Recherche appliquée
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- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
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- Troubles gastrointestinaux
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Développement d’un vecteur AAV de thérapie génique plus efficace dans le cadre du traitement de l’hémophilie B.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie, génétiquement modifiée pour être hémophile, saigne spontanément, et toutes reçoivent une injection de vecteur viral puis jusqu'à douze prélèvements de sang par sectionnement du bout de la queue. Le projet cherche à mettre au point des vecteurs AAV plus efficaces contre l'hémophilie B et d'autres maladies du foie. Le porteur affirme qu'après un tri sur cultures de cellules il faut mesurer l'efficacité sur un "organisme entier" capable de réagir au traitement.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie génétique due à un déficit du facteur de coagulation IX (FIX). L’incidence est de 1 à 2 cas pour 25 000 naissances. Elle est causée par des mutations du gène F9, qui se trouve sur le chromosome X. La fabrication de la protéine appelée facteur IX de la coagulation va être endommagée. Chez une personne saine, cette protéine est produite dans le foie et va être relachée dans la circulation sanguine. Elle joue un rôle essentiel dans le système de la coagulation: elle permet de former des caillots sanguins en réponse à une blessure. Quand le gène F9 est muté, la quantité de facteur de coagulation IX est réduite dans la circulation sanguine, ce qui empêche la coagulation normale du sang et provoque des épisodes de saignements excessifs. Actuellement, le traitement principal est un traitement de substitution qui consiste à administrer par voie intraveineuse des concentrés de FIX purifiés ou du FIX recombinant. Cependant ces traitements ont plusieurs inconvénients tels que les infusions répétées par intraveineuse. Le but de ce projet est de développer des outils plus performants lors de traitement par thérapie génique AAV de maladies hépatiques, telles que l'hémophilie B. Pour cela, on veut développer des capsides AAV (« boite de transport du médicament ») et des promoteurs (permet l’expression du médicament dans un tissus particulier) spécifiques du foie ce qui nous permettra d'augmenter la stabilité du gène médicament au cours du temps et ainsi éviter les problèmes de réaction immunitaire. Pour se faire, nous avons réalisé des modifications de capsides AAV, pour augmenter la spécificité du vecteur pour les cellules du foie. Parallèlement, nous allons tester différents promoteurs pour définir ceux qui permettent une efficacité supérieure à notre contrôle. Grâce à cela, nous réaliserons des combinaisons pour essayer de rendre synergiques les effets. Le but final étant de trouver un candidat thérapeutique qui permet une expression à long terme de notre gène médicament dans un contexte de maladie hépatique, comme l'Hémophilie B, mais adaptable à d'autres maladies hépatiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet et de développer de nouveaux outils de traitement des maladies hépatiques. Ces outils permettront au traitement d’être plus efficace, plus stable, moins et moins couteux. Ces outils développés seront directement applicables pour améliorer le traitement de l’hémophilie, déjà existant.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection de vecteurs AAV en début de protocole, puis à différents prélèvements de sang hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) ou mensuels (M1 à M12).
Impact sur les animaux
Nuisances souris WT : 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins hebdomadaires (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois, clip tail. Nuisances souris KO : Souris au phénotype dommageable (saignement), 1 injection IV (J0), 5 prélèvements sanguins (J1, J7, J14, J21, J28) pendant 1 mois pour l'étude à court terme ou 12 prélèvements sanguins (de M1 à M12) pour l'étude à long terme, clip tail. Pour les deux phénotypes : Stress au moment de l'injection ou des prélèvements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de récupérer le foie pour les analyses.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l'utilisation du modèle animal, nous avons réalisé un premier tri parmi notre liste de candidats (vecteurs viraux AAV) grâce à l'utilisation de culture cellulaire de foie humain. Néanmoins, nous devons approfondir ces résultats en mesurant l’efficacité de ces traitements sur un organisme entier, pouvant réagir contre ce traitement (par exemple, à cause de la réponse immunitaire) et également mesurer son efficacité de traitement sur une maladie hépatique.
Réduction
Afin de d'utiliser le moins d'animaux possible, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats suffisamment fiable (6 souris par groupe soit 612 souris). Le nombre de souris déterminé ici est le nombre maximal de souris utilisé, si la première étape n'aboutit pas à des résultats concluant, nous ne passerons pas aux étapes suivantes. De même, si le nombre de candidats efficace est inférieur à ce dont nous avons prévu, moins de souris seront utilisées. De plus, nous allons prioriser l'utilisation d'animaux sains (486 souris) lors de la sélection de nos meilleurs candidats, cela permettra d'obtenir des animaux plus rapidement (il est plus facile d'accoupler des animaux sains que malades et le nombre de petits par portée est plus important) et permettra aussi de limiter la génération de souris malade.
Raffinement
Les souris seront maintenues en élevage en nombre réduit par cage afin de limiter les bagarres entre souris, pouvant entrainer des blessures et saignement (4 souris par cages). Les souris seront observées régulièrement : les souris dominantes seront isolées, les souris blessées seront soignées (plaies désinfectées et cautérisées) pour éviter les hémorragies. Si une hémorragie ne peut pas être stoppée, la souris sera euthanasiée afin d'éviter des souffrances inutiles. Le nombre d'accouplement mit en place sera réduit au strict nécessaire afin de ne pas générer de souris inutilisée.
Choix des espèces
Les souris hémophiles présentent une activité de coagulation réduite conduisant à des hémorragies spontanées dans les tissus du coussinet plantaire et des hémorragies sous-cutanées. Ce modèle de souris hémophile est très proche de la maladie humaine. Les souris malades sont viables, fertiles et de taille normale. Nous utiliserons des souris mâles adultes, car c'est une maladie qui touche uniquement les males (souris ou humains). Les souris adultes seront injectées entre 6 et 8 semaines de vie, ce qui correspond à un âge adulte pour la souris, et nous permettra de comparer avec l’âge des adultes que nous souhaitons traiter.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité, de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs pour la réparation et le remplacement osseux et dentaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Troubles musculosquelettiques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cochons : 25
Moutons : 50
90 chiens, cochons et moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la gravité va de légère à sévère, 24 étant opérés puis tués sans réveil. Ils subissent des implantations chirurgicales, des prélèvements et des séances d'imagerie répétées pour tester des dispositifs de réparation osseuse et dentaire destinés au marché. Le porteur présente le suivi comme calqué sur le "cheminement d'un futur patient" et une obligation réglementaire. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et qualifie l'expérimentation sur "l'organisme entier" d'"indispensable" et d'"incontournable".
Objectifs
L’évaluation et le développement des nouveaux dispositifs et techniques pour le traitement chirurgical des affections osseuses et dentaires, par des méthodes de chirurgie standard et mini-invasives nécessite une phase de recherche et développement qui permet de mettre au point le dispositif et/ou la technique développées. En effet, les différentes itérations de prototypes doivent être confrontées à la modélisation animale pour reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients. Le raffinement des prototypes pour en geler les versions jugées efficaces (efficacité) et sécuritaires (innocuité) est la phase initiale du projet, elles entreront alors dans la phase règlementaire du projet pour valider les dispositifs, méthodes et techniques selon la règlementation en vigueur (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58).
Bénéfices attendus
L’avantage escompté est une amélioration des capacités diagnostiques ou par exemple de la durabilité des implants, en permettant par exemple d’éviter le rejet de ceux-ci (et ainsi en éviter les réopérations parfois multiples des patients), réduire le traumatisme tissulaire, permettre une récupération plus rapide. Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences médicales / techniques mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, et plateau technique de bloc opératoire et d’imagerie de pointe). La chronologie classique d’implantation et de suivi clinique et d’examens complémentaires permettra d’assurer un cadre d’évaluation scientifique pertinent mais aussi un suivi rapproché et poussé de l’évaluation de l’état de santé générale et du bien-être des animaux implantés impliqués dans ces procédures.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Des prélèvements sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine. -Des procédures d’imagerie telles décrites dans la procédure n°1. La fréquence des examens d’imagerie post-implantation (de contrôle) pouvant être couramment d’un examen par semaine. -Une procédure d’implantation chirurgicale telle que décrite dans la procédure n°2, pour une partie des animaux du projet -Une procédure d’évaluation finale avec euthanasie et autopsie telle que décrite dans la procédure n°3, pour l'autre partie des animaux du projet.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont en tous points similaires à ceux attendus sur un futur patient humain : - la mise à jeun de l’animal préalablement à l’anesthésie, la préparation de l'animal à l’anesthésie (quelques minutes), - le réveil de l’anesthésie avec états de confusion possibles (quelques minutes) - les suites post-opératoires (inflammation, douleur : quelques minutes à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique), des mesures de raffinement sont mises en place pour minimiser ces effets (voir plus haut).
Devenir
A l'issue de la procédure d'imagerie non invasive, tous les animaux sont maintenus en vie. Cette procédure consistant en une étape de sélection (screening) ou de contrôle (suivi fonctionnel) des animaux utilisés dans le projet. Pour les autres procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit une évaluation complète des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients represente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et leur durabilité. Il n'existe aucune méthode alternative pour répondre à la question scientifique du projet, l’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux chirurgicalement implantables.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasive sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Cette étape de screening permise par l'imagerie, permet de selectionner les animaux présentant l'anatomie la plus adaptée et de ce fait de réduire le risque de procédures infructueuses ou dont les résultats seraient scientifiquement contestables.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en œuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale, tous les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’analgésiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Les animaux sont hébergés dans des conditions d'ambiance maîtrisées et contrôlées et systématiquement en groupe ou individuellement pour les besoins de l'étude. Ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique). La plateforme d'imagerie permettant les screenings et les contrôles fonctionnels est située sur le site d'hebergement afin de supprimer le stress induit par des transports. Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie qui ressemble à celle de l’homme avec les mêmes dimensions, ce qui impose l’expérimentation sur des gros animaux pour mimer l’anatomie de patients humains qui vont de l’enfant à l’adulte de grande taille. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique implique d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Détermination de la dose maximum tolérée de composés pharmacologiques, candidats-médicaments, chez la souris.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des candidats-médicaments de 1 à 35 jours consécutifs, jusqu'à deux fois par jour, pour déterminer la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité. Le porteur décrit des effets possibles comme des troubles gastro-intestinaux, des douleurs aiguës et une perte de poids, qui servent justement à repérer le seuil de tolérance. Il conclut à l'absence de modèle alternatif assez intégré et qualifie le recours au modèle animal d'"incontournable".
Objectifs
Le progrès de ces dernières années, dans le domaine de compréhension des pathologies humaines, a ouvert la voie sur d’autres stratégies thérapeutiques, qui peut avoir un impact important dans l’amélioration de prise en charge des patients. Avant de tester l'efficacité des candidats médicaments dans les modèles animaux de pathologies humaines (exemple : maladies inflammatoires, maladie neurodégénératives, infections virale) nous souhaitons déterminer la dose maximum tolérée par la souris. Notre objectif est de déterminer la dose maximum toléré par la souris, sans aucun effet secondaire, pour l’animal, pour que par la suite, les études d’efficacité, puissent se faire de manière optimum.
Bénéfices attendus
Le bénéfice porte sur la santé humaine (la mise au point des traitements plus efficace). Et le déroulement suit le même « schéma » qu’une étude clinique chez l’homme. C’est-à-dire une phase 1 pour déterminer la dose maximum toléré par les individus avant de commencer une étude d’efficacité (phase 2).
Procédures
Dans ce projet les animaux seront soumis aux interventions suivantes : administration du candidat médicament (dure quelques secondes). L'administration intraveinuese se fera sous anesthésie (dure environ 30 à 40 min). Le composé pharmacologique testé pourra être administré de 1 à 35 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour selon le protocole et l’objectif de l’étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris, sont principalement le stress causé lors de la préhension et les administrations répétées des composés pharmacologiques. Les candidats médicaments sont administrés aux animaux selon différentes voies d’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse peuvent entrainer une inflammation et induration au niveau de site d’injection. De même, nous ne pouvons exclure un risque de fausse route lors de l’administration des composés par voie orale. D’autre part, bien que tous les candidats médicaments auront été sélectionnées pour leur innocuité lors des analyses in-vitro, des effets indésirables peuvent survenir tel que des troubles gastro-intestinaux, des douleurs aigues, une perte de poids… qui sauront être mise en évidence lors de ces études de tolérances.
Devenir
Tous les souris de ce projet seront mis à mort afin de collecter le sang et les organes qui seront utilisés pour les analyses ultérieurs.
Remplacement
Du fait de l’absence de modèles alternatifs suffisamment intégré et complexe pour permettre d’évaluer la biodisponibilité d’une molécule, qui met en jeu les mécanismes d’absorption, de distribution, de dégradation, de transport et d’élimination des composés susceptibles d’affecter l’activité des molécules, l’emploi de modèle animal est incontournable.
Réduction
Seuls les molécules présentant le meilleur rapport efficacité/innocuité in vitro seront étudiées chez la souris. De plus avant de démarrer le protocole avec les souris, nous faisons une série de vérification pour être sûr que le produit administré présente le profil pour être administré à l'animal. Si le produit ne répond pas à ces attentes il ne sera pas étudié. Nous faisons une étude avec 5 souris par groupe ce qui est suffisant pour évaluer la dose maximale tolérée par la souris pour les futures études d'efficacité des candidats médicaments. En effet nos études antérieures ont montré que 5 souris par groupe est suffisant pour mettre en évidence des troubles liés aux candidats-médicaments et ainsi nous permettre d’identifier la dose maximum tolérée chez la souris.
Raffinement
Durant l'étude, nous portons une attention particulière au bien-être de l'animal. Ils sont hébergés en groupe dans des cages enrichies de coton. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état générale des animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de choix pour étudier la tolérance de composé pharmaceutique d'autant plus que des études d'efficacité vont être poursuivis sur des souris. En effet, efficacité de plusieurs médicaments aujourd'hui sur le marché ont été évalués grâce à ces modèles chez la souris. Les souris auront 5 semaines minimum. Les animaux doivent être adulte, afin d'avoir un système immunitaire, et métabolique fonctionnel.
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie au cou, l'induction d'un caillot dans l'artère carotide par électrolyse de la paroi du vaisseau, puis 40 minutes d'imagerie de fluorescence. Le porteur teste si un anticorps ciblant les plaquettes empêche la formation d'un thrombus occlusif, dans la perspective d'un futur essai clinique. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du processus et que les plaquettes, cellules sans noyau, ne peuvent être cultivées.
Objectifs
Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Un nouvel agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique. Nous avons récemment observé que cet agent entraine une désagrégation d’un thrombus plaquettaire non occlusif. Ce projet vise à déterminer si cet agent est également capable de prévenir la formation d’un thrombus occlusif dans l’artère carotide chez la souris. Cette étude pourrait suggérer qu'un tel agent soit particulièrement efficace pour traiter la thrombose artérielle occlusive et ainsi justifier l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme et pour de nouvelles indications thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur deux aspects différents : •Premièrement l'agent ciblant les plaquettes a déjà montré une efficacité anti-thrombotique lors d’un essai clinique en prévention d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral). Nous souhaitons poursuivre l’étude de l’effet de cet agent dans le cas cette fois ci de thrombus occlusif plus sévère pour proposer de nouvelles indications. •Dans un deuxième temps si les résultats sont encourageant, une étude clinique pourra être envisagée sur des patients souffrant d’un thrombus occlusif.
Procédures
L’ensemble de la procédure expérimentale est réalisée sous anesthésie générale plus anestésie locale de la peau au moment de l’incision et elle est sans réveil. Tous les animaux subiront : • Une anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale de la peau. • Une injection d’un mélange d’un anticorps anti-fibrine couplé à un fluorochrome d'un marqueur fluorecent des plaquettes • Tonte de la face ventrale du cou et nettoyage de la peau • Induction du thrombus par electrolyse à la paroi externe du vaisseau • Imagerie par macroscopie de fluorescence pendant 40 min
Impact sur les animaux
Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long de la procédure. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du cou de la souris sera réalisée sous anesthésie générale et anesthésie locale au moment de l’incision de la peau. A l’issu de l’expérience, les animaux anesthésiés seront mis à mort.
Devenir
Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Les groupes expérimentaux seront comparés en utilisant des tests statistiques pertinents permettant d’évaluer le potentiel anti-thrombotique d’anticorps antiplaquettaire dans le cas de formation de thrombi occlusifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humain chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Rôle de la chimiokine CCL5 dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique chez la souris: implications physiopathologiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 72 opérées puis tuées sans réveil. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras de trois mois, elles reçoivent une canule implantée dans le cerveau et une mini-pompe sous-cutanée pendant trois mois, puis subissent 96 prélèvements de sang chacune au fil de tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate. Le porteur étudie le rôle d'une molécule pro-inflammatoire, la CCL5, dans la dérégulation de la glycémie par l'hypothalamus, en vue de cibles médicamenteuses renvoyées au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme que seul un modèle in vivo chez "l'animal entier" permet de comprendre ce phénomène et conclut à l'utilisation de la souris.
Objectifs
L’obésité associé au diabète de type 2 (DT2) représente un problème majeur de santé publique dans la mesure où 11% de la population mondiale est obèse et 300 millions de personnes sont affectés par un DT2 selon l’« International Diabetes Federation ». 80% des personnes développant un DT2 sont obèses soulignant ainsi un lien étroit entre les 2 pathologies et, de fait, l’insulino-résistance est une caractéristique commune de l’obésité et du DT2. Ce lien étroit entre l’obésité et le DT2 nous incite à identifier les mécanismes fondamentaux couplant le contrôle de la balance énergétique et la régulation de la glycémie. De récentes études scientifiques suggèrent que l'inflammation favorise le développement de l'obésité et de l'hyperglycémie chronique caractérisant le diabète de type 2. Notre projet a pour objectif d'étudier les effets d'une substance pro-inflammatoire (CCL5) sur le développement de l'obésité et du DT2 au niveau d'une région bien précise du cerveau, l'hypothalamus qui contrôle le métabolisme énergétique et glucidique.
Bénéfices attendus
Si le contrôle de la glycémie par le cerveau reste un domaine de recherche encore peu exploré et mal compris, il ouvre de larges perspectives thérapeutiques. En effet, le système gluco-régulateur de l’hypothalamus pourrait intervenir à hauteur de 50% dans le maintien de l’homéostasie glucidique. Il semble donc probable que des dysfonctionnements de la régulation centrale de la glycémie participent au développement du diabète. L'identification de nouvelles molécules pouvant induire un dysfonctionnement du contrôle de la glycémie par le cerveau devrait permettre d’ouvrir de nouvelles voies pour le développement de médicaments anti-diabétiques et d’améliorer le traitement de cette pathologie.
Procédures
Cette étude sera réalisée sur des souris soumises à un régime standard et à un régime riche en lipide de 3 mois qui les rend obèses et diabétiques. Une puce électronique de traçabilité sera injectée dans l’espace sous-cutané interscapulaire après anesthésie. Les animaux seront hébergés à température (22°C) et humidité constantes et exposés à un cycle de 12h-12h lumière/obscurité. Les souris auront un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Dans le cas de la procédure 2, les animaux subiront la pause d'une canule en intracérébroventriculaire ainsi que d'une mini-pompe osmotique en sous-cutané (cette opération prend environ 30 mins) qui seront implantés pour une durée de 3 mois. Les souris seront ensuite laissées au repos pendant 2 semaines avant qu'elles soient soumises à la batterie de tests physiologiques. Chaque souris de chaque lot sera soumise successivement à l'ensemble des tests physiologiques afin de réduire le nombre d’animaux impliqués dans le projet. Au cours de chaque test, des prélévements da sang seront effectués à partir de la queue des animaux. Pour l'ensemble des tests (glycémie de base, test de tolérance au glucose, test de tolérance à l'insuline, test de tolérance au pyruvate et test de sécrétion d'insulie), chaque souris subira 96 prélèvements de sang. Chaque test comprendra 22 prélèvements (sauf pour le test de sécrétion d'insuline qui ne comprendra que 6 prélèvements) et la souris aura une période de récupération d'une semaine entre chaque test.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Le traitement par la chimiokine CCL5 ou par l'antagoniste du récepteur CCR5 n'entraine que très peu d'effets indésirables ou de nuisances chez la souris dans des études antérieures menées par d'autres équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études. De même, les injections ip de glucose, insuline, pyruvate sont utiliées en routine par de nombreuses équipes de recherche et par nous-même, et aucun effet indésirable n'est constaté pour ces substances aux doses administrées. Enfin, les actes chirurgicaux décrits dans cette DAP sont eux aussi réalisés en routine au sein de notre équipe et aucun effet indésirable sur le comportement et la santé de l'animal n'a été constaté sur la longueur du protocole expérimental.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront euthanasiées à l'issue du protocole expérimental. De même, les animaux prévus pour des prélévements d'organes seront euthanasiées.
Remplacement
Au cours de ce projet, les effets de la molécule pro-inflammatoire CCL5 seront tout d'abord évalués in vitro sur une lignée de cellules neuronales hypothalamiques, la lignée mHypoA-59, ce qui nous permettra d'excure certaines hypothèses de travail et ainsi réduire sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés pour les tests physiologiques qui ne peuventêtre réalisés que chez l'animal entier.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, l'ensemble des 5 tests physiologique prévus pour évaluer l'homéostasie glucidique sera réalisé successivement sur une même souris afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d'une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précedent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur (pose des puces de traçabilité, incision, actes chirurgicaux) sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale selon la méthode la plus adaptée) afin d’en minimiser l’impact au maximum. De plus, les animaux recevront en pré-opératoire et à 6-8 h puis 12-16 h post-opératoire un traitement analgésique pour prévenir la douleur. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par la mesure des prises de nourriture et de boisson, et le suivi du poids de chaque animal. Au cours des expérimentations, une observation continue des animaux nous permettra d’arrêter le protocole en cas de souffrance.
Choix des espèces
Pour ce projet, des souris mâles âgées de 10 semaines en début d'expérimentation seront utilisées car c'est la physiologie adulte qui sera étudiée. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, le rôle de la chimiokine CCL5 dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec les données obtenues chez l’homme. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes.
Fibrose pulmonaire : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques dans des modèles de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée ou par irradiation sous anesthésie, puis des composés à tester sont administrés par de multiples voies. Le porteur annonce une perte de poids de 15 à 20 % et des difficultés respiratoires, et prévoit une trachéotomie sous anesthésie profonde juste avant la mise à mort pour mesurer la mécanique pulmonaire. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire l'efficacité, ce qui justifierait le recours au rongeur.
Objectifs
L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de fibrose pulmonaire. La fibrose est la conséquence de l’activation chronique des fibroblastes et myofibroblastes qui se mettent à produire en permanence du tissu cicatriciel (dépôts de collagène, élastine, fibronectine). Dans les poumons, l’apparition de ce tissu cicatriciel s'accompagne ou est précédée d’une phase inflammatoire. La fibrose pulmonaire cause une perte d’élasticité du poumon et une insuffisance respiratoire chronique. Il n'existe pas de médicament éliminant la fibrose pulmonaire, les traitements disponibles ralentissent uniquement la progression de la maladie. La bléomycine (agent anti-cancéreux utilisé chez l’homme) est connue pour se concentrer dans les poumons, avec comme effet secondaire délétère le développement chez le patient d’une fibrose pulmonaire. Chez le rongeur, instillée par voie intratrachéale sous anesthésie générale ou par voie sous-cutanée via une mini-pompe la bléomycine induit une fibrose pulmonaire semblable à celle observée chez l’homme. Celle-ci atteint son maximum entre 3 et 4 semaines, puis se résout spontanément 6 à 8 semaines après exposition. La fibrose pulmonaire peut aussi être induite consécutivement à une radiothérapie anti-cancéreuse du poumon. C’est un effet secondaire sévère connu chez le patient car les rayons entraînent une destruction des tissus cancéreux mais aussi des tissus sains, avec une très forte inflammation et une cicatrisation anarchique. Le développement de la fibrose pulmonaire induit par la radiation est plus lent à se mettre en place, et dépend de la dose et de la fréquence des rayons. Ce projet reproduira chez le rongeur la pathologie pulmonaire fibrotique telle qu’elle est observée chez l’homme, et permettra l’évaluation de composés anti-fibrotiques. L’efficacité des composés testés sera déterminée par la mesure de marqueurs circulants et pulmonaires (TGFβ, dépôts de collagène, hydroxyproline…) ou encore par l’évaluation de l’évolution de la pathologie par imagerie. Les composés chimiques ou biologiques qui seront évalués dans ce projet auront au préalable été sélectionnés sur des critères de puissance et d’efficacité in vitro. En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique par exemple par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la fibrose pulmonaire. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.
Procédures
La fibrose pulmonaire sera induite sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit par administration intra trachéale unique ou sous cutanée (à l’aide d’une minipompe osmotique pendant 28 jours) de Bléomycine soit par exposition à des radiations (unique). Ces deux procédures auront lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). La phase in vivo pourra durer jusqu’à 35 jours pour la fibrose induite par la bléomycine et jusqu’à 15 semaines pour les radiations. Les volumes administrés respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. Des mesures de saturation en oxygène, sur animal anesthésié ou vigile, pourront être effectuées au cours des procédures. Les mesures vigiles impliquent que les animaux soient placés en hébergement individuel environ 1 heure. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus, lavages broncho-alvéolaires. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous attendons une perte de poids chez les animaux, de l’ordre de 15 à 20%, du fait de l’inflammation générée. Par ailleurs, nous attendons des signes de difficultés respiratoires.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Chez la souris, dans le modèle Bléomycine, d’après la littérature et d’après les études déjà réalisées dans notre laboratoire et sur la base de tests de type ANOVA, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (dosage hydroxyproline). Ce nombre pourra monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse histologique et dosage TGFb actif ou total). Par ailleurs, étant donné que certains animaux ne répondent pas à la procédure d’induction, 5 animaux supplémentaires par groupe seront systématiquement intégrés. La même stratégie sera appliquée lors de la mise en place du modèle induit par la radiation chez la souris.
Raffinement
Pour la mesure de saturation sur animal vigile, afin de limiter le stress lié à l’hébergement individuel durant la mesure, les animaux seront maintenus en contact visuel avec leurs congénères via une paroi transparente. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. • Entre 15 et 25%% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de la cage. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Les actes douloureux, tel que la thoracotomie, seront réalisés sous anesthésie profonde (Isoflurane, Kétamine/Xylazine) avec analgésie 30min avant la chirurgie (Buprénorphine). Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation. Si les signes persistent, une décision de suivi ou d’euthanasie devra être prise. Le fait de ne pas sacrifier l’animal qui a atteint le point limite doit être argumenté et justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction d’inflammation pulmonaire et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
LLa souris mâle C57BL/6J sera privilégiée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la bléomycine car ce modèle est bien décrit et documenté dans la littérature avec cette souche et sexe en particulier. La souris femelle C57BL/6J sera utilisée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la radiation, car ces modèles sont bien décrits dans la littérature sur ces souches et les femelles sont plus sensibles à la radiation que les mâles. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et les radiations sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Rôle du cholestérol dans l’activité du striatum dorsal lors de la recherche de drogue dans un modèle animal d’addiction
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après pose d'un cathéter dans la veine jugulaire et deux chirurgies cérébrales, ils s'auto-administrent cocaïne ou nicotine sur vingt-cinq sessions, isolés en cage individuelle, pour étudier le rôle du cholestérol cérébral dans la rechute. Le porteur décrit un état de dépendance avec poil hérissé, irritabilité et agressivité, et reconnaît que l'isolement prolongé est source de stress. Les rats sont ensuite tués pour des analyses du cerveau, et le porteur renvoie d'éventuelles thérapies à moyen terme.
Objectifs
Les mécanismes moléculaires impliqués dans la recherche de drogues chez des individus addicts restent mal connus ce qui limite le développement de thérapies efficaces. Quelques études antérieures ont suggéré que le métabolisme du cholestérol jouerait un rôle dans la recherche de drogue et dans la rechute. Ce projet a pour but d’étudier le rôle de ce métabolisme dans l’activité cérébrale déclenchée dans le striatum dorsal, une structure impliquée dans l’addiction, lors de la recherche de drogues. Dans ce projet, nous chercherons à démontrer un lien entre la manipulation du cholestérol dans le striatum dorsal et l’activité neuronale dans cette région lors de la recherche de drogue après une période d'abstinence.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant le rôle du cholestérol cérébral dans la vulnérabilité à la rechute à l'addiction. Ces expériences pourraient conduire à moyen terme au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute.
Procédures
Les rats des groupes cocaïne et nicotine seront soumis à une chirurgie d’implantation de cathéter dans la veine jugulaire sous anesthésie générale de 15 minutes pour pouvoir s’auto-administrer les drogues. Tous les rats seront placés dans les cages d’auto-administration pour suivre des sessions d’entrainement d’auto-administration (25 sessions, 1 session par jour ; durée d’une session : pour cocaïne=6h, nicotine=1h, sucre=4h). Tous les rats subiront un total de deux chirurgies cérébrales (1h30 par chirurgie) : - la première pour placer un senseur de l'activité des neurones avec (groupes cocaïne et nicotine) ou sans (groupe sucre) implantation d’un cathéter intraveineux - la seconde pour injecter une enzyme dégradant le cholestérol et pour implanter à demeure un système d’imagerie qui permettra de mesurer l’activité des neurones pour tous les animaux. Tous les rats auront deux sessions d'’adaptations et de test (30 min et 1h, respectivement) aux dispositifs permettant de mesurer simultanément l'activité de recherche de récompenses et l'activité des neurones du striatum dorsal.
Impact sur les animaux
- Cathéter et Fibre optique : gène, risque d'infection ou de démangeaisons - Auto-administration : La prise de drogue chronique (bien que volontaire) peut causer un stress modéré chez certains rats, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques semaines. - Isolement : Les animaux sont hébergés individuellement pendant toute la durée de l’auto-administration et jusqu’à la fin de la procédure ce qui peut causer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires et histologiques sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans le phénomène de rechute. L’étude de ce processus nécessite d’enregistrer l’activité des neurones in vivo, chez l’animal lors du comportement, ce qui implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Des études statistiques préalables ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe sera de 18. Deux animaux par lot sont ajoutés en anticipation de possibles pertes liées à la complexité du geste des procédures chirurgicales (la veine peut céder lors de l’insertion du cathéter), à l’expression des virus et/ou à un mauvais placement de la fibre optique. Ainsi 20 animaux par lot, seront nécessaires à notre étude. 18 lots seront nécessaires pour le projet, soit 360 animaux maximum.
Raffinement
Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire et de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal, et pendant la chirurgie le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick de papier ou pièce de bois à ronger ou tunnel) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Avant le début des sessions d’entrainement à l’auto-administration, les animaux auront une période d’habituation aux cages et seront placés dans les cages d’auto-administration pendant 2 jours, 1 heure par jour. Les animaux seront également habitués à être connectés par leur système de fibre optique avant le test de rechute et d’enregistrement. En cas d’atteinte de points limites, des actions correctives sont prises sans délai. Les manipulations sont réalisées par des expérimentateurs formés et compétents à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus afin de modéliser au mieux la variabilité inter-individuelle humaine dans le développement d’une addiction. Pour notre étude, le rat est le modèle le plus approprié car il peut s’auto-administrer toutes les drogues, comme l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).
Criblage de vecteurs AAV chez la souris C57BL/6 : comparaison entre administration intracérébrale et une approche moins invasif, l’ administration intraveineuse.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
218 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent soit une injection dans le cerveau après craniotomie sous anesthésie de 70 minutes, soit une injection rétro-orbitaire, pour comparer ces deux voies d'administration de vecteurs de thérapie génique. Le porteur nomme des atteintes possibles comme un saignement lors de la craniotomie, un risque d'exophtalmie et d'infection oculaire après l'injection rétro-orbitaire, et une perte de poids. Les souris sont tuées quatre semaines après pour des analyses, cette étude servant à valider les vecteurs chez des souris saines avant emploi sur des modèles de maladie.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) et la maladie d’Alzheimer sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Cet ADN peut être délivré de différentes manières. L’injection intracérébrale est l’approche de référence pour de nombreuses maladies neurodégénératives. Nous souhaiterions tester l’efficacité d’une approche moins invasive qu’est l’injection intraveineuse. Ceci dans le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet permettrait d’opter pour un mode d’administration de notre produit le moins invasif possible pour l’appliquer chez l’homme et plus précisément chez les patients atteins de la maladie neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 semaine d’âge soit : -à une injection stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 70 min), -ou à une injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse (durée de 5 min), Dans les deux cas l’animal est endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux réaliseront des tests comportementaux (tests de performance motrice et activité locomotrice), les semaines 5, 6 et 7 et 1 jour de repos sera laissé entre ces deux tests. Un des tests de performance de la motricité est réalisé en 3 sessions pendant 3 jours consécutifs et dure 5 minutes maximum par session. Le test de l’activité locomotrice dure 10 minutes par animaux. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie avec animal endormi et immédiatement après les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux. Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal existe également. Un risque d’infection oculaire et d’hématome peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitales. Une perte de poids dû à l’injection de vecteur viraux pourrait être observée, (5 à 7%) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des vecteurs utilisées soient déjà été évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. Un risque d’hématome (exophtalmie), au niveau de l’IV peut survenir car l’injection est réalisée en rétro-orbitaire.
Devenir
Les souris seront euthanasiées 4 semaines après les injections (temps d'expression des vecteurs viraux étudiés) - pour les differentes études biocellulaires et biomoléculaires.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, le modèle murin de la maladie de Huntington est bien caractérisé. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (218) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring (fournie en annexe ) est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes de vecteur virauxs modifiés et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un vecteur viral exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Nous commencerons donc par valider dans la présente demande nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. En effet à ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH ou MA permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études de comparabilité et d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau.
Etude du rôle de TBK1 dans les cellules microgliales sur la dégénérescence et la régénérescence des motoneurones dans des modèles murins de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées au stade symptomatique de la maladie, à cinq mois, ou à son stade terminal, à six mois, 114 souris d'une lignée transgénique de SLA sont d'ici là pesées et soumises chaque semaine à un test de force musculaire. Au total, 174 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses de leurs organes. Les 60 autres, issues d'une seconde lignée, subissent sous anesthésie une lésion du nerf sciatique à quatre ou douze mois, puis une mesure quotidienne de l'écartement des doigts pour suivre la paralysie de la patte, avant leur mise à mort une semaine ou un mois plus tard. Le porteur dit avoir obtenu des résultats "prometteurs" sur des cultures de cellules immunitaires du cerveau, et affirme que pour étudier leurs interactions avec les motoneurones "un modèle in vivo est crucial".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Les formes génétiques de SLA sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Cependant, la plupart des mutations dans les gènes impliqués dans la SLA induisent plutôt un gain-de-fonction-toxique inconnu - difficile à étudier. Recemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA. Les mutations dans ce gène induisent une perte de la protéine, un phénomène plus facilement étudiable. Ce gène est impliquée dans la dégradation des protéines et la réponse immunitaire. Comme il a déjà été montré que les cellules immunitaires étaient impliquées dans la SLA, nous étudions plus spécifiquement le rôle de ce gène dans les cellules immunitaires du cerveau. Nous cherchons à savoir si des cellules immunitaires déficientes en ce gène produisent une réponse altérées à un stress des neurones, et si elles améliore ou au contraire altèrent les problèmes moteurs associés au stress.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intêret, un gène dont la mutation peut causer la SLA, dans les cellules immunitaires du cerveau. Si nous montrons que la perte de ce gène dans ces cellules est toxique, cela contribuerait à expliquer pourquoi des mutations dans ce gène peut causer la SLA. Si nous montrons au contraire que ces cellules immunitaires sans ce gène sont bénéfiques pour les neurones, cela pourrait en faire une cible thérapeutique pour ralentir le cours de la maladie chez tous les patients atteints de SLA.
Procédures
• 114 souris d'une première lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront uniquement un suivi par pesée et test de la mesure de la force musculaire (2 minutes par souris) une fois par semaine. • La totalité de ces 114 souris seront euthanasiés au stade symptomatique (à 5 mois) ou terminale (à 6 mois) pour prélèvement des organes. Deux méthodes d’euthanasie distinctes seront utilisées, nécessaire pour l’analyse des differents types d'échantillons. • 60 souris d'une deuxième lignée transgénique d’intérêt etudiée, subiront une chirurgie sous anesthésie pour léser le nerf sciatique, à 4 mois (jeune), ou à 12 mois (agées). Elles recevront une analgésie 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant la chirurgie et les sutures seront désinfectées (5 min par souris). Tous les jours, on évaluera la paralysie de la patte par mesure de l’écartement entre les doigts de la patte (2 min par souris). • La totalité de ces 60 souris seront euthanasiés 1 semaine ou 1 mois après lésion du nerf, pour prélèvement des organes d'intéret. • TOTAL - interventions sur 174 souris.
Impact sur les animaux
Modèle SLA: Le modèle souris transgénique de SLA est un modèle à phénotype dommageable. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêqret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter améliorer le phénotype. Lésion du nerf sciatique chez la souris: Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera pris en charge. Il y aura aussi une diminution (transitoirement) de leur mobilité, nous leur proposerons donc de la nourriture directement dans la cage sous forme de bouillie. Cependant, nous nous attendons à ce que la délétion de notre gene d'intêret dans les cellules immunitaires du cerveau n’aggrave pas ce phénotype, au contraire, elle devrait plutôt augmenter la vitesse de la régénérescence.
Devenir
Tous les animaux dans les deux procédures sont utilisées à la fin de la procedures pour des analyses (histologique ou durée de la maladie) - et donc euthanasiées.
Remplacement
Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocol, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion de notre gène d'intêret, pour tester si elles répondent différemment que les cellules microgliales contrôles - à un stimulus inflammatoire. Nos résultats étant prometteurs, nous avons donc décidé de passer à des expériences plus complexes, in vivo. Comme notre question concerne les intéractions entre les motoneurones et les cellules immunitaires, un modèle in vivo est crucial. Des intérations aussi complexes seraient difficiles à modéliser en culture.
Réduction
Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour l'étude de l'effet sur les souris SLA, le modele de la maladie humaine avec phenotype dommageable, nous avons besoin de 20 souris par génotype. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique dans les souris SLA - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la SLA. Pour l'analyse des organes à deux differentes stades de la maladie, on a besoin 6 souris par génotype (nombre minimal de souris nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). Le nombre d'animaux utilisés pour cette premiere partie est de 114. Pour l'étude de la lésion du nerf sciatique, nous utilisons une lignée transgénique avec modification de notre gène d'interet, mais sans phenotype dommageable. Nous aurons besoin de 5 souris/génotype pour s’assurer une analyse finale robuste (nombre minimal nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable de ce type de résultats). L'analyse doit être fait à 2 stades différentes: pendant la régénérescence, et après régénérescence complète, pour déterminer les effets sur la vitesse et l'éfficacité. Et à 2 âges differentes, jeune et agé, pour déterminer l'effet du vieillissement sur la capacite regenerative du nerf. Le nombre d'animaux utilisés pour cette deuxième partie est de 60. Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 174.
Raffinement
Pour la stimulation environnementale (enrichissement), nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage) et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Pour les souris SLA, les souris montrant des signes de paralysie sont surveillées quotidiennement par un expérimentateur. Un mélange de poudre de nourriture et d'eau est proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une deshydratation et une dénutrition. Un soin particulier est apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Proche du stade terminal, les souris sont surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours. Pour la lésion du nerf sciatique, nous allons léser un seul nerf sciatique pour éviter que la souris ne soit trop paralysée durant la première semaine après la chirurgie. Les souris subissant une lésion du nerf sciatique peuvent éprouver de la douleur dans les premiers jours mais qui sera bien pris en charge, pré- et post- opératoire par des analgésiques. Durant la première semaine après la chirurgie, nous ajoutons de la nourriture en poudre avec de l’eau directement dans la cage, car le membre opéré est partiellement paralysé. Comme nous n’utiliserons que des mâles, après la chirurgie ces mâles sont hébergés en isolement ou par maximum trois, jusqu’à la fin de la procédure, pour éviter que des bagarres ne dommagent les sutures. Pour les deux procédures, des points limites sont définis : les souris doivent impérativement être euthanasiées si elles les atteignent.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère (pour l'étude, souris SLA), mais aussi dans un système nerveux périphérique à la jonction entre motoneurone et muscule de membres éloignés (pour l'etude, lésion du nerf sciatique). Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Nous avons une grande expérience avec les souris, et les deux modèles (SLA et lésion du nerf sciatique) sont mieux établis chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Dans un premier temps: l'étude de l'effet sur le phénotype des souris SLA et étude histologique du stade terminale. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers 6 mois. Pour l'étude histologique du stade symptomatique avant le stade terminal, les souris sont utilisées at 5 mois (quand la perte de pois atteigne 10%). Dans un deuxieme temps: l'étude du nerf sciatique dans les souris avec modification du gène d'intêret : la chirurgie est faite au stade adulte/jeune à 4 mois, et au stade adulte/agée à 12 mois - suivi de 1 mois (pour étudier la régénérescence complète/efficacité) ou 1 semaine (pour étudier la vitesse de la régénérescence).
Fonction cardiaque (hypertension)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
1 800 rats vont être utilisés dans des procédures menées en partie sous anesthésie sans réveil, en partie avec un niveau de souffrance modéré, 100 étant réutilisés et les autres tués. Ils servent à tester des candidats médicaments contre l'hypertension pour le développement préclinique de produits pharmaceutiques, certains subissant une néphrectomie, la pose d'un clip sur une artère rénale ou une ligature du canal biliaire sous anesthésie. Le porteur indique que le modèle de ligature biliaire provoque une jaunisse puis une ascite, et que le modèle d'hypertension pulmonaire entraîne une dégradation de l'état général et une perte de poids rapide, les rats étant tués avant les stades les plus avancés. Il affirme que les tests in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent "entièrement suppléer" les modèles animaux.
Objectifs
L’hypertension artérielle (HTA) est l’un des principaux facteurs de risque cardiovasculaire, c’est-à-dire qu’elle augmente fortement les risques de développer des complications cardiovasculaires (AVC, infarctus du myocarde, insuffisance rénale, artériopathie des membres inférieurs…). Dans 90% des cas, l’origine de l’hypertension est inconnue, elle n’a pas une seule cause directe mais est souvent multifactorielle. Si l’HTA systémique est la plus connue, une hypertension peut également apparaitre plus spécifiquement au niveau pulmonaire ou portal. L’HTA pulmonaire constitue une complication courante des maladies cardiopulmonaires. Les patients atteints d’HTA pulmonaire développent une hypertrophie ventriculaire droite et à long terme une insuffisance cardiaque. L’hypertension portale (HTP) résultant d’une augmentation des résistances intra-hépatiques est une complication courante des maladies chroniques du foie et constitue une des causes entrainant la mort de patients atteints de pathologie du foie. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments par la réduction de différentes formes d'hypertension et de leurs conséquences.
Bénéfices attendus
Les modèles décrits dans ce projet sont nécessaires à la découverte et à la mise sur le marché de nouveaux médicaments efficaces pour traiter l’hypertension systémique, pulmonaire ou portale, et leurs conséquences. Avant les tests sur l’animal, les produits sont généralement testés et présélectionnés avec attention dans des tests in silico, in vitro ou ex vivo.
Procédures
Dans les modèles anesthésiés, les animaux sont anesthésiés jusqu'à la fin de la procédure (sans réveil). Des cathéters et/ou électrodes (électrocardiogramme) sont positionnés dans des artères/veines et/ou en sous cutané respectivement, pour la mesure en continue de paramètre cardiovasculaire (pressions, fréquence cardiaque, ECG). Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang peuvent être réalisés (sous anesthésie) pendant le test et/ou en fin de test (immédiatement avant l'euthanasie). La procédure (sous anesthésie) n'excède généralement pas 2 heures et les animaux sont immédiatement euthanasiés (sans réveil préalable). Dans les modèles éveillés, les animaux sont dans une première phase opérés sous anesthésie (néphrectomie, pose de clip vasculaire autour d’une artère rénale, ligature du canal biliaire) et/ou équipés d'un implant de télémétrie qui permet l'enregistrement en continu de paramètres cardiovasculaires (pressions, fréquence cardiaque, électrocardiogramme ou ECG) par cathétérisme des lits artériels d’intérêt (ou d’une cavité cardiaque) et positionnement d’électrodes pour l’ECG. Après réveil et une période de récupération (généralement une semaine au minimum), les paramètres sont enregistrés en continu, généralement avant (au moins 1 heure) et après administration de la substance à évaluer (classiquement 24 heures par période d’enregistrement). Les administrations par bolus rapide (par voie orale, intraveineuse, souscutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) ou par perfusion lente (intraveineuse) sont effectuées selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure d’administration par bolus est de quelques secondes. Celle d’une administration par perfusion intraveineuse peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent) ou plusieurs semaines, en fonction des spécificités du candidat traitement. La fréquence des administrations (exemple : journalière, hebdomadaire) est variable et également adaptée à la spécificité de la substance testée. Pour les besoins de l'étude, des prélèvements de sang (classiquement 2 maximum par 24 heures, volume et fréquence adaptés à l'espèce) peuvent être réalisés (animal vigile ou anesthésié) pendant le test et/ou en fin de test, selon les bonnes pratiques vétérinaires. La durée de la procédure de prélèvement est de quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs des substances testées ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Dans les modèles nécessitant une intervention chirurgicale (sous anesthésie) suivie d’un réveil, les animaux sont hébergés en cage individuelle (avec enrichissement) pendant la période de récupération post-chirurgicale (généralement pour une période d'une semaine) afin d'éviter que les animaux ne retirent les agrafes/sutures de leurs congénères. Lors de la phase de récupération, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit…). Pendant les mesures par télémétrie, l’hébergement en cage individuelle est également nécessaire (généralement environ 24h) pour éviter les interférences entre les implants ainsi que les contaminations croisées (les animaux ne recevant généralement pas tous le même traitement le même jour. De même, pendant les phases de mesure de la pression artérielle par la méthode du tail cuff, les animaux doivent être placés dans des boites de contention (généralement pour des périodes de 45 minutes maximum et une fois par semaine, avec un nombre de semaines variant d’une étude à l’autre). Si des périodes de récolte de l'urine (24 heures maximum) sont inclues dans l’étude, l'isolement des animaux est nécessaire et peut aller jusqu'à 24 heures (pour la détermination de la filtration glomérulaire, les urines doivent impérativement être collectées individuellement pendant 24 heures). Pendant les phases d'hébergement individuel, les animaux gardent cependant un contact visuel, olfactif et auditif avec leurs congénères. Plus spécifiquement, dans le modèle BDL/cholestase (ligature du canal biliaire), une jaunisse apparait progressivement. Elle peut être accompagnée d'ascite (à un stade plus tardif, environ 4 semaines) et une diminution de l'appétit. Le stade d'encéphalopathie hépatique (et de coma), observé chez l'homme à un stade terminal, n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade). Egalement, dans le modèle d’hypertension pulmonaire MCT, l’état général des animaux peut se dégrader, généralement à partir de la 5ième semaine (le premier signe étant une perte de poids rapide). Cependant ce stade n'est pas atteint dans ce modèle (les animaux étant euthanasiés avant ce stade).
Devenir
Dans les procédures sans réveil, les animaux ne sont pas réutilisables. Dans les procédures modérées ne nécessitant pas de prélèvements d'organes, les animaux peuvent être gardés en vie et réutilisés, sauf si, pour les besoins de l’étude, un volume de sang non-compatible avec la survie est nécessaire. Dans les procédures modérées pour lesquelles des prélèvements d’organes sont prévus, le maintien en vie n'est pas possible. De plus le niveau de l’hypertension atteint en fin de test n’est à terme pas compatible avec le maintien en vie.
Remplacement
En amont des tests in vivo sur des modèles d'hypertension, des tests in silico, in vitro ou ex vivo peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires , ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer ces pathologie évolutives et leurs conséquences dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test a été optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition du test. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègre dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (et positif si approprié). Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant stopper précocement la douleur, la souffrance ou l'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs, et sont suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les différentes formes d'hypertension chez le rat dans les modèles décrits, est prédictif de leur efficacité en clinique. Principalement rats sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques.
Étude de l’effet de candidats médicaments sur un modèle de dyskinésies tardives (TDs) induites par l’injection d’halopéridol chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
760 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection quotidienne d'halopéridol dans l'abdomen pendant 21 jours pour provoquer des dyskinésies, mouvements involontaires de la mâchoire et de la langue, puis un candidat médicament d'un "sponsor" à évaluer. Le porteur reconnaît que les injections répétées peuvent provoquer une péritonite ou toucher d'autres organes, et que le trouble moteur induit est source de stress. À l'issue, un prélèvement intracardiaque sous anesthésie précède la mise à mort et le prélèvement du cerveau.
Objectifs
L’utilisation de substances antipsychotiques est une stratégie thérapeutique importante pour traiter les troubles liés aux pathologies psychiatriques telles que les psychoses. Cependant, l’efficacité de ces traitements est limitée à certains symptômes et leur utilisation prolongée est associée à de nombreux effets secondaires. En effet, les antipsychotiques agissent en bloquant les voies dopaminergiques induisant sur le long terme, l’augmentation du nombre et de la sensibilité des récepteurs D2 à la dopamine. En conséquence, il est observé, chez plus de 30% des patients, l’apparition de troubles moteurs involontaires et aberrants appelés dyskinésies tardives (TDs). Afin de lutter contre ces effets secondaires, plusieurs modèles précliniques chez le rongeur ont été développés dans le but de comprendre la physiopathologie liée à l’apparition de ces troubles moteurs pour ensuite tester différentes stratégies thérapeutiques visant à les diminuer. Actuellement, les traitements de référence pour soulager les TDs sont basés sur des molécules diminuant la recapture et la libération de dopamine au niveau synaptique telles que les tétrabénazines. Malgré cela, ces substances présentent des inconvénients importants car elles ont une demi vie très courte (10h) et nécessitent donc des doses quotidiennes multiples. De plus, elles n’ont pas un effet spécifique ce qui contribue à induire des effets secondaires obligeant à diminuer le dosage pouvant être administré et donc leur efficacité. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de candidats médicaments à plusieurs dosages sur le développement des TDs chez le rat, induites par l’administration quotidienne et prolongée d’halopéridol, un antipsychotique. Pour cela, des rats Wistar subiront une injection quotidienne d’halopéridol par voie intrapéritonéale (i.p) sur une durée de 21 jours. Lors du 21ème jour, ces animaux seront traités à partir d’une administration i.p unique soit du véhicule, soit de tétrabénazines, le composé référence, soit de candidats médicaments à plusieurs dosages. Les effets de ces traitements seront évalués sur les mouvements involontaires de la région orofaciale (i.e. évaluation du nombre d’ouverture de la mâchoire non dirigée vers une cible) et/ou de protrusion de la langue, tous deux très caractéristiques de TDs chez le rat, tout comme chez l’Homme. Pour terminer, le plasma et le cerveau des animaux seront prélevés afin de quantifier la biodisponibilité des candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de candidats médicaments sur 1) les troubles moteurs involontaires de la région orofaciale associés aux dyskinésies tardives induites par la prise prolongée d’antipsychotiques, 2) sur la biodisponibilité plasmatique et cérébrale de ces mêmes composés et 3) sur leurs potentielles répercussions thérapeutiques au niveau histologique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des rats mâles (âge : 6 semaines) sont soumis à une administration quotidienne d’halopéridol, un antipsychotique, sur une durée de 21 jours afin d’induire une dyskinésie tardive (mouvement moteur involontaire et aberrant (durée de l’acte d’injection i.p : 1min/rat). Au cours de la seconde intervention, à J21, les 6 groupes d’animaux sont également traités par voie i.p avec soit le candidat médicament administré à 3 différentes doses (une dose par groupe sur 3 groupes), soit avec de l’halopéridol, soit avec un composé de référence, les tétrabénazines soit avec le véhicule (NaCl 0,9%). La 3ème intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des rats, mesurant les mouvements involontaires de la région orofaciale et les protrusions de langue (durée d’intervention : 10min x 3). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse avant la mise à mort des animaux afin de prélever le cerveau (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 20 min).
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’administration quotidienne par voie intrapéritonéale est une source de stress puisqu’il est nécessaire d’appliquer une contention chez le rat afin de pouvoir réaliser ce geste. De plus, il est possible que les piqures répétées au niveau du péritoine engendrent une inflammation du péritoine (péritonite) voir une injection au niveau d’autres organes (vessies, intestins.). L’injection i.p peut également engendrer un léger écoulement de sang dans le cas où l’aiguille perfore un vaisseau sanguin. L’induction de TDs représente également une nuisance car elles entrainent une altération de l’activité motrice de la région orofaciale (mouvement aberrants et involontaires) et sont sources de stress. De plus, au cours d’une session permettant d’évaluer les caractéristiques comportementales de la TD, les animaux sont isolés dans un open field durant 3 fois 10 min ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort à la fin du protocole afin de prélever les organes.
Remplacement
Les dyskinésies tardives sont les principales sources de troubles moteurs résultant de la prise quotidienne d’antipsychotiques. Ainsi, pour ce projet, les candidats médicaments ont comme principal objectif de diminuer ces mouvements moteurs involontaires et aberrants. Ainsi, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux antipsychotiques. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu par groupe (maximun n=10) pour ce projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8) utilisant le même modèle de rat de TDs induites par l’administration quotidienne d’halopéridol sur 21 jours. Cependant, une certaine hétérogénéité entre les animaux a été observée quant à la réussite de l’induction de la TDs. Pour cette raison et le faible recul de ce modèle au sein de l’entreprise nous pousse donc à choisir un N = 10 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux par groupe pourrait être réduit une fois ce modèle maitrisé et validé au sein de l’entreprise.
Raffinement
Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques basées sur des critères d’observations. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures ainsi qu'aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Par ailleurs, les animaux sont hébergés par 3 dans les cages. Pour l’induction de la dyskinésie tardive par administration quotidienne d’halopéridol en i.p: - les administrations sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement - les animaux sont pesés chaque début de semaine afin d’adapter le volume et le dosage administré et permettant d’éviter le surdosage - les administrations se font avec une seringue de 1ml et une aiguille de 26G - pour les administrations i.p, l'animal est maintenu en contention et l’aiguille est insérée dans le cadrant ventral inférieur gauche ou droit en évitant la ligne médiane. Les sites d’administration sont alternés chaque jour entre gauche et droite. Une légère aspiration est effectuée avant d’injecter pour confirmer que l’aiguille n’a pas perforé un vaisseau sanguin ou un autre organe. En cas de signe de déhydratation (test du plis de peau) ou de perte de poids, une injection de sérum physiologique est effectuée en s.c. Le prélèvement de sang en intracardiaque ainsi que la thoracotomie précédent la perfusion de l’animal sont réalisées sous anesthésie générale avec un cocktail de Kétamine/médétomidine et sous analgésique systémique.
Choix des espèces
Le rat et particulièrement la souche Wistar, est l’espèce de référence dans l’étude des dyskinésies tardives induites par l’halopéridol. En effet, plus de 68% des études répertoriées dans la littérature utilisent des rats dont plus de 33% sont de la souche Wistar. Afin de pouvoir maximiser la standardisation et donc favoriser la comparaison des données avec la littérature, il est fortement conseillé d’utiliser des rats Wistar sur ce sujet. De plus, les symptômes principaux des TDs au niveau de la région orofaciale observés chez l’Homme, sont également retrouvés chez le rat et à la même fréquence. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes rats Wistar mâles adultes (6 semaines, poids 200-280g) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les dyskinésies tardives induites par l’halopéridol sont obtenus chez cette catégorie d’animaux.
Comparaison de deux méthodes de préservation des greffons cardiaques après explantation chez un modèle porcin, avec ou sans pré-traitement à la colchicine.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque porc a le thorax ouvert et reçoit une solution froide riche en potassium qui ralentit puis arrête son cœur, prélevé aussitôt pour être conservé soit sous machine de perfusion oxygénée à 34 °C, soit au froid statique à 4 °C, avec ou sans prétraitement à la colchicine. L'arrêt cardiaque provoqué tue le porc et ouvre l'expérience, dont les retombées pour les patients greffés dépendent de deux démonstrations au conditionnel, une meilleure conservation à 34 °C sur au moins six heures et un effet protecteur de la colchicine. Les porcs sont pris à trois mois, entre 35 et 40 kg, pour des raisons techniques "et pour des raisons de coût d'autre part", précise le porteur.
Objectifs
La transplantation cardiaque reste la méthode de référence du traitement de l’insuffisance cardiaque avancée mais souffre de pénurie de greffons. Les méthodes de conservation des greffons au moment de l’explantation sont primordiales pour éviter le développement de lésions inflammatoires au niveau de la microcirculation. En effet, ces lésions sont en partie responsables de la défaillance primaire du greffon cardiaque transplanté, responsable d’une mortalité non négligeable en clinique humaine. Dans le cadre de notre projet sur un modèle de gros animal, nous avons deux objectifs : 1) comparer deux méthodes et montrer que la conservation du greffon cardiaque sous machine de perfusion oxygénée à 34°C induit moins de phénomènes inflammatoires que le coeur explanté et conservé comme classiquement au froid statique à 4°C ; 2) confirmer que la colchicine, qui possède un effet cardioprotecteur après un évènement coronarien aigu, atténue ces lésions dans les deux modèles de conservation du greffon.
Bénéfices attendus
Pour soigner l'insuffisance cadiaque, les patients nécessitent de greffons préservés le plus longtemps et dans les meilleurs conditions possibles pour éviter des complications pouvant aller jusqu'à la mort. Grâce à ce projet, si nous démontrons d'une part que la préservation du greffon par machine de perfusion ex vivo à 34°C donne de meilleurs résultats que la conservation froide statique sur les paramètres inflammatoires, et d'autre part que la qualité de préservation se maintient au moins 6 heures, dépassant largement les temps limités d'ischémie froide, alors cette technique pourra être utilisée en médecine humaine. De plus, si nous montrons que la colchicine a un effet protecteur sur les lésions avec les deux méthodes de conservation, alors elle sera un outil supplémentaire pour améliorer la qualité des transplantations.
Procédures
L'animal sera anesthésié profondément avant la réalisation d'une sternotomie (ouverture du thorax) pour permettre l'accès au coeur et l'injection d'une solution de cardioplégie destinée à ralentir puis arrêter les battements cardiaques. Dès que le coeur sera arrêté, il sera prélevé et conditionné selon les techniques choisies.
Impact sur les animaux
Le protocole prévoit la mise à mort de l'animal par ralentissement puis arrêt cardiaque par l'injection d'une solution froide et riche en potassium (solution de cardioplégie) nécessitant l'ouverture du thorax. En dehors des contraintes liées à la préparation de l'animal (stress au moment de la prémédication), aucune nuisance supplémentaire n'est prévue puisqu'il s'agit d'une procédure sans réveil, au cours de laquelle la gestion de la douleur et de l'anesthésie seront rigoureusement surveillées.
Devenir
Aucun animal ne sera réveillé, le protocole nécessitant le prélèvement du coeur.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèles alternatifs au modèle animal pour étudier le métabolisme myocardique en condition physiologique. Ce métabolisme ne peut actuellement pas être étudié par simulation numérique, ni à partir d'un modèle mathématique. De même, la perfusion d'organes ex vivo reposent sur l'utilisation d'un organe et non d'un tissu ou d'une culture cellulaire (pas d'alternative in silico ou in vitro) ; il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un coeur prélevé sur un système vivant et battant. Par ailleurs, seul un modèle sur le gros animal permet d'extrapoler facilement les résultats à l'homme dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan physiologique et métabolique.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est fixé à 6 afin de pouvoir réaliser les tests de comparaisons statistiques entre les groupes. Nous utiliserons des modèles d'analyse de la variance pour nos analyses statistiques. Au total 24 animaux seront utilisés pour cette étude afin de mettre en évidence une diminution significative entre les groupes. L'analyse statistique sera réalisée avec un logiciel spécialisé.
Raffinement
Une seul procédure expérimentale sans réveil est prévue dans ce protocole. Au delà des conditions règlementaires et habituelles d'hébergement et de respect du bien-être des animaux, la maîtrise des conditions de préparation et d'anesthésie des animaux évitera toute nuisance supplémentaire. La douleur au cours de la procédure sera contrôlée et prévenue par un morphinique avant l'ouverture du thorax. Par la suite, l'injection d'une solution visant à arrêter le coeur (cardioplégie) entraînera la mise à mort sans souffrance de l'animal.
Choix des espèces
Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l'Homme (fréquence et débit cardiaque identiques). La modélisation chirurgicale est facilitée par l'usage du gros animal. Cette convergence permet une adaptation optimale de l'espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d'animaux testés (moins d'échec technique). Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 35-40 kg) et pour des raisons de coût d'autre part. En effet, à ce stade de développement les diamètres de vaisseaux correspondent à ceux de l’humain et permettent donc de réaliser l'étude dans de bonnes conditions, et de prélèver des quantités suffisantes d'échantillons ex-vivo.