Recherche appliquée

Arrivés à un jour d'âge, 1 728 poulets de chair sont pesés huit fois au cours de leur élevage, et 1 512 d'entre eux sont infestés à 15 jours par des coccidies, des parasites de l'intestin, puis suivis jusqu'à 84 jours, l'âge d'abattage de leur souche. Ces oiseaux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester cinq solutions à base d'extraits de plantes destinées à remplacer les anticoccidiens et les vaccins de la filière avicole. Le porteur annonce des "signes subcliniques transitoires" pendant 24 à 48 heures, après avoir décrit la coccidiose par la diarrhée, l'apathie, le retard de croissance et des volailles qui se tiennent en boule. Les 1 512 poulets infestés, dont il écrit qu'ils "ne sont pas commercialisables", seront tués par électronarcose suivie d'une saignée, et les 216 témoins jamais infestés pourront être "replacés dans la chaîne commerciale".

Objectifs

La société actuelle est demandeuse d'une médication vétérinaire réduite (arrêt des antibiotiques, coccidiostatiques…), naturelle et respectueuse de l'environnement. De ce fait, la réduction de l’usage des traitements médicamenteux est aujourd’hui un enjeu majeur pour l’agriculture française. Parmi ces produits, les additifs coccidiostatiques (ou anticoccidiens) sont très utilisés en France et en Europe car ils sont le principal moyen de lutte contre la coccidiose. La coccidiose est une maladie parasitaire qui touche les volailles. Les symptômes peuvent être variés, mais la coccidiose se traduit souvent par une frilosité des volailles, une baisse de leur appétit, un retard de croissance, une apathie ou encore des diarrhées. Les animaux peuvent parfois se tenir en boule, avec leurs plumes ébouriffées, tous ces symptômes étant la résultante de dommages intestinaux qui induisent des pertes économiques significatives pour l’éleveur. Les vaccins actuellement disponibles, offrent une alternative aux coccidiostatiques mais présentent également des limites pour les éleveurs en termes de performances zootechniques et peuvent avoir un impact défavorable sur les résultats économiques. Ainsi, au regard des préoccupations sanitaires grandissantes et d’une probable évolution réglementaire les interdisant, il est important de trouver aujourd’hui une alternative aux anticoccidiens. Dans le cadre de ce projet, notre objectif sera de tester des solutions alternatives et naturelles aux coccidiostatiques.

Bénéfices attendus

La coccidiose est une des maladies les plus fréquentes chez les volailles. Les éleveurs peuvent utiliser des substances à titre préventif, appelées coccidiostatiques (ou anticoccidiens). Elles sont considérées comme des additifs par la législation et sont généralement administrés via l’aliment. Cependant, cette utilisation présente quelques limites puisque des phénomènes de résistances aux anticoccidiens ont été développés et leur utilisation continue et routinière a entraîné l’émergence de populations résistantes, qui nécessitent des rotations régulières quant au type d’anticoccidien utilisé. Par ailleurs, des résidus anticoccidiens sont parfois retrouvés dans les produits avicoles. Les limites des coccidiostatiques ont entraîné le développement des vaccins. Ils représentent cependant un coût non négligeable pour l’éleveur et ont tendance à entrainer des baisses de performances zootechniques, voire le développement de pathologies opportunistes. L’alerte sur les risques d’utilisation des substances médicamenteuses sur la santé et les limites de la vaccination motive aujourd’hui l’émergence de nouvelles offres de produits. Ainsi, la mise en place et le développement de solutions alternatives et naturelles à visée anticoccidienne apparaissent comme une nécessité pour la filière avicole française. Dans ce contexte, le plus gros bénéfice de notre projet est le développement de nouvelles solutions naturelles à visée anticoccidienne, en remplacement des anticoccidiens et des vaccins. Cette étude aura de ce fait également des bénéfices pour le consommateur et la santé humaine : naturalité, qualité sanitaire (absence de résidus dans les produits avicole), qualités nutritionnelles…

Procédures

1512 animaux sont soumis à une infestation coccidienne expérimentale unique. L’inoculation se fera à 15 jours d’âge car il s’agit de la réalité sur le terrain où les coccidioses cliniques apparaissent entre 12 et 15 jours d’âge. Et les animaux seront suivis jusqu’à 84 jours d’âge, âge d’abattage classique pour cette souche de poulets. Tous les poulets seront pesés individuellement à 8 reprises afin de connaitre et comparer leur performance de croissance. La durée moyenne d’une pesée d’un parquet de 36 animaux est estimée à 10min maximum.

Impact sur les animaux

Les effets négatifs sur les animaux sont principalement liés à l’infestation coccidienne expérimentale. Elle est néanmoins nécessaire pour évaluer l’effet anticoccidien des solutions que nous testons. La principale nuisance pour les animaux sera la présence de signes subcliniques transitoires, sur 24h (48h maximum), au moment du pic d’excrétion des coccidies, soit environ 4 à 7 jours d’après l’infestation. La pesée individuelle des animaux peut également représenter un stress pour ces derniers, mais reste nécessaire pour le suivi de la croissance des animaux.

Devenir

Les animaux ayant subi l’infestation coccidienne ne sont pas commercialisables ; ils seront euthanasiés par électronarcose suivie d'une saignée. Les animaux n’ayant pas subi l’infestation (lot témoin = 216 animaux), pourront, après vérification qu’ils ne soient pas contaminés par les coccidies, être replacés dans la chaîne commerciale.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet qui vise à évaluer l’efficacité de solutions alternatives aux anticoccidiens, le remplacement n'est pas possible car il n'existe, à ce jour, aucune technique in vitro pour étudier les réponses physiologiques des individus face aux stimuli auxquels ils sont exposés. Cependant, en amont de ce projet, des tests ont été effectués en remplacement de l’utilisation des animaux : d’une part en laboratoire pour contrôler et quantifier l’efficacité des molécules vis-à-vis des parasites et l’absence de toxicité vis-à-vis des cellules de l’hôte (in vitro) et d’autre par simulation informatique (in silico)

Réduction

De nombreux tests en amont ont été effectués in vitro et in silico afin de réduire le nombre d’animaux total nécessaires au projet. Cependant, pour tester l’efficacité des 5 solutions alternatives aux anticoccidiens, nous avons besoin d’utiliser les animaux. Une analyse de variance sera faite sur les résultats individuels, avec comparaison de moyennes. L’effectif de 1728 animaux a été réduit à son maximum. Il reste cependant nécessaire pour évaluer statistiquement 8 modalités expérimentales et en tirer des conclusions significatives.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des parquets, au sol sur des copeaux et en groupe afin de créer des relations sociales. Des ficelles seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Ils seront hébergés dans des parquets de 2.68m² selon les normes règlementaires définies par l’arrêté du 28 juin 2010 établissant les normes minimales relatives à la protection des poulets destinés à la production de viande et dans des conditions optimales d’alimentation et de soins. Des points limites sont déterminés et une grille d’évaluation du bien-être des poulets sera complétée quotidiennement par le personnel animalier pour permettre de détecter précocement toute altération de leur état de santé ou de leur comportement.

Choix des espèces

S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet (gallus gallus) a été fait car il s’agit l'espèce majeure sur le terrain et un modèle reconnu par la filière. Les poussins arriveront à 1 jours d’âge, mais l’infestation coccidienne n’aura lieu qu’à 15 jours, âge à partir duquel les infestations aux coccidies apparaissent en élevage. Nous étudierons ensuite les animaux infestés sur toute la durée d’élevage, c’est-à-dire jusqu’à 84 jours qui correspond à l’âge classique d’abattage pour cette souche à croissance lente. Cela nous permettra par la suite de transposer nos résultats à un élevage commercial classique.

24 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dix-huit tués à l'issue et six réutilisés pour d'autres projets. Chaque animal inclus subit une chirurgie d'ablation de la prostate au laser sous IRM d'une durée maximale de quatre heures, porte une sonde urinaire et reste isolé trois jours avant d'être tué pour prélever la prostate. Le porteur indique que le dispositif vise le cancer et l'hyperplasie de la prostate chez l'homme, et que cinq points de données sont exigés par la FDA. Il affirme qu'un organisme complet et vivant est "indispensable" pour valider le dispositif.

Objectifs

Le dispositif médical en développement est utilisé pour nécroser ou coaguler, de manière locale précise, les tissus mous par thérapie thermique interstitielle sous guidage par imagerie à résonance magnétique (IRM). Ce système de thérapie se compose d'une unité laser mobile et d'applicateurs laser. La lumière laser générée est appliquée localement au moyen d'applicateurs laser à usage unique. Le logiciel de thermométrie par résonnance magnétique est la troisième partie du dispositif médical et est conçu pour aider l'utilisateur à déterminer et à visualiser les changements relatifs de la température des tissus pendant la thérapie. Lorsqu'il est utilisé pour surveiller l'ablation thermique, le logiciel peut également calculer les dommages thermiques induits par les dispositifs d'ablation. Ce projet vise donc à évaluer l'utilisation de l’ensemble du dispositif à différents niveaux : 1) Démontrer la sécurité d'utilisation du système lors d’ablations de tissus mous prostatiques et fournir des données sur la précision et la prévisibilité de l'estimation de la dose thermique du système. 2) Démontrer que le logiciel permet de prédire avec précision l'étendue des lésions trois jours après le traitement, par rapport aux résultats histopathologiques. 3) Mesurer le taux de mise à jour et le décalage par rapport au temps réel avec des séquences de thermométrie par résonnance magnétique.

Bénéfices attendus

Ce dispositif permettra d’aider le clinicien utilisateur à déterminer et à visualiser les changements relatifs de température des tissus pendant le traitement. Lorsqu'il est utilisé pour surveiller l'ablation thermique, le logiciel peut également calculer les dommages thermiques induits par le dispositif d'ablation. L'évaluation précise des dommages thermiques immédiatement après le traitement n'est pas triviale en raison d'une variété de réponses cellulaires, vasculaires et inflammatoires qui se produisent au sein du tissu. Des lésions tissulaires au cours d'une intervention thermique peuvent provoquer une apoptose ultérieurement, d'où la nécessité de les évaluer avec précision afin de prédire et anticiper les dommages ultérieurs et adapter les soins post-opératoires nécessaires. L’utilisation de ce dispositif est particulièrement indiquée pour le traitement du cancer de la prostate ou l’hyperplasie benigne de la prostate. Ce dispositif médical pourra être appliqué à l’Homme, après avoir démontré sa sécurité chez l’animal, ainsi que sa capacité à prédire avec précision les dommages auxquels nous pouvons nous attendre.

Procédures

Sur animal vigile, des prélèvements sanguins pour analyses hémato-biochimiques pourront être réalisés avant l’intervention, puis pendant le suivi post-opératoire et en fin d’étude. Les volumes sanguins prélevés seront faibles (moins de 20mL) et représenteront moins de 3% du volume sanguin total de l’animal. Cependant, nous prendrons en compte le temps de repos nécessaire entre deux prélèvements, selon les recommandations en vigueur chez cette espèce. La procédure chirurgicale (unique) sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 4h. Ce test sera réalisé sous IRM.

Impact sur les animaux

Après réception des animaux, un prélèvement sanguin (environ 4mL) sera réalisé sur animal vigile via la veine jugulaire, dans le but de réaliser un bilan hémato-biochimique d’inclusion et donc s’assurer qu’il n’existe pas d’anomalie au niveau de ces paramètres sanguins. L’intervention sera réalisée sous anesthésie générale et ce temps d’anesthésie sera d’environ 4h (prise en compte de toute la partie préparation de l’animal, installation dans l’IRM et intervention avec le dispositif). Cette durée aura donc un impact sur le réveil des animaux. Nous pouvons nous attendre à une douleur après intervention (douleur qui sera prise en charge) et une inflammation des tissus environnants la prostate, provoquant une difficulté à uriner pour les chiens. Ainsi, en fin d’intervention, une sonde urinaire avec valve anti-reflux sera installée chez les chiens qu’ils garderont jusqu’à leur euthanasie 3 jours plus tard. Cela impliquera donc un hébergement en individuel après l’intervention pendant 3 jours. Des prélèvements sanguins pour analyses hémato-biochimiques pourront être réalisés avant l’intervention, puis pendant le suivi post-opératoire et en fin d’étude avant mise à mort des animaux. Les volumes sanguins prélevés seront faibles (moins de 20mL) et représenteront moins de 3% du volume sanguin total de l’animal. Cependant, nous prendrons en compte le temps de repos nécessaire entre deux prélèvements, selon les recommandations en vigueur chez cette espèce.

Devenir

Les animaux inclus dans les procédures expérimentales seront mis à mort, car des prélèvements d'organes, notamment de la prostate, devront être effectués pour analyses histopathologiques. En revanche, les animaux de réserve non inclus dans les procédures principales, seront gardés en vie et réutilisés pour d'autres projets. Le vétérinaire validera systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation.

Remplacement

Des premiers tests in vitro ont été réalisés en amont, afin de tester le dispositif avec le laser. En revanche, l’évaluation précise des dommages thermiques immédiatement après le traitement n'est pas triviale en raison d'une variété de réponses cellulaires, vasculaires et inflammatoires qui se produisent au sein du tissu, limitant ainsi notre capacité à le simuler in vitro. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ces conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post-opératoire.

Réduction

Une étude pilote sur 3 animaux sera réalisée en amont des études principales afin que la courbe d'apprentissage des opérateurs n'affecte pas les résultats finaux. Elle permettra d’être plus reproductible sur le traitement thermique et la prise de mesures, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les études principales. À la demande de la FDA, au moins 5 points de données sont requis, afin d'obtenir une variation biologique suffisante et statistiquement significative. Par conséquent, nous prévoyons pour chacune des études principales, l’utilisation de 5 animaux + 2 animaux de réserve. Si les deux animaux de réserve ne sont pas utilisés, ils pourront intégrer une autre étude ou intégrer le troupeau permanant.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation dans l’animalerie d'au minimum 14 jours avant le début des procédures expérimentales. Pendant cette durée, les chiens seront hébergés collectivement. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, et l'administration de récompenses lors de différents exercices (monter sur la balance, s'immobiliser, se coucher, etc.), ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Tous les animaux recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (rotation des jouets par exemple). Des moments de récréation et de jeux avec les soigneurs seront mis en place. Utilisation de l’imagerie par IRM, qui est une modalité d’imagerie non-invasive et non-ionisante, contrairement à d’autres techniques. Tout au long de l’intervention sous anesthésie générale, les chiens seront monitorés par du personnel formé et habitué à travailler chez cette espèce animale. Une personne sera également présente en salle de réveil (salle chauffée), jusqu’au réveil complet des animaux. Après intervention et jusqu’à la fin de l’étude (pendant donc 3 jours), des traitements post-opératoires seront mis en place : analgésique, anti-inflammatoire, antibiotique et antispasmodique. L’intervention induira une inflammation des tissus environnants la prostate, avec possiblement une influence sur la capacité des chiens à uriner. Ainsi une sonde urinaire avec valve anti-reflux sera mise en place, impliquant donc un hébergement en individuel. Des techniciens et vétérinaires formés seront ainsi mobilisés pour gérer ces sondes et poches urinaires plusieurs fois par jour. De plus, un contact plus régulier avec le personnel sera mis en place pour les chiens hébergés en individuel. Un contact visuel et olfactif entre les chiens sera conservé en post-intervention. Toute observation sur la clinique des animaux sera remontée au vétérinaire désigné qui prendra les décisions adéquates. Des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place, afin d’éviter toute forme de souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle canin est l'un des rares modèles animaux qui offre une prostate de taille suffisante pour une thérapie thermique au laser, comparable en termes de taille à la prostate humaine. Adultes, pour garantir que la taille de la prostate est suffisante pour réaliser le traitement et être représentative d'un traitement chez l'Homme.

10 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de deux heures durant laquelle son urètre est sectionné puis reconstruit avec de la veine de cordon ombilical humain, un mini-drain étant laissé en place, suivie d'une endoscopie trois semaines plus tard. Le porteur indique des atteintes possibles de la fonction sexuelle et une rétention urinaire post-opératoire. Il affirme que le projet requiert le système urinaire et immunitaire et ne peut recourir à des méthodes alternatives, malgré une validation préalable sur cadavres.

Objectifs

Les sténoses urétrales correspondent à un segment rétréci de l’urètre, canal qui permet l’évacuation de l’urine vers l’extérieur. C'est une maladie fréquente ( 229-627 patients sur 100 000). Elles se manifestent principalement par des difficulté à vidanger la vessie entièrement et engendrer des infections urinaires et même être responsable d’insuffisance rénale. Pour corriger la sténose de l’urètre, il faut reconstruire l’urètre par chirurgie. Seule un prélèvement de la muqueuse de la bouche à ce jour permet de corriger corriger la sténose. Mais cette technique demande souvent plusieurs intervention chirurgicales et le prélèvement ed la muqueuse de la bouche fait souffrir. Le cordon ombilical est composé d’une veine et de deux artères. Ces vaisseaux qui ont entre autre été utilisés pour la régénération nerveuse, pourrait aussi être utilisés pour reconstruire l’urêtre rétréci. L’objectif de ce projet est donc de remplacer la muqueuse de la bouche par de la veine pour reconstruire l’urètre. Pour cela, des lapins seront opérés, leur urêtre coupés puis reconstruits.

Bénéfices attendus

Actuellement, pour réparer la sténose de l’urêtre, il faut la plupart du temps deux interventions chirurgicales espacées de 3 mois. De plus, le fait de prélever de la muqueuse de la bouche n’est pas sans problème (douleurs, saignements, difficultés alimentaires, troubles de la salivation et du goût, difficulté à articuler). Si la veine du cordon ombilical permet de reconstruire l’urêtre, cette reconstruction pourra être réalisée en une fois. Cette technique pourra être utilisée dans d’autres maladies.

Procédures

La chirurgie sous anesthésie générale et antidouleur va s’étendre sur environ 2 heures pendant lesquelles l’animal, après préparation (tonte, désinfection, mise en place du monitoring) va subir une incision d’environ 2-3 cm. Son urêtre sera externalisé, l’extrémité sera coupée (1.5 cm). Une autre incision sera effectuée plus haut dans le sens de la longueur et sera réparée avec soit l’extrémité coupée, soit avec du vaisseaude la veine de cordon ombilical. Un mini-drain sera laissé en place pour maintenir le canal ouvert. L’urêtre sera reconnecté sur l’exterieur et l’incision de la peau sera suturée. 3 semaines plus tard l’animal subira une endoscopie de l’urêtre pour observer la cicatrisation sous sédation (30 min). Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine. 3 semaines plus tard l’animal sera sédaté et mis à mort (10 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirable sur l’animal sont principalement marquées par : * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale - rétention urinaire post-opératoire possible - atteinte de sa fonction sexuelle * nuisances liées au suivi : - gêne liée à la présence du mini-drain - endoscopie prévues à 3 semaines (contention, anesthésie) - pesée deux fois par semaine (stress).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever l’urêtre et d’effectuer des analyses histologiques pour vérifier la cicatrisation.

Remplacement

D’après les travaux antérieurs, les vaisseaux issus de cordons ombilicaux humains sont tolérés chez le lapin et le rat. Il reste donc à étudier la cicatrisation dans le cadre de la reconstruction de l’urètre. Bien que la technique ait été validée sur cadavres d’autres projets en amont, le projet nécessite le système urinaire et le système immunitaire et ne peut donc pas être réalisé avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Des études préliminaires sur cadavres issus d’autres projets ont déjà permis de valider la procédure chirurgicale sans utiliser de lapins vivants dédiés à cet objectif. La procédure sera réalisée séquentiellement en débutant d’abord par la chirurgie d’un animal qui sera greffé avec de l’urêtre afin de valider le modèle. Dans cette première étape, aucune statistique ne sera effectuée. Un effectif maximal de 4 animaux par groupe est prévu dans l’objectif d’obtenir 3 procédures réussies. 2 animaux de faisabilité sont prévus dans le groupe témoin afin d’effectuer les mises au point non réalisables sur cadavres ce qui porte à 6 animaux maximum pour ce groupe témoin. Par ailleurs, le nombre d’animaux a été réduit grâce à l’utilisation de l’endoscopie (et de biopsie), ce qui permettra d’évaluer la qualité de la prise de la greffe dans le temps chez le même lapin.

Raffinement

La technique chirurgicale a été élaborée et sera effectuée par des chirurgiens d’un service d’urologie. Pendant l’anesthésie l’animal recevra une perfusion d’un anti-douleur fort. Il sera réchauffé. L’animal recevra une combinaison de deux anesthésiques locaux (rapide et longue action) au moment des sutures qui permet de compléter l’action de l’antidouleur au réveil. Ainsi l’animal ne sentira aucune douleur pendant le réveil, ce qui réduira son stress post chirurgie. A réception, l’hébergement par deux sera testés. Si les animaux sont incompatibles, ils bénéficieront de temps dans un espace de « jeux » plus grand que leur cage comportant cabane, tunnel, hamac.. L’état des animaux est évalué par l’observation de leur état physique (ouverture des yeux, orientation des oreilles) et la quantité d’aliment consommée.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal le plus petit permettant de réaliser la reconstruction de l’urètre. L’intérêt de l’urètre du lapin est son calibre proche de celui de l’homme, un trajet droit, la survenue d’érections qui permettra de tester l’élasticité du tissu. D’un point de vue technique, la chirurgie est facile à réaliser dans de bonnes conditions chez le lapin. Une endoscopie de contrôle est facile à réaliser. Les lapins seront choisis par l’éleveur en fonction de leur taille. Nous demanderons des animaux adultes de grande taille afin que l’urêtre soit le plus long possible.

Six mini-porcs vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit douze à treize prélèvements sanguins sur neuf jours après administration intraveineuse ou sous-cutanée de deux formulations, avec suivi de la température et des sites d'injection. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques. Les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'insuffisance cardiaque, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques de deux formulations test . La classe thérapeutique de ces formulations est: Cardiologie.

Bénéfices attendus

Il est necessaire de conduire ce projet pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques de ces deux formulations test qui pourront être utiles pour de futurs projets. A long terme ce projet aura pour objectif de trouver de nouveaux médicaments candidats pour les personnes souffrant d'insuffisance cardiaque.

Procédures

Dans ce projet, des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront réalisés. Douze et treize prélèvements de sang prévus sur 9 jours aprés l'administration intraveineuse ou souscutannée ( 1 mL de sang par prélèvement Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute) Des prélèvements sanguins seront effectués aprés l'administartion intraveineuse aux temps suivants: pre-dose, 0.25h, 0.5h, 2h, 6h, 10h, 24h, 48h, 72h, 120h, 168h et 216h. Des prélèvements sanguins seront effectués aprés l'administartion sous cutannée aux temps suivants: pre-dose, 1h, 3h, 8h, 12h, 24h, 30h, 48h, 72h, 96h, 120h, 168h et 216h. Un suivi de la température corporelle sera effectuée sur 24h ( pre dose, 2h, 8h et 24h post administration). Durée d'une mesure de température: de l'ordre de la minute. Suite aux administrations souscutannées, un suivi des sites d'injections sera également fait sur 48h post administration (pre dose, 1h, 3h, 8h, 24h, 30h et 48h). L'observation macroscopique des sites d'injections est de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Des prélèvements sanguins sont prévus dans ce projet. Les prélèvements seront réalisés sur animal vigile par un personnel expérimenté, conformément aux bonnes pratiques vétérinaire. Les prélèvements seront fait au niveau des veines jugulaires. Le sites de prélèvement seront alternés, droite et gauche, autant que possible. De même, les sites d'administration pour la voie sous cutannée seront observés pendant 48 h pour le suivi de la tolérance post administration. Toutes manipulations sur les animaux seront faites avec un personnel expérimenté, cela minimisera le stress des animaux lors des diverses manipulations.

Devenir

A la fin de ce projet, comprenant qu'une seule procédure, tous les animaux seront gardés en vie.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques de ces deux formulations test.

Réduction

Deux groupes de 3 animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal par groupe pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Dans ce projet, les points limites sont: - Douleurs importantes au niveau des sites de prélèvements (zones des veines jugulaires) - Réactions locales sévères ( exemple: induration, chaleur, douleur, érythème) au niveau du site d'administration ( administration sous cutanée au niveau de la zone lombaire) - Modification du comportement général des animaux suite aux administrations. Il est possible d'observer une hypotonicité des animaux pendant les premières 24h. Cette hypotonicité peut devenir un point limite si elle se prolonge. - L'élément test administré est un peptide biologique (classe thérapeutique: cardiologie). Il est possible d'observer une réponse immunitaire. L'intensité de la réponse sera reflétée par le suivi de la température corporelle. Si cette température est supérieure à 42°C cela pourra être considéré comme étant une point limite. Si un des points limites est atteint, l'animal sera exclu du projet.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus faciles à manipuler.

28 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, six tuées à l'issue pour analyses et vingt-deux réutilisées dans d'autres projets. Chaque animal reçoit l'implantation chirurgicale d'un boîtier de stimulation cardiaque, d'une télémétrie et d'une chambre de perfusion lors d'une opération de quatre heures, puis des injections d'une molécule antiarythmique après induction d'une fibrillation auriculaire. Le porteur affirme qu'aucune stratégie de remplacement n'est reconnue et que la démonstration passe par l'animal. Il décrit une molécule qui se positionnerait sur le marché des antiarythmiques comme alternative aux traitements existants.

Objectifs

L'objectif du projet est de valider les effets bénéfiques d'une molècule sur la fibrillation auriculaire. La fibrillation auriculaire est le trouble du rythme cardiaque le plus fréquent et dont les conséquences peuvent être très préjudiciables pour les patients. L’effet visé par l’administration de la molécule étudiée, appelée AM001, est la restauration du rythme normal et ce serait donc une alternative aux anti-arythmiques aujourd’hui utilisés en clinique. La pharmacologie existante est très limitée et ancienne. Les anti-arythmiques utilisés de nos jours comme l’amiodarone (cordarone®) sont toxiques et peuvent induire des complications thyroïdiennes et des cardiopathies sous-jacentes aux personnes sous traitement. De plus, les antiarythmiques peuvent entraîner des effets pro- arythmiques (torsades de pointes, fibrillation ventriculaire, troubles conductifs sévères,…). La molécule étudiée se positionnerait sur le marché des anti-arythmiques et permettrait de traiter la cause et non plus la conséquence de la pathologie cardiaque. Le composé serait utilisable avec une cardiopathie sous-jacente et ce, sans les effets secondaires mentionnés ci-dessus et sans déprimer la contraction cardiaque. Le traitement présenterait donc l’avantage d’avoir un effet anti-arythmique puissant, sans les effets secondaires et les contre-indications (pathologies cardiaques sous-jacentes notamment) des anti-arythmiques actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet revêt une importance particulière dans la mesure où l’obtention de résultats positifs pourrait réellement avoir des répercussions sur le développement d’un nouveau traitement de la fibrillation auriculaire chez l’homme. L’activité anti-arythmique de la molécule AM001 a été bien caractérisée chez la souris aussi bien au niveau moléculaire que fonctionnelle. Des études ont montré que l’AM001 provoque une totale inhibition de l’induction de la fibrillation auriculaire (par stimulation électrique) in vivo chez la souris et ex vivo dans l’oreillette gauche isolée de brebis. De manière importante, la molécule AM001 restaure le rythme sinusal in vivo chez la brebis anesthésiées et analgésiées en fibrillation auriculaire persistante après 15 minutes de perfusion. La validation d’un effet d’AM001 chez la brebis vigile en fibrilation auriculaire permettrait de proposer une nouvelle voie de traitement de la fibrilation auriculaire chez l’homme.

Procédures

Les animaux auront deux prises de sang (une lors de l’inclusion et une à la fin du projet) 10 minutes sont nécessaire pour faire la prise de sang et également deux prélèvements urinaires, 10 minutes également. 6 animaux auront une cartographie endocavitaire par cathéter, les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les animaux auront une implantation chirurgicale d’un boitier de stimulation cardiaque, d’un boitier de télémétrie et d’une chambre de perfusion, cette procédure dure environ 4 heures. Suite à la récupération post-chirurgicale, les brebis pourront recevoir plusieurs injections d’AM001 (maximum 3, perfusion durant environ 50 min via la chambre dédiée). Les animaux contrôles reçoivent une injection avec le véhicule (cyclodextrine) utilisée pour solubiliser l’AM001. Les effets du traitement seront évalués à distance grâce à la surveillance télémétrique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens électrophysiologiques sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la fibrillation auriculaire mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. Le modèle de brebis est très bien maîtrisé au laboratoire et aucune brebis n’est décédée des suites d’une infection ou d’un problème lié à la cicatrisation. L’induction de la fibrilation auriculaire chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais il est à noter que celle-ci est asymptomatique chez la brebis. Lors des tests des effets de la molécule sur la progression de la maladie, les injections de cette molécule se feront à travers une chambre de perfusion, identique à celle utilisée chez les patients, localisée dans la zone du cou et implantée en sous-cutanée. Concernant les effets éventuels de la molécule, les données préliminaires laissent penser que l’injection de la molécule d’intérêt n’aura pas d’effets toxiques à la dose utilisée. Les effets indésirables peuvent être à ce stade : altération de la cicatrice du site d’implantation, infection dans la zone d’implantation ou rejet des équipements implantés. Pour minimiser l’inconfort de la brebis, les chambres à cathéter implantable par accès veineux sont de petite taille (poids 4.7g, dimensions 30x22x11 mm). La réalisation des injections nécessite l’isolement des brebis pour une durée de 50 à 60 min, ce qui peut induire un stress. Une récompense alimentaire sera donnée par les animaliers expérimentés à chaque injection afin de limiter l’angoisse liée à l’isolement mais également dans le but d’entrainer l’animal afin de faciliter la procédure et de diminuer le stress de la brebis.

Devenir

Six animaux seront utilisés en fin de projet pour réaliser des analyses en labotoire sur des prélèvements. Les autres animaux du projet (vingt deux) seront inclus dans d'autres projets étudiant la fibrilation auriculaire, dans l'objectif de diminuer l'utilisation d'animaux au sein de l'établissement.

Remplacement

Bien que les résultats collectés in vitro soient en faveur d’un effet inhibiteur dela molécule AM001 sur la progression de la fibrilation auriculaire, la démonstration de l’effet thérapeutique passe nécessairement par l’utilisation de l’animal. Aucune stratégie de remplacement n'est reconnue à ce jour permettant de répondre à la question scientifique posée dans ce projet.

Réduction

La stratégie de réduction repose principalement sur l’utilisation d’une quantité limitée d’animaux pour répondre aux questions scientifiques posées avec une puissance statistique suffisante. Pour favoriser la réduction du nombre d'animaux dans ce projet, chaque brebis est son propre contrôle au moins pour les paramètres de fonction cardiaque et le profil électrophysiologique, cette approche permet de limiter le nombre d’animaux utilisé en s’affranchissant de la variabilité interindividuelle. La stratégie de réduction repose également sur la redistribution des animaux étudiés dans ce projet vers les autres projets du laboratoire. Cette mutualisation permettra de réduire significativement le nombre de brebis utilisées au sein de l'établissement tout en répondant aux demandes des différentes équipes de l'établissement. Par exemple, le modèle de brebis est utilisé dans le développement de cathéters de diagnostic pour leur application chez l'Homme.

Raffinement

L’utilisation de la télémétrie pour surveiller la température, l’activité et le rythme cardiaque des brebis 24 heures sur 24 est une mesure de raffinement. En effet, cette approche nous permet de réagir très rapidement pour la réalisation de soins. Par exemple, lors du réveil de l’animal nous pouvons agir si nous observons que le retour de la température corporelle est trop lent. Cette surveillance renforcée permet également de mieux gérer les traitements antibiotiques et/ou analgésiques suite à une augmentation de température significative sans modification du comportement de l’animal ce qui est souvent le cas chez la brebis. Ainsi, cette méthode nous permet de récolter des données sans induire de stress chez la brebis et nous communiquons également les données à l’équipe de l’animalerie pour encore accroître la réactivité en cas de problèmes suite à la réalisation d’une chirurgie par exemple. Plus spécifiquement dans le cadre de ce projet nous entrainerons les animaux à rentrer dans le box d’isolement pour la réalisation de l’injection de l’AM001. L’utilisation d’une récompense alimentaire sous forme de granulés fonctionne très bien chez la brebis. Cet entrainement sera réalisé par les animaliers expérimentés qui s’occupent quotidiennement des animaux de façon à optimiser le processus d’apprentissage. Il est important de noter que la présence des animaliers lors de l’ensemble des procédures est indispensable dans le but de limiter le stress des brebis mais également de faciliter la réalisation des différentes étapes du projet. L’entrainement des brebis permettra de réduire l’angoisse et le stress lors des phases d’injections. Nous utilisons déjà cette méthode lorsque nous devons, 5 à 7 jours après la chirurgie, peser la brebis et allumer le boitier de stimulation, mais également lors des visites régulières à l’animalerie ou dans l’annexe de l’animalerie. Nous savons que des brebis entraînées ont un rythme cardiaque moins élevé lors de l’arrivée dans le box d’isolement que des brebis qui découvrent cet exercice pour la première fois. L’animal est placé dans les conditions d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat à son espèce : groupe social, pierre à sel à disposition, foin et paille. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Le cœur de la brebis a une anatomie, une électrophysiologie et une géométrie proche de celles du cœur humain. Ainsi, les méthodes cliniques d’imagerie et d’électrophysiologie peuvent être directement appliquées dans cette espèce. Les brebis utilisées seront adultes car les dimensions du coeur permettent l’utilisation d'outils cliniques notamment les cathéters permettant de faire la cartographie électrique in vivo. Lapathologie cardiaque de fibrilation auriculaire étant une pathologie majoritairement représentée chez les personnes âgées nous utiliserons des brebis âgées de 8 à 11 ans minimum.

2 miniporcs vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils reçoivent une molécule par voie orale pendant cinq jours, subissent cinq prises de sang, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie et un séjour isolé en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de mesurer la diffusion d'une nouvelle molécule. Le porteur justifie l'étude par des données de pharmacocinétique jugées utiles pour de futurs projets. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier, et présente le porc comme "espèce de choix" sans autre argument.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de la formulation test, de déterminer le passage de la barrière hémato encéphalique de l'élément test et enfin de faire des analyses macroscopiques et dosage de l'élément test aux niveau de certains tissus et organes comme le cerveau, le foie, les reins, le muscle, les poumons , le coeur et la rate.

Bénéfices attendus

Il est necessaire de conduire ce projet pour déterminer les paramètres PK et avoir également des données sur la distribution de cette nouvelle molécule test qui sera bénéfique pour de futur projets.

Procédures

Administration topique orale: Dépôt de la formulation directement sur les muqueuses de la gueule de l'animal, sur animal vigile, volume inférieur à 1 mL durée de l'ordre de la minute. Administrations répétées sur 5 jours 1 fois par jour. Recueil d'urine et de fécès: miction directe. Animal en cage à métabolisme sur 24h maximum. Contact visuel et auditif entre les animaux. Pas de geste particulier fait à l'animal. Prélèvement sanguins: 5 prélèvements maximum sur 5 jours (Pre-dose, 2h, 4h, 26h, 120h ), volume maximal 2 mL, sur animal vigile. Durée par prélèvement: inférieur à la minute Prélèvement de LCR (liquide céphalo rachidien): un seul prélèvement à 5 jours aprés la première administration. Animal anesthésié. Volume prélevé environ 1 mL. Durée du prélèvement: de l'ordre de la minute Euthanasie de l'animal pour prélèvement de tissus: sur animal anesthésié, temps inférieur à la minute. Toutes interventions sur l'animal sera faite avec un personnel expérimenté et conformément aux bonnes pratiques vétérinaire et à la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il est prévu : - Des administrations topiques par voie orales. Une attention particulière sera portée à la manipulation de l'animal plus particulièrement à la contention. Un entrainement par rapport à la manipulation de l'animal est prévu pendant la période d'acclimatation pour éviter au maximum le stress de l'animal. - Des prélèvements sanguins seront réalisés. 5 prélèvements de sang au maximum sur 120h ( pre-dose, 2h, 4h, 26h, 120h ) d'environ 2 mL. Une attention particulière sera portée au niveau des sites de prélèvements. Attention à ce qu'il n'y ait pas de douleur, gonflement au niveau des sites de prélèvement. Pour éviter cela, de la glace et un point de compression suffisament long sera fait aprés chaque prélèvement. - un recueil d'urine et de fécès sur 24h est également prévu. Pour cela les animaux seront placés en cage à métabolisme. Ils seront donc durant cet intervalle de temps (maximum 24h) dans des conditions individuelles et dans un espace restreint. Les animaux auront cependant un contact visuel et auditif entre eux. Toutes manipulations sur les animaux seront faites avec un personnel expérimenté, cela minimisera le stress des animaux lors des diverses manipulations.

Devenir

Dans cette procédure le prélèvement de tissus est nécessaire. Cela sera fait sur tous les animaux post mortem selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques et les paramètres de distribution de l'élément test.

Réduction

Deux animaux sont prévus dans ce projet. Un seul animal par formulation ( 1 contrôle et 1 formulation test). C'est le nombre minimal possible pour avoir un résultat.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 et une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu (apport de jouet: balles, cordes). Les animaux seront également hébergés en cage à métabolisme pour des recueils d'urine et de fécès sur une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les animaux seront observés à minima une fois par jour, voir plusieurs fois par jour si besoin.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus facile à manipuler.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules de lymphome puis des cellules CAR-T par voie intraveineuse, avec plusieurs prélèvements sanguins, et 320 d'entre elles sont irradiées, pour étudier comment le métabolisme de la tumeur influence la réponse à cette immunothérapie. Le porteur indique que la croissance tumorale ne provoque des signes de souffrance qu'à un stade avancé, où l'animal est alors mis à mort. Il présente comme bénéfice attendu de mieux sélectionner les patients éligibles, et affirme qu'aucune alternative in vitro ne reproduit ce dialogue immunitaire.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (LDGC-B) est un cancer du sang très agressif et très fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très diverse et hétérogène, ce qui explique qu'environ 40 % des patients ne répondent pas au traitement de référence. S'ils sont éligibles, les patients qui échappent au traitement peuvent bénéficier d'une thérapie innovante appelée "thérapie par transfert de cellules adoptives" (ou cellules CAR-T). Pour cela, un type spécifique de cellules du système immunitaire du patient (lymphocytes) est prélevé puis génétiquement modifié en laboratoire pour leur permettre de reconnaître les cellules tumorales du patient. Une fois ces cellules immunitaires réintroduites chez le même patient, elles peuvent alors reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Bien que très efficace dans le traitement du LDGC-B, environ 50 % des patients ne répondent pas à ce traitement ou rechutent rapidement (dans l'année qui suit). Il est donc important de comprendre comment améliorer la réponse à ce traitement. Les LDGC-B ont différentes façons de produire leur énergie cellulaire, un support essentiel à leur division constante et rapide. En effet, ces cellules tumorales utilisent soit la voie des sucres (glycolyse), soit l'usine de fabrication d'énergie de la cellule (la mitochondrie). Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si la façon dont la cellule tumorale produit son énergie va limiter ou favoriser la réponse des cellules CAR-T.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de mieux sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de cette thérapie innovante.

Procédures

Toutes les souris (640) seront injectées par voie intra-veineuse dans la veine caudale 2 fois au cours de l’expérience pour 1/ recevoir les cellules de lymphome (allogreffe) puis 2/ 7 jours plus tard les cellules T (contrôle ou CAR-T). Chaque injection prendra environ 5 min par souris et sera réalisé sur souris vigile. Un prélèvement de sang (100 µl) sera effectué sur souris vigile 2-3 jours avant l’injection des cellules CAR-T puis une fois par semaine dans la veine caudale de la souris ou en sub-mandibulaire à l’aide d’une aiguille 25G (le volume maximal qui sera prélevé à chaque fois est de 100 µl). Ainsi chaque souris aura entre 4 et 6 prélèvements sanguin sur l’ensemble de la durée de l’expérience. Les souris de la procédure 2 (320) seront irradiées à une dose sublétale (4 Gy). Pour cela elles seront placées 5 par cages (cage spéciale pour l’irradiateur) et seront irradiées pendant 206 secondes (3 min et 26 secondes) pour atteindre 4 Gy (notre irradiateur dispense 1,16 gray par 60 secondes). Cette irradiation ne sera réalisée qu’une fois par souris.

Impact sur les animaux

Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les souris pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection des cellules immunitaire (CAR-T), soit par l'irradiation modérée. Nous avons une grande expertise de ce modèle. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation) qu’à un stade avancé de la maladie. Cependant en cas de persistance des signes décrits ci-dessus, l’animal sera mis à mort. Les sites d’injections seront surveillés attentivement.

Devenir

mise à mort et mesure du poids des organes, analyses métabolomiques, cytométrie de flux, analyses moléculaires et immuno-histochimiques

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement par les CAR-T. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre minimum de souris à utiliser afin d’être statistiquement significatif.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En terme de raffinement, les souris sont hébergées par groupe de 5 avec un milieu enrichi. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Finalement, en absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.