte un risque du fait des infections possibles. Pour les test de tolérance, les prélèvements multiples à la queue entraine une douleur légère. L'administration du glucose par gavage oral qui entrainne un léger stress sur les souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir le rôle physiopathologique des acteurs étudiés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance de certains acteurs protéiques dans le maintien de la bonne santé du tissu adipeux et de la bonne santé métabolique de l’animal au niveau systémique. Ces cibles ont été identifiées in vitro et ce travail est parallèle à des études cellulaires complémentaires. Cependant, une validation in vivo est indispensable, notamment pour l’étude des conséquences de la modulation de l’état du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les cibles testées ici ont toutes étaient identifier par des expériences réalisées sur des lignées de cellules. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement tester dans des lignées cellulaires. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 1120 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests non paramétriques de Mann and whitney pour tester la valeur statistique de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se feront avec des anesthésiques, des analgésiques et en condition de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Les 3 modèles murins utilisés sont bien maîtrisés au laboratoire et ont été largement étudiés. Notamment, ces modèles permettent d’étudier les conséquences de la dysfonction adipocytaires sur d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Pour les BSCL2K0, nous utiliserons des souris de 8 semaines, âge auquel elles sont déjà sévèrement lipodystrophiques. Pour les iATSKO, nous utiliserons des souris de 8 semaines lors de l’induction de la délétion par le tamoxifène en accord avec nos résultats précédents. Pour les souris HFD, des souris sauvages seront mises sous régime gras à l’âge de 8 semaines.