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Développement d’un modèle murin de métastases double localisation : péritonéales et hépatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie subit une chirurgie abdominale pour recevoir une greffe de cellules cancéreuses coliques, provoquant des métastases hépatiques et péritonéales. Le porteur indique que la maladie peut causer une douleur modérée, une ascite et une perte de poids, et prévoit de tuer tous les animaux à trois semaines. Il présente ce modèle comme "indispensable" pour préparer de futurs tests de chimiothérapie, non menés ici.
Objectifs
Ce projet consiste en la mise au point d'un modèle de carcinose colique avec métastase hépatique limitée qui permettra des études ultérieures comme l'évaluation de l'efficacité de traitements chimiothérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet est indispensable avant de réaliser les tests d'efficacite de traitements chimiothérapeutiques (projets ultérieurs dans une future saisine) sur des individus qui ne sont pas pris en charge par la thérapie curative de nos jours. Au delà de la valorisation scientifique sur la mise au point de ce modèle simple, les applications en santé humaine seront facilement transposable en raison de l'absence d'études dans ce domaine (patients oligo-métastatiques).
Procédures
Les animaux du lot injection intrasplénique sont soumis à une procédure chirurgicale par laparotomie légère (64 animaux) d'une durée de 5 min maximum chacun à J0.
Impact sur les animaux
Il est possible que la maladie engendrée (métastases d'origine colique) cause une douleur modérée par la suite aux animaux. L’expérience ne se prolongera pas au-delà de 21 jours post-greffe ce qui limite l'étendue de la maladie et l'effondrement des constantes de l'animal non traité (fonction hépatique par exemple). Une attention particulière est portée sur le comportement alimentaire : anorexie, perte de poids > 20%, sur l'altération de l’apparence physique (grattage, poil terne,…) et celle du comportement (repli dans un coin, poil hérissé,…). Une prise de poids est à prévoir en raison de l'accumulation du liquide d'ascite dans la cavité péritonéale, en particulier la 4ème semaine post greffe, d'où la décision d'euthanaiser tous les animaux à J21. Le fonctionnement du transit intestinal peut aussi être perturbé (selles liquides) et l'aspect des selles sera surveillé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés en raison de la gravité de la pathologie (l'expérimentation ne vise pas des rémissions complètes) et en particulier de la quantité d'organes prélevés pour analyses histologiques (pancréas, foie, ...) empêchant la survie des animaux
Remplacement
Ce projet expérimental utilisant au total 88 souris répond aux exigences des 3R, en particulier "remplacer" : les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse histologique d’un organisme entier face à l’administration de thérapeutiques. Ils sont aussi insuffisants pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles murins de carcinose péritonéale et hépatique sont bien décrits et permettent de mimer le phénomène observé chez l’Homme.
Réduction
le modèle de carcinose péritonéale et hépatique est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter des étapes de mises au point, déjà réalisées par le passé dans des laboratoires de renom. De plus, des expériences in vitro ont déjà permis de définir les valeurs seuil et dose-réponse de la chimiothérapie sur les cellules de cancer colorectal murin. Celles in vivo sont organisées dans un ordre précis, avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. La souris est l’espèce modèle la plus adaptée pour ces études précliniques.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. De plus, l’ensemble des procédures sera réalisé de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffant pendant la chirurgie, analgésique post opératoire).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est classiquement utilisée comme organisme modèle de nombreuses pathologies humaines. Son cycle de vie court et son élevage aisé, associée à sa taille et à sa physiologie proche de celle de l’homme un modèle clé en cancérologie. Il s’agit de souris femelles immunocompétentes. Les souris sont utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour les greffes tumorales et les procédures chirurgicales pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement. Ce type de souris est utilisé largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées dès l’âge de 5-6 semaines jusqu’à 1 an pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement (si animaux plus âgés) ou des processus de croissance juvénile (si animaux plus jeunes).
Évaluation de la toxicité et de l’efficacité de bactéries microbiotiques ou de leurs molécules d’intérêt, administrées par voie inhalée, dans des modèles murins infectés par le virus de la grippe.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent par voie intranasale des bactéries ou des métabolites, sont infectées par le virus de la grippe, puis tuées pour prélever sang et tissus pulmonaires. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte de poids, fièvre et léthargie durant six à sept jours. Il écarte les méthodes sans animaux au motif qu'aucune ne permettrait de connaître la tolérance d'un "organisme entier".
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme la pandémie actuelle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. La vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus. Cependant, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En plus de cela, le développement de nouveaux médicaments antiviraux a été lent, et même les médicaments disponibles sur le marché soulèvent des préoccupations quant à leurs effets secondaires. Par conséquent, des stratégies plus efficaces contre les infections virales sont à développer. Les médicaments orientés vers l’hôte et capables de moduler le système immunitaire, en améliorant ou en limitant les réponses exacerbées, élargissent considérablement le répertoire des cibles thérapeutiques par rapport aux médicaments antiviraux simples et présentent une meilleure barrière face à l’émergence d’une résistance virale. Plusieurs molécules immunomodulatrices, présentant des propriétés antivirales ont été mises en évidence. Par exemple, le succinate est capable d’inverser la reprogrammation métabolique déclenchée par le virus de la grippe, Influenza A (IAV), en diminuant l’expression des voies inflammatoires spécifiquement déclenchées par l’IAV et en bloquant le cycle de réplication virale de l’IAV, sans effet toxique chez la souris. D’autre part, les bactéries provenant du microbiote se sont révélées non seulement promoteuses pour le maintien de l’équilibre de l’organisme, mais aussi comme une nouvelle source de molécules pertinentes pour l’hôte afin de renforcer le système immunitaire. Elles ont été utilisées pour lutter contre plusieurs maladies intestinales mais aussi infectieuses respiratoires. De plus certaines de ces bactéries produisent des molécules d’intérêt, tel que le succinate. Ainsi, notre projet vise étudier ces bactéries produisant des molécules immunomodulatrices pertinentes dans le contexte de l’infection virale grippale. Après une évaluation de leur efficacité et innocuité in vitro, nous sélectionnerons les bactéries et leurs molécules les plus prometteuses pour être testées chez la souris.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à utiliser des bactéries pour délivrer des molécules immunomodulatrices, ou directement les molécules immunomodulatrices, au niveau de la muqueuse respiratoire infectée par des virus. Cette stratégie est innovante et pertinente car : 1) elle propose une nouvelle stratégie de traitement qui propose l’administration de bactéries microbiotiques ou de leurs molécules d’intérêt dans les voies respiratoires ; 2) elle permet de trouver une solution contre les infections virales sans favoriser la résistance; 3) elle propose une solution de traitement qui peut être administrée par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire; 4) elle ne nécessite pas de conditions de stockage spéciales, ce qui permet une facilité de manipulation et d’administration.
Procédures
Procédure 1: Expérience de tolérance en administrant, par voie intranasale, une seule dose de bactéries ou de metabolites. Nº de souris par produit à évaluer: 80. Durée de la procedure: 2 jours. Chaque souris sera manipulée 20 min total/jour (comprenant un temps d’habituation de l’animal à l’espace+ observation, anésthésie et administration de bactéries/metabolites et prélèvements de sang et tissus pulmonaires le dernier jour). Procédure 2: Expérience de tolérance en administrant, par voie intranasale, des doses répétées de bactéries ou de metabolites. Nº de souris par produit à évaluer: 64. Durée de la procedure: 7 jours maximum. Chaque souris sera manipulée 20 min total/jour (comprenant un temps d’habituation de l’animal à l’espace + observation, anésthésie et administration de bactéries/metabolites et prélèvements de sang et tissus pulmonaires le dernier jour). Procédure 3: Evaluation d’un traitement prophylactique utilisant des bactéries ou des molécules d’intérêt dans un modèle d’infection grippale chez la souris. Nº de souris par produit à évaluer: 144. Durée de la procédure: 8 jours d’expérimentation maximum et 7 jours d’observation. Chaque souris sera manipulée 20 min total/jour (comprenant un temps d’habituation de l’animal à l’espace+observation, anésthésie et administration de bactéries/metabolites/virus et prélèvements de sang et tissus pulmonaires le dernier jour). Procédure 4: Evaluation d’un traitement curatif utilisant des bactéries ou des molécules d’intérêt dans un modèle d’infection grippale chez la souris. Nº de souris par produit à évaluer: 144. Durée de la procedure: 7 jours d’expérimentation maximum et 7 jours d’observation maximum. Chaque souris sera manipulée 20 min total/jour (comprenant un temps d’habituation de l’animal à l’espace + observation, anésthésie et administration de bactéries/metabolites/virus et prélèvements de sang et tissus pulmonaires le dernier jour). Procédure 5: Evaluation d’un traitement curatif utilisant des bactéries ou des molécules d’intérêt sur la survie des souris dans un modèle d’infection grippale. Nº de souris par produit à évaluer: 48. Durée de la procedure: 7 jours d’expérimentation maximum et 15 jours d’observation maximum. Chaque souris sera manipulée 20 min total/jour (comprenant un temps d’habituation de l’animal à l’espace + observation, anésthésie et administration de bactéries/metabolites/virus et prélèvements de sang et tissus pulmonaires le dernier jour).
Impact sur les animaux
Nous attendre aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection. Une surveillance bi-quotidienne sera donc réalisée (température, poids, comportement, etc.).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par notre équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, nous utilisons des systèmes de culture in vitro et ex vivo (cellules épithéliales primaires humaines), pour étudier les effets toxiques possibles et l’efficacité des bactéries et des molécules afin de ne sélectionner que les plus prometteuses pour les études in vivo.
Réduction
Tout d’abord, nous tenons à souligner que les expériences in vitro et ex vivo, réalisées au préalable avec des cellules épithéliales primaires humaines limiteront le nombre de bactéries et de molécules à évaluer et donc le nombre de souris à utiliser. L’objectif est de tester 8 produits maximum. Les calculs du nombre de souris sont basés sur des études statistiques afin d'utiliser le nombre minimum de souris possible et d'atteindre une signification statistique.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté (4 ou 6 souris par cage) dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris souris C57Bl/6 parce qu’il s’agit d’une souche de souris appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi d’infection par le virus de la grippe. D’autre part, le modèle d’infection grippale est pleinement maîtrisé sur cette souche de souris au laboratoire et le pathogène utilisé dans ce projet est identique à celui infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, cette souche de souris limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant.
Etude des effets de l’ExtraCorporeal Life Support (ECLS) sur la biomécanique et le remodelage tissulaire du muscle cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
80 brebis vont être utilisées dans une chirurgie unique d'environ sept heures menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Un infarctus puis un choc cardiogénique leur sont provoqués pour étudier l'assistance circulatoire par ECLS, le cœur étant prélevé en fin d'intervention. Le porteur indique que la procédure peut entraîner hémorragies, troubles du rythme et arrêt cardiaque, et rapporte une mortalité péri-opératoire de l'ordre de 25 % dans ce type de modèle. Il conclut que le recours aux animaux est "incontournable" et "ne peut être remplacé".
Objectifs
Lors d’un infarctus du myocarde, le cœur perd en partie sa fonction contractile et peut devenir incapable de faire circuler le sang dans l’organisme. On parle de choc cardiogénique. En cas de choc sévère, des machines de circulation extracorporelle (ExtraCorporeal Life Support=ECLS) sont utilisées. Elles permettent d’assurer la circulation sanguine en attendant une récupération cardiaque. Cependant l’ECLS augmente le travail que doit fournir le cœur pour éjecter. Il existe un conflit entre l’ECLS et l’éjection résiduelle du cœur défaillant. Ainsi, l’ECLS permet de faire circuler le sang et d’assurer la survie immédiate du patient mais au prix d’une majoration du travail myocardique. On observe sous ECLS, une dilatation du cœur avec un étirement des parois et des cellules. Cette dilatation et l’augmentation du travail cardiaque vont augmenter la taille de la zone nécrosée et de l’infarctus. Le patient survit mais avec un infarctus plus grand. Or plus la zone nécrosée est importante et plus le patient deviendra insuffisant cardiaque chronique. Cette évolution, d’un infarctus aigu vers une maladie chronique, semble liée à des phénomènes de remodelage ventriculaire. Il intègre des modifications des fonctions cellulaires et des tissus, de l’inflammation et de la mort cellulaire. L’enjeu est donc de réduire au maximum la nécrose lors d’un infarctus. Pour limiter le travail du coeur sous ECLS, des techniques ont été développées. Il s’agit, entre autres, du ballon de contre- pulsion intra-aortique ou de la pompe micro-axiale. Des machines d’assistances pulsatiles sont également en cours d’étude. Les effets hémodynamiques, tissulaires et cellulaires et les conséquences de l’ECLS restent cependant mal connus. Les objectifs sont donc de décrire l’impact et les stratégies complémentaires de l’ECLS sur : l’hémodynamique et les performances énergétiques du myocarde défaillant, la taille de l’infarctus et les voies de signalisation cellulaires impliquées dans le remodelage ventriculaire.
Bénéfices attendus
A court terme les bénéfices attendus sont : une diminution des syndromes de bas débit (faible circulation sanguine, une récupération plus rapide de l’état clinique des patients avec une réduction des durées d’hospitalisation. A long terme les bénéfices suivants sont attendus : une réduction des modifications structurelles du cœur (remodelage) et une réduction du taux d’insuffisance cardiaque chronique.
Procédures
L’ensemble des animaux du projet (80) sont inclus dans une unique procédure sans réveil. Cette procédure correspond à une seule intervention chirurgicale. Celle-ci permet des réaliser les tests ayant pour objectif de pallier aux effets indésirables de l’utilisation d’ECLS. Ces tests durent environ 7 heures pendant lesquelles l’animal reste anesthésié, cette procédure permet de répondre aux objectifs du projet. Pour ce projet, les animaux sont donc sous anesthésie générale lors de la procédure sans réveil, et ceci concerne l’ensemble des animaux inclus.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels peuvent être : un hématome au point de ponction, une dissection des vaisseaux (lors de la pose des cathéters), un hématome de paroi, une dissection des vaisseaux, des troubles du rythme cardiaque et un arrêt cardiaque (lors de la coronarographie et de la réalisation de l’infarctus), une hémorragie (lors de la sternotomie). Ces événements sont surveillés et des actions sont mises en place lors de l'intervention qui est réalisée sous anesthésie générale et sans réveil pour l'animal.
Devenir
L’ensemble des animaux sera sacrifié pour permettre la réalisation d'analyses de tissus et de l’activation des voies de remodelage ventriculaire. Il s’agit d’une expérimentation sans réveil pour l’animal.
Remplacement
Notre étude nécessite de créer un infarctus conduisant à un choc cardiogénique pour évaluer l’impact d’une assistance de type ECLS, pulsée ou non, et d’une décharge ventriculaire mécanique. Ces machines sont indispensables pour assurer la survie d’un patient en choc cardiogénique mais ont un effet potentiellement délétère sur le coeur et peuvent précipiter le patient vers l’insuffisance cardiaque chronique. Pour étudier les effets de l’ECLS, des décharges et les phénomènes de remodelage ventriculaire, le cœur est prélevé en fin d’expérimentation. C’est l’unique moyen pour réaliser des analyses tissulaires et cellulaires et évaluer les activations des voies de remodelage des tissus. L’utilisation de modèles mathématiques ou l’expérimentation sur un cœur isolé n’est pas réalisable pour plusieurs raisons : les connaissances actuelles en la matière ne sont pas encore étendues et cohérentes, ce qui ne permet pas une modélisation mathématiques ; nos approches se caractérisent par une exploration fonctionnelle et moléculaire dans un modèle de choc cardiogénique ; la réalisation de ce type d’étude avec un tel niveau de complexité n’a été jusqu’à présent pas été réalisée de manière aussi approfondie. Afin d'atteindre les objectifs scientifiques du projet, l'utilisation d'animaux est incontournable et ne peut être remplacée.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude et dans le but d’obtenir le plus grand bénéfice, nous avons calculé que 80 brebis sur une durée de 5 ans seraient nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques. Il s’agit du nombre minimal d’animaux nécessaire à l’obtention de données de qualité exploitable et permettant une analyse statistique fiable. Si les objectifs expérimentaux peuvent être atteints par l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux, ou si l’obtention de résultats via l’utilisation d’animaux reste irréalisable, alors plus aucun animal supplémentaire ne sera utilisé. Il a été observé par d’autres laboratoires, ainsi que par notre équipe une mortalité péri-opératoire de l’ordre de 25% dans ce type de modèle animal de choc cardiogénique. Des points réguliers avec l'équipe porjet seront réalisés régulièrement au cours des cinq ans en vue d’optimiser la qualité de l’expérimentation. Les prélèvements de tissus seront conservés pour permettre des analyses immédiates mais également futures par la création d'une banque de tissus et de plasma permettant de travailler sur plusieurs années sans utiliser d'autres animaux.
Raffinement
Pour réduire les nuisances sur le bien-être, toutes les mesures sont mises en place, tout au long du projet. Les animaux sont transportés dans les conditions adaptées à l'espèce, dans un véhicule autorisé par les instances de contrôle et par du personnel formé plusieurs jours avant l’expérimentation. Cela permet une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire le stress du déplacement. Les animaux sont hébergés dans des locaux agréés. Des méthodes de raffinement sont mises en place afin d’améliorer leur condition d’hébergement : les brebis sont hébergées en groupe social (les brebis étant des animaux grégaires), sur paille avec à leur disposition de la pierre à sel. Un personnel formé leur apporte les soins nécessaires quotidiennement. Le jour de l’intervention, les animaux reçoivent une prémédication à base de sédatif permettant d’être complètement détendu pour le transfert au bloc opératoire. Le protocole expérimental est réalisé sous anesthésie générale incluant une tranquillisation (prémédication), une inconscience (sédation) et une analgésie adaptée. Durant l’ensemble de la procédure, l’animal est surveillé (fréquence cardiaque, tension artérielle, fréquence respiratoire). En cas d’augmentation de ces paramètres (sans raison cardiaque), l’anesthésie pourra être approfondie afin de maintenir une anesthésie profonde et une absence de souffrance. L’électrocardiogramme, la pression artérielle, et la saturation en oxygène seront suivis tout au long de l’anesthésie. Des molécules de réanimation et des anti-arythmiques seront utilisées si nécessaire notamment en cas de survenue de troubles du rythme. Un défibrillateur sera installé afin de réduire au maximum le temps de délivrance du choc électrique externe en cas de fibrillation ventriculaire si elle survient. Des critères d’arrêt sont définis : en cas d’arrêt cardiaque persistant après 20min malgré la mise en place de l’assistance circulatoire, l’animal ne sera plus réanimé et l’assistance sera éteinte. L'animal ne sera jamais réveillé lors de l’expérimentation et la mise à mort sera réalisée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Bien que des modèles d’infarctus chez le petit mammifère existent, les cœurs de plus grands mammifères ont des caractéristiques électrophysiologiques et géométriques plus proche de celles du cœur humain. Les méthodes cliniques d’imagerie cardiaque conventionnelle (IRM) peuvent être directement appliquées de par leurs similitudes avec le cœur humain. L’application de ces techniques représente donc une étape importante vers une application en clinique. L’espèce Ovins a été choisi car : - le modèle d’infarctus dans cette espèce est bien décrit et caractérisé - le personnel menant la procédure possède une grande expertise avec cette espèce - le réseau coronarien de la brebis est proche de celui de l’homme (circulation coronarienne de type terminale sans ou avec peu d’anastomose permettant de créer un infarctus sans que de petits vaisseaux assurent la perfusion du tissu) Age adulte (entre 1 et 3 ans) afin d’expérimenter avec des cavités cardiaques et un réseau vasculaire dont les dimensions sont comparables à l’homme. Cet aspect est essentiel notamment pour la mise en place des canules artérielles et veineuses pour l’ECLS et les décharges mécaniques.
Stratégies d’immunisation chez la souris pour l’obtention d’anticorps monoclonaux
- Recherche appliquée
- Cancers
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes ou d'ARNm et des prélèvements sanguins, avant d'être tuées pour prélever leurs organes lymphoïdes, afin de produire des anticorps monoclonaux destinés aux programmes d'une société. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une détresse modérée, des réactions inflammatoires et, en intramusculaire, une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs. Il revendique une qualité "souvent supérieure" des anticorps dérivés d'animaux et affirme qu'aucune méthode alternative n'est possible pour les hybridomes murins.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’immuniser des souris avec un antigène et/ou de l’ARNm afin d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront potentiellement être sélectionnés au sein des programmes de la société. Ces anticorps pourront devenir des candidats médicaments pour de la thérapie humaine ou des outils pour développer les méthodes analytiques nécessaires à un projet scientifique.
Bénéfices attendus
Ces dernières années, les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus importants dans de nombreux domaines et particulièrement dans celui de la thérapie humaine. Ces molécules émergent de plus en plus dans le domaine de l’immuno-oncologie afin de traiter les patients atteints de nombreux types de cancer différents. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la génération d’outils de développement de méthodes analytiques, nécessaires à un projet scientifique ainsi celle de potentiels candidats médicaments pour de la thérapie humaine.
Procédures
Ce projet comporte 3 procédures expérimentales correspondant chacune à une stratégie d’immunisation spécifique. Un même animal ne pourra pas être impliqué dans plusieurs procédures. Les animaux seront, donc, soumis à une seule procédure comportant plusieurs étapes/interventions. Des échantillons de sang seront prélevés, sous anesthésie gazeuse associée à une analgésie locale, au cours de chacune des procédures. Les animaux recevront également un nombre d’injection variables d’antigène et/ou d’ARNm, en fonction de la stratégie sélectionnée. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes lymphoïdes. Typiquement, les interventions seront réalisées entre 1 et 2 fois toutes les 2 semaines pendant 4 ou 8 semaines. Cependant, la durée maximale de chacune des procédures est de 6 mois pour permettre la réalisation d’un protocole « retardé ». Chacune des interventions réalisées est de courte durée (≤10 minutes).
Impact sur les animaux
La majorité des souris subiront des injections répétées pouvant générer une légère douleur lors de leur réalisation. Cependant, celles-ci étant répétées, il y aura des effets cumulatifs, ce qui pourrait entraîner une détresse modérée chez ces souris. L’injection d’antigène ou d’ARNm peut provoquer des réactions inflammatoires importantes, notamment, durant les 2-5 jours suivant l’injection. Ces dernières peuvent, dans certains cas, se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilité, une réduction de la réactivité aux stimuli verbaux et sensoriels et/ou un pelage ébouriffé. De par la faible masse musculaire de la souris, l’injection intramusculaire peut, parfois, causer une nécrose musculaire ou une inflammation des nerfs.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux présentant la meilleure activité contre l’antigène d’intérêt seront euthanasiés pour la collecte d’organes lymphoïdes. Ces derniers permettront, par la suite, la génération des anticorps monoclonaux. Les animaux non-prélevés seront, quant à eux, euthanasiés afin de limiter les nuisances sur leur bien-être et éviter tout effet indésirable à long-terme.
Remplacement
In vivo, les anticorps monoclonaux sont des molécules complexes qui font intervenir de multiples étapes permettant une sélection des plus efficaces. Le principal avantage des anticorps dérivés d’animaux par immunisation est donc leur qualité, souvent supérieure à ceux non-dérivés d'animaux (ex : phage display). Ces derniers nécessitent, également, des coûts et des délais de génération beaucoup plus importants. De plus, leur qualité pour les phases de développement non clinique d’anticorps thérapeutiques peut poser des difficultés supplémentaires. Par ailleurs, dans le cas où la production d’anticorps nécessite le développement d’hybridomes murins, il n’est pas possible d’utiliser de méthode alternative.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux qui seront utilisés a été calculé afin d’optimiser les chances d’obtenir au minimum un anticorps d’intérêt, par stratégie d’immunisation. Dans le cas où les technologies, réalisées à partir des organes lymphoïdes des souris sélectionnées, ne permettront pas d’obtenir d’anticorps de qualité ou possédant les caractéristiques désirées, un protocole retardé pourra être réalisé sur les animaux immunisés restant. Les animaux utilisés seront généralement issus de lignées consanguines.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où un animal devrait être maintenu seul dans sa cage, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse) associée à un analgésique local et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. L’utilisation d’aiguilles de diamètre adapté au type d’injection à réaliser et le plus petit possible seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. L’évolution pondérale, l’aspect général et le comportement des animaux (apparence, plaie/traumatisme, excrétion) seront suivis une fois par semaine. En post-injection d’antigène ou d’ARNm, période durant laquelle l’animal peut perdre du poids ou présenter des signes physiologiques marqués de détresse, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que le poids de l’animal ne diminue plus sur 2 pesées successives et que celui-ci ne présente plus d’éventuels signes physiologiques de détresse aiguë (hypomobilité/hyporéactivité, respiration accélérée/ralentie, etc.). Pour limiter l’impact de l’injection et faciliter la récupération des animaux, un gel aqueux enrichi en nutriments sera, également, mis en place en pré et post-injection durant la totalité de cette période. Dans le cas d’injection intramusculaire, une surveillance accrue du site d’injection et de la motricité du membre de l’animal sera, également, effectuée. Après cette période, la fréquence d’observation et de pesée des animaux sera de nouveau réduite à 1 fois/semaine. Elle pourra, cependant, être augmentée en cas de nouvelle dégradation de l’état de l’animal. Des points limites spécifiques relatifs à une perte de poids trop importante et/ou un aspect général/comportement très dégradé seront des critères pouvant justifier l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme animal est basé sur la bonne connaissance de son système immunitaire et sa capacité à générer des réponses antigéniques efficaces permettant d’obtenir des lymphocytes B exprimant des anticorps spécifiques de haute affinité. De plus, sa petite taille, sa grande fécondité et son coût de production et d’entretien relativement peu élevés en font un animal de choix. Le développement de nombreuses souches consanguines a, également, permis d’obtenir des lots d’animaux génétiquement très similaires, facilitant ainsi les études comparatives. Les animaux utilisés auront préférentiellement un âge compris entre 6 et 8 semaines. En effet, il a été décrit que la souris développait une réponse immunitaire plus forte contre les antigènes externes à cet âge.
Etude de l’Intégrité du génome, du microenvironnement et du cancer du foie dans le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
5 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Elles reçoivent des injections répétées, dont une injection hydrodynamique représentant environ 9 % de leur poids corporel qui dilate massivement le foie, et développent des tumeurs hépatiques pouvant entraîner asthénie et perte de poids. Le porteur précise que les animaux ne recevront pas d'analgésie avant l'anesthésie, la métabolisation par le foie risquant d'interférer avec le phénotype étudié. Il conclut que la souris est "indispensable" comme "seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire des gènes de façon tissu-spécifique.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de notre projet permettront de déterminer les mécanismes moléculaires altérés conduisant au développement d’un cancer du foie. Les retombées de nos travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Des animaux recevront soit une injection intra-péritonéale (une fois à 5 semaines de vie, durée 30 secondes, animal vigile), soit une injection rétro-orbitale (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute, animal anesthésié), puis recevront ensuite une injection intra-veineuse (veine de la queue) (une fois, à 6-8 semaines de vie, durée 5-7 secondes, animal vigile). Une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 14 jours de vie, durée 30 secondes) sur animal vigile. Ces mêmes animaux seront soumis soit à une injection intra-péritonéale (une fois à 5 semaines de vie, durée 30 secondes, animal vigile), soit à une injection rétro-orbitale (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute, animal anesthésié). Certains animaux recevront une injection intra-péritonéale (une fois à 7 semaines de vie, durée 30 secondes, animal vigile) et d’autres recevront une injection rétro-orbitale (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute, animal anesthésié).
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Du fait de l’injection intra-veineuse par la veine caudale d'un grand volume de solution dans la circulation systémique, une douleur transitoire dans cette région pourra être ressentie. Par ailleurs, l’injection hydrodynamique d'environ 9 % du poids corporel en volume, conduit à une dilatation massive mais transitoire (
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 5728 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. Les animaux ne recevront pas d'analgésiques en pré-anesthésie car leur métabolisation par le foie (notre modèle d'étude) pourrait conduire à une hépatotoxicité interférant avec le phénotype que l'on souhaite étudier. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont (1) des souris juvéniles de 14 jours car à ce stade développemental, le foie est le plus réceptif à l’activité de composés carcinogènes, (2) de jeunes adultes (5 à 7 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
Etude de l’efficacité de composés à visée antipaludique chez la souris (dérivé des Phenmiazines)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un paludisme murin (Plasmodium berghei), reçoivent des composés par gavage et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue puis un prélèvement rétro-orbitaire terminal, pour tester des molécules dérivées des Phenmiazines. Le porteur indique qu'une parasitémie élevée peut provoquer une anémie, une perte de mobilité et une perte de poids. Les retombées en clinique humaine restent renvoyées au conditionnel, et le remplacement est écarté au motif qu'il n'existerait "pas de solution viable" hors modèle animal.
Objectifs
importantes dans le fonctionnement du parasite responsable du paludisme. Ces iinhibiteurs appartiennent à la famille des Phenmiazine[1-3].Le projet comprant également l’évaluation de la cytotoxicité dans le but d’un essai préclinique. Les tests visant à évaluer l’efficacité antipaludique in vitro contre Plasmdium spp ont permis d’isoler les composés ayant les meilleures activités. L’ensemble de ces démarches prises ensemble nous amènent à analyser l’efficacité antipaludique de ces molécules dans un système de paludisme murin qui est la base des essais pré-clinique dans la recherche de thérapie expérimentale. Les données collectées permettront de déterminer si des tests cliniques plus poussés peuvent être poursuivis. Par ailleurs les Phenmiazines seraient un atout dans la lutte antipaludique en raison de la diminution des thérapies efficaces et de la résistance croissante aux antipaludiques de la part de Plasmodium falciparum. Elles seraient également un atout chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà recommandées par l'OMS
Bénéfices attendus
A court termes, les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettrait également de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique. A plus long terme, ceci apporterait une nouvelle famille chimique antipaludique dont le mécanisme reste à approfondir. Si les résultats venaient à se confirmer, ce serait l’opportunité de développer un principe actif sur la base structurale de ces molécules, et un potentiel médicament avec des paramètres pharmacocinétiques compatibles Le but étant de mettre au point des composés efficaces en clinique humaine contre le paludisme, alors que l’arsenal des thérapies utiles et efficaces diminue rapidement.
Procédures
Procédure [1] 2 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours+ A 7% de parasitémie, 1 anesthésie et 1 prélèvement rétro orbitaire - totalité du sang prélevé et euthanasie (durée 30 minutes) - Procédure [2] 24 souris : prélèvement veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours + pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’ingestion (per os) de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux élevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire
Impact sur les animaux
Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des souris pour la cytotoxicité. Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité obtenues lors de notre étude in vivo. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre.
Devenir
Procédure [1] 2 souris euthanasiées par dislocation cervicale après réalisation du prélèvement rétro orbitaire sous anesthésie. La récupération de la totalité du sang infecté ne permet pas de maintenir la souris en vie. Ce sang est important pour infecter les souris de la procédure 2 et maintenir notre souche de paludisme murin. Procédure [2] 24 souris euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie. L'euthanasie des souris permet de récupérer rapidement les organes (cerveau, cœur, foie, poumons, reins, rate) des souris et le sang afin de doser les médicaments présents dans les tissus, mener les études de protéomique et d'histologie nécessaires à l'étude des dommages tissulaires liées à l'infection. Les souris ayant été déjà traitées et infectées, il est difficile de les réinfecter en raison d'une résistance à la réinfection manuelle et une réactivité du système immunitaire. Il est difficile de les réutiliser pour un essai similaire de pharmacothérapie, les souris ayant pris du poids et de l’âge ce qui limite également la possibilité de réinfection [16-19]
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.
Réduction
La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% est donné par la formule suivante, dans le cadre d’un test bilatéral et avec des effectifs égaux dans les deux groupes.
Raffinement
Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (l’enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’IHU, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués
Choix des espèces
Le modèle murin (Mus musculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle BALB/c+Plasmodium berghei en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Les souris BALB/c seront des individus adultes âgés de 8 à 9 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 10 à 11 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi au début de maturité du système immunitaire.
Evaluation des modalités d’injection intratumorale d’antiCTLA4 pour l’obtention d’une réponse antitumorale et intérêt de la vectorisation
- Recherche appliquée
- Cancers
421 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à deux greffes tumorales, quatre injections de médicaments, des prises de sang et une séance d'imagerie sous anesthésie pouvant durer deux heures. Le porteur indique qu'il n'est pas possible de traduire in vitro la réponse aux immunomodulateurs et travaille sur des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs. Le projet évalue l'injection locale d'un anticorps anticancéreux et met en avant une dose dix fois moindre qu'en voie systémique.
Objectifs
L'immunothérapie a modifié de façon considérable la prise en charge thérapeutique de plusieurs types de cancers. Cependant le taux de réponse reste majoritairement inférieur à 25-30% en monothérapie. Des résultats obtenus lors d'une expérience in vivo précédente mettent en évidence cette variabilité interindividuelle chez la souris. L’administration loco-régionale d’agents immunomodulateurs permet la diminution des toxicités, l’augmentation des taux de réponse du fait d’une meilleure pénétration des anticorps au sein de la tumeur et de son microenvironnement. Enfin, la dose efficace en administration locale est d'environ 10 fois inférieure à celle injectée par voie systémique ce qui représente un avantage économique non négligeable. Plusieurs études évaluant l’administration intratumorale d’agents immunomodulateurs (virus oncolytiques, anticorps ou protéines activatrices de l’immunité, inhibiteurs des checkpoint immunitaires) sont en cours avec des résultats attendus dans les mois à venir, et déjà des observations encourageantes rapportées.
Bénéfices attendus
L’administration loco-régionale d’agents immunomodulateurs permet la diminution des toxicités, l’augmentation des taux de réponse du fait d’une meilleure pénétration des anticorps au sein de la tumeur et de son microenvironnement. Enfin, la dose efficace en administration locale est d'environ 10 fois inférieure à celle injectée par voie systémique ce qui représente un avantage non négligeable.
Procédures
Greffes de tumeurs (1 ou 2 par souris, suivant les procédures, durée 15 minutes), injections de médicaments (4 par souris, durée 1-3 minutes), prises de sang (n=3, durée 5-10 minutes). Séances d'imagerie confocale sous anesthésie: 1 par animal, durée de 30 à 120 minutes.
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la présence de tumeurs en sous-cutanée, injections de produits en intra-veineuse et séances d'imagerie sous anesthésie.
Devenir
La mise à mort des animaux greffés et traités permettra de faire des analyses post-mortem sur de nombreux tissus.
Remplacement
Le traitement par immunothérapie implique une interaction forte entre cellules tumorales et cellules immunitaires. Actuellement, il n'est pas possible de traduire complètement la réponse aux immunomodulateurs in vitro. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l'activité de nos formulations chez des souris immunocompétentes et porteuses de tumeurs murines.
Réduction
Pour étudier l'efficacité des différents traitement anti-tumoraux, la croissance tumorale sera suivie après implantation des cellules. Les critères d’analyse de l’activité anti-tumorale seront le pourcentage d’inhibition tumorale à un temps défini, le délai de croissance tumorale comparé au groupe contrôle, le nombre de régression partielle ou complète et le nombre de survivants sans tumeur. Chaque expérimentation reposera sur une randomisation des souris afin d'homogénéiser les groupes et d’éviter l'impact environnemental, s'assurant ainsi de la fiabilité des résultats. Un pourcentage d'inhibition de la croissance tumorale (comparé au control) supérieur à 40% sera considéré comme efficace (risque alpha 0,1-puissance 0,8). Le nombre d'animaux a été déterminé statistiquement.
Raffinement
Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les points limite seront strictement appliqués. Si des signes de stress ou de douleur étaient observés un analgésique sera administré et/ou un enrichissement différent sera ajouté dans la cage.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. D'après notre expérience passée, nous avons pu observer que nos lignées de cellules tumorales murines se développent bien chez la souris et de nombreuses études en immunothérapie ont montré de très bons résultats dans ce modèle. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte correspondant à un développement optimal du système immunitaire.
ADE : La voie de l’adénosine comme nouvelle cible thérapeutique dans les chondrosarcomes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une xénogreffe de chondrosarcome humain sous la peau, puis des injections de traitement et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur indique que les cultures cellulaires ne reproduisent pas le microenvironnement tumoral et affirme vouloir confirmer in vivo des molécules déjà repérées in vitro. Le projet vise à repositionner des médicaments contre ce cancer des os rare.
Objectifs
Les chondrosarcomes sont des tumeurs osseuses rares qui produisent une matrice cartilagineuse. Ces tumeurs touchent principalement les adultes et sont potentiellement fatales. Elles sont considérées comme résistantes à la radiothérapie et aux chimiothérapies conventionnelles. De ce fait, leur traitement a peu évolué au cours des 40 dernières années. Il repose sur la chirurgie et peut conduire à l’amputation d’un membre du patient. De plus, les options thérapeutiques sont limitées si la tumeur est localisée dans des zones sensibles non résecables telles que la tête et le cou ou le pelvis, ou si la tumeur métastase. C’est pourquoi il est nécessaire d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcomes. Nous avons montré in vitro que des molécules ciblant la voie de l’adénosine réduisent la croissance tumorale et induisent la mort par apoptose dans les chondrosarcomes humains. L’objectif de ce projet est d’évaluer les capacités anti-tumorales de quatre de ces molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle hétérotopique de chondrosarcome humain chez la souris immunodéprimée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité anti-tumorale de quatre molécules ciblant la voie de l’adénosine dans un modèle animal de chondrosarcome humain. Ainsi, nous identifierons si le ciblage de la voie de l’adénosine pourrait devenir une nouvelle approche thérapeutique pour le chondrosarcome, un cancer des os chimio- et radio-résistant de pronostic potentiellement sévère. Cette information est cruciale pour le développement clinique de cette thérapie qui pourrait à terme améliorer la prise en charge des patients atteints de chondrosarcome.
Procédures
Les gestes suivants seront réalisés sur l’ensemble des animaux (total 288) : - une implantation de xénogreffe en sous-cutané au niveau du flanc (moins de 2 minutes), sous anesthésie générale et analgésie - une mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse (moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant 12 semaines, sous anesthésie générale - une injection du traitement (la molécule testée ou son véhicule) en intrapéritonéal (moins de 2 minutes), 2 à 4 fois par semaine pendant 12 semaines - un suivi pondéral (pesée, moins de 2 minutes), 2 fois par semaine pendant toute la durée de la procédure (estimée selon notre expérience, à 6 semaines pour le développement tumoral puis 12 semaines de suivi du volume tumoral)
Impact sur les animaux
D’après notre expérience et la littérature, nous ne nous attendons pas à une perte de poids, ni à une gêne lors du déplacement de l’animal, ni à des modifications du comportement, ni à des douleurs spécifiques excepté au moment de l’injection des cellules tumorales. Pour diminuer la douleur, une analgésie sera administrée lors de l’implantation des tumeurs.
Devenir
La procédure est de classe de sévérité modérée, ce qui justifie la mise à mort des animaux à l’issue de la procédure.
Remplacement
Les expériences réalisées in vitro sur des cultures de cellules ne permettent pas de modéliser l’ensemble du micro-environnement cellulaire, connu pour modifier le comportement des cellules et affecter leur réponse aux traitements. C’est pourquoi après avoir mis en évidence in vitro des molécules aux propriétés anti-tumorales, nous souhaitons confirmer ces propriétés in vivo, sur un modèle murin plus proche de la pathologie humaine, afin de faire la preuve de concept de l’efficacité des drogues utilisées en vue de proposer d’éventuels repositionnements de médicaments actuellement utilisés pour le traitement d’autres tumeurs ou maladies.
Réduction
Nous considérons que la molécule testée a un effet anti-tumoral si elle entraine une baisse de volume tumoral d’au moins 20 % en moyenne par rapport au groupe contrôle. Pour cela, le nombre d’animaux par groupe peut être réduit à 12.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux durant toute la durée de la procédure, un suivi individuel et régulier sera effectué afin d’évaluer l’état général des souris. Les implantations de xénogreffes seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les mesures de volume tumoral seront également réalisées sous anesthésie générale. De plus, si la souris présente une perte de poids importante, les traitements seront arrêtés une à deux semaines le temps que les signes cliniques disparaissent. Si les signes cliniques perdurent, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Afin de permettre l’implantation des xénogreffes et le développement tumoral, des souris immunodéprimées (nude) seront utilisées. Les chondrosarcomes humains touchent principalement les adultes. Aussi, d’après notre expérience et les données de la littérature, des souris à un stade adulte seront utilisées.
Le rôle des plaquettes dans la rupture des anévrysmes intracrâniens
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 151 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un anévrysme intracrânien est provoqué par injection d'une molécule dans le cerveau et pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle, jusqu'à la rupture et l'hémorragie cérébrale. Le porteur indique une mortalité attendue lors de la chirurgie et des symptômes neurologiques déclenchant l'euthanasie. Il affirme qu'aucun dispositif ne reproduit tous les paramètres de la maladie et qu'il est "nécessaire" de provoquer chez l'animal une pathologie proche de celle des humains.
Objectifs
Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. Dix anévrysmes sur 100 000 évolueront jusqu'à leur rupture, entrainant des saignements dans le cerveau, ce qui conduit le plus souvent à la mort du patient. De plus en plus d’études suggèrent que l’évolution de l’anévrysme jusqu’à sa rupture n’est pas systématique et qu’elle ferait appel à des mécanismes particuliers. Pourtant, le seul traitement aujourd'hui consiste à retirer l'anévrysme, rompu ou non, lors d'une chirurgie très risquée. Un traitement moins dangereux pourrait être mis au point si les mécanismes impliqués dans la rupture de l'anévrysme étaient identifiés. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'anévrysme intracrânien évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, qui ont un rôle connu dans la coagulation sanguine, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques menant ou non à une rupture. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leurs mécanismes de réponses lors des stades tardifs de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 15 jours chez la souris des anévrysmes rompus. Nous allons l'appliquer à des souris n'ayant pas certaines protéines nécessaires au fonctionnement des plaquettes et étudier si leur absence à un effet positif sur la maladie. Une fois les protéines plaquettaires impliquées dans la maladie identifiées, nous utiliserons des médicaments déjà utilisés chez l'Homme ainsi que des molécules antiplaquettaires en développement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d’identifier des molécules plaquettaires impliquées dans l’évolution de l’anévrysme vers sa rupture. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant l'évolution de l'anévrysme jusqu'à sa rupture chez la souris, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgicale compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrismes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgical : un prélèvement sanguins est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (10 minutes au total). Une procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). L'évolution du comportement plaquettaire durant l'évolution de la pathologie sera suivie par analyse sanguine. Pour analyser ce sang, 2 prélèvements sanguins supplémentaire seront réalisés sur souris anesthésiées. (un prélèvement sanguin = 1 minute)
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie d'injection de molécule dans le cerveau (J0). Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée, 24h); perte de poids postopératoire (modérée, 24h); Stress de contention pendant la mesure de pression artérielle (9 sessions de 15 min). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme :Perte de poids (2g en 24h); Apparition de symptômes neurologiques, hémorragie.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée ou à la fin de la procédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie due au passage de la micropipette dans un vaisseau survienne. Ceci s’exprime par une l’apparition de symptôme neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours et des points limites précoces ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile à l'animal. Du coton est mis à leur dispositon dans leur cage afin qu'ils puissent nidifier.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Homme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absente, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine.
Etude des mécanismes de la fibrillation atriale chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
346 rats vont être utilisés, tués sous anesthésie avant tout réveil, pour prélever le bloc cœur-poumon. Ce prélèvement terminal permet d'étudier les canaux potassiques des veines pulmonaires impliqués dans le déclenchement de la fibrillation auriculaire. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle cellulaire ou in silico de la veine pulmonaire utilisable en remplacement. Il retient le rat parce que ses cellules cardiaques sont bien caractérisées et que ses résultats antérieurs y ont été obtenus.
Objectifs
La fibrillation auriculaire est le trouble du rythme cardiaque le plus fréquemment rencontré en pratique clinique. Son incidence augmente avec l’âge et elle est associée à une diminution de la qualité de vie ainsi qu’à une augmentation de la morbidité (survenue d’accidents vasculaires cérébraux, etc.) et de la mortalité des patients. Les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine de ce trouble du rythme sont encore mal compris et aucun traitement pharmacologique efficace n’existe à ce jour. Les veines pulmonaires (VP) s’abouchent à l’oreillette gauche (OG) et possèdent une couche de cellules cardiaques (cardiomyocytes) spécifique de ces veines. Ce manchon de cardiomyocytes constitue la principale source de foyer d’activités électriques anormales à l’origine du déclenchement de la fibrillation auriculaire. Chez le rat, nous avons montré que l’activation sélective des récepteurs α1-adrénergiques présents dans les cardiomyocytes de VP entraine une perte de la conduction électrique entre les VP et l’OG. Cette perte de conduction est due à une dépolarisation de la membrane des cardiomyocytes de VP, qui conduit à la perte de leur excitabilité. Ce phénomène n’est pas retrouvé dans les cardiomyocytes d’OG. Ainsi, la dépolarisation sélective des cardiomyocytes de VP par une approche pharmacologique pourrait constituer une statégie thérapeutique innovante pour le traitement de la fibrillation auriculaire à un stade précoce de la pathologie. L’utilisation des agonistes des récepteurs α1-adrénergiques en thérapeutique n’est cependant pas envisageable du fait de la répartition ubiquitaire de ces récepteurs dans l’organisme. Au sein du laboratoire, nous avons récemment montré que l’activation des récepteurs α1-adrénergiques bloquait, dans les cardiomyocytes de VP, des courants qui pourraient correspondre aux courants portés par les canaux potassiques TREK qui sont connus pour jouer un rôle important dans le maintien du potentiel de membrane de repos des cardiomyocytes. L’objectif de notre projet est donc de caractériser les canaux TREK au sein des cardiomyocytes de VP, ce qui n’a jamais été réalisé auparavant, ainsi que leur implication dans la perte de la conduction éléctrique induite par l’activation des récepteurs α1-adrénergiques au sein des VP en utilisant l’OG comme contrôle.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus au cours et à l’issu de ce projet devraient nous permettre : 1) D’améliorer à court terme les connaissances fondamentales concernant les mécanismes physiologiques contrôlant l’excitabilité des veines pulmonaires 2) D’améliorer à court terme les connaissances des mécanismes physiopathologiques à l’origine du déclenchement de la fibrillation auriculaire 3) D’identifier à court terme une cible pharmacologique exploitable en thérapeutique pour le développement à plus long terme d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante de la fibrillation auriculaire basée sur le développement d’une nouvelle classe pharmacologique de médicaments.
Procédures
Prélèvement du bloc cœur-poumon sous anesthésie générale ; sur 346 rats maximum ; 1 fois/animal pendant moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Mort de l’animal concomitante aux prélèvements de tissus/d’organes.
Devenir
Le prélèvement du bloc cœur-poumon entraine la fin de vie de l’animal.
Remplacement
Du fait de sa structure comportant plusieurs types cellulaires et de son fonctionnement peu connu, il n’y a pas de modèle cellulaire ou in silico de la veine pulmonaire que nous pouvons utiliser en remplacement des animaux.
Réduction
L’utilisation d’outils statistiques permet de réduire au minimum le nombre d’animaux indispensable à l’obtention de résultats interprétables. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, plusieurs expérimentateurs vont intervenir pour mettre en œuvre différentes techniques expérimentales afin d’utiliser les veines pulmonaires et l’oreillette gauche de chaque animal.
Raffinement
La planification des expériences, la manière de prélever et les appareillages ont été optimisés pour obtenir et utiliser l’ensemble des tissus d’intérêt par rat. Les animaux réceptionnés sont hébérgés à l’animalerie de la faculté de pharmacie dans un milieu enrichi. Nous prévoyons toujours une semaine d’acclimatation pour les stabiliser au point de vue physiologique et comportemental dans leur nouvel environnement et réduire leur stress avant leur utilisation. De plus, nous planifions nos expérimentations de telle sorte qu’un rat ne se retrouve pas seul dans sa cage plus de 24 heures. Le jour de l'expérimentation, les animaux reçoivent anesthésie et analgésie, ils sont étroitement surveillés jusqu'au moment du prélèvement.
Choix des espèces
Les cellules cardiaques sont assez bien caractérisées chez le rat. Il a également été choisi en raison des dimensions des préparations tissulaires adaptées à nos dispositifs expérimentaux. Par ailleurs les résultats des expérimentations précédentes sur lesquelles se base ce projet ont été obtenus chez le rat. Adulte car c’est le stade de maturité et de stabilisation physiologique.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chacun des 6 macaques à longue queue subit une chirurgie de huit heures pour implanter un dispositif de refroidissement localisé de l'hippocampe, deux ventriculographies de trois heures, deux IRM et un scanner, puis 36 séances d'enregistrement de six heures, assis dans une chaise de contention à laquelle il est entraîné pendant au moins un mois. Ces primates sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à la fin, au terme d'une procédure sans réveil, pour analyser les lésions produites dans leur cerveau par le dispositif et le refroidissement. Le but est de mettre au point des algorithmes qui prédisent les crises d'épilepsie et déclenchent le refroidissement, en vue d'un implant humain qui pourrait fonctionner sur batterie. Le résumé ne décrit pas comment les crises sont provoquées : seule la liste des effets mentionne des crises "persistantes légères" 1 à 2 heures "après séance pénicilline", et la liste des séances d'enregistrement parle d'"injection" sans dire laquelle.
Objectifs
L’épilepsie, qui touche 1% de la population, constitue un problème de santé majeur. En dépit de nombreuses avancées thérapeutiques, seules 30% des épilepsies pharmaco-résistantes (celles qui ne répondent pas aux médicaments) sont opérables et cette option n’est envisageable que si le foyer épileptique se situe dans une zone accessible du cerveau Dans les autres cas, une autre approche thérapeutique alternative est l’arrêt des crises d’épilepsie par refroidissement du foyer épileptique. Ce phénomène, connu depuis les années 1930, a été validé chez le rongeur et testé chez le primate à l’aide de dispositifs de refroidissement appliqués à la surface du cerveau. Le présent projet a pour objectif d’appliquer cette technique de refroidissement uniquement au moment qui précède l’arrivée d’une crise épileptique sur un modèle de primate. La technique de refroidissement a l’avantage d’être réversible et d’être une procédure peu invasive, mais elle doit encore être affinée en vue d’une application thérapeutique chez l’homme. A ce jour, aucune étude n'a mis en évidence la possibilité d’utiliser la prédiction des crises d’épilepsie comme déclencheur du traitement en boucle fermée de l’épilepsie pharmaco-résistante. L’objectif scientifique de cette étude est donc de développer les algorithmes de prévision des crises épileptiques pour une administration en boucle fermée du refroidissement localisée. Ces algorithmes seront capables de détecter le risque d’émergence d’une crise d’épilepsie et de l’inhiber en activant un refroidissement localisé de la zone épileptogène.
Bénéfices attendus
A ce jour aucune étude n’a présenté une évidence incontestable que la prédiction où les pronostics des crises épileptiques est possible au-delà de l’occurrence par chance. Les pronostics générés vont produire des périodes de haute ou base probabilité d’occurrence des crises. Nous souhaitons tester l’efficacité des algorithmes via le refroidissement pendant ces périodes de haute probabilité des crises et non pas pendant les périodes de crises réels. L’hypothèse est que les effets du traitement vont être supérieurs s’ils sont appliqués en dehors des crises épileptiques convulsives déjà établies. Les bénéfices directs seront la réduction de la puissance nécessaire pour refroidir et le dosage de la quantité du froid à livrer. Avec une réduction de la quantité d’énergie nécessaire pour produire le froid, le système pourrait finalement être compatible avec une batterie implantable type « pacemaker ». Les rendements actuelles en utilisant une approche continue, ne permettent pas avoir une batterie implante à long terme. L’utilisation du refroidissement représente aussi un avantage considérable sur les systèmes actuels parce que son effet est plus important et rapide que la stimulation électrique. Les algorithmes vont être adaptés pour mieux répondre aux taches des pronostics des crises épileptiques. Ils vont être comparés à l’état de l’art et seront peu gourmands en consommation électrique. Ces algorithmes vont être évalués en utilisant un modèle de primates non humains épileptiques avec la possibilité d’optimiser les algorithmes dans le temps. Le refroidissement du foyer épileptogène est une manière efficace d’arrêter les crises, comme nous sommes en train de le démontrer dans nos études en cours. Ces modèles précliniques permettront de tester facilement l’efficacité des algorithmes pour prédire l’occurrence des crises et l’effet thérapeutique du refroidissement pendant les périodes de haut risque de crises. Les bénéfices attendus sont le développement des algorithmes de prévision des crises utilisables sur des systèmes en boucle fermée et aussi de valider l’hypothèse du départ sur la nécessité de diminuer le refroidissement pour aboutir à l’arrêt des crises.
Procédures
Imagerie par IRM : 2 d’une heure chacune Imagerie par CT scan : 1 d’une heure Ventriculographie : 2 de 3 heures Chirurgie implantation : Implantation de dispositif, durée 8 heures Prélèvements sanguins : pré et post-opératoire soit 2 des prélèvements additionnels seront réalisés si complication infectieuse Séances d’enregistrement par condition :12 injection sans refroidissement, 12 injection refroidissement intermittent « aléatoire », 12 refroidissement en boucle ferme soit 36 au total chacun durant 6 heures.
Impact sur les animaux
• Perte de poids post-opératoire : 7 jours • Douleur transitoire post opératoire : 1 jour • Stress pendant séance d’habituation : jusqu’à l’habituation • Position anormale (dos voûté) : post opératoire immédiat post anesthésie générale • Vocalisation anormale pendant la séance d’enregistrement : jusqu’à l’habituation • Signes neurologiques: parésie post opératoire transitoire : 5-7 jour post opératoire • Crises épileptiques persistantes légères (mâchonnements, salivation, mouvements répétitives de tête) : 1-2 heures après séance pénicilline
Devenir
A la fin des expérimentations et à la suite d’une procédure sans réveil, nous allons euthanasier les animaux et prélever leur cerveau pour analyser le degré de lésion produit par le dispositif refroidissant et le refroidissement en vue d’un passage à un dispositif implantable chez l’homme.
Remplacement
Le remplacement des modèles animaux en générale et des modèles primates en particulier n’est pas possible pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in vitro comme les tranches de tissus cérébrale ne permettent pas de tester un implant préclinique complet qui a pour vocation de préfigurer le futur implant humain. Dans le projet, une partie des éléments de l’implant et certaines expérimentations ont pu être menées in vitro, notamment les tests de biocompatibilité permettant d’éviter l’utilisation d’animaux. Les primates non humains (PNH) sont les modèles idéaux pour tester les dispositifs cliniques pour l’épilepsie pour la similitude existante entre la structure du cerveau humain et celle du PNH. De plus, la génération des états épileptiques et des crises sont similaires aux phénomènes observés chez le patient épileptique
Réduction
Un nombre maximal de 6 primates non humain est estimé dans ce projet pour obtenir des résultats statistiquement fiables et exploitables du fait notamment de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque animal sera son propre contrôle. L’analyse statistique sera effectuée par des tests non paramétriques appariés, afin de mesurer la différence des moyennes avant et après traitement sans présomption initiale d’une distribution normale de la population (précédés par des tests de normalité). Toutefois dans le respect de la règle de « réduction » des 3R, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’au 50% si les résultats obtenus sur les premiers animaux ne sont pas concluants ce qui provoquera l’arrêt des expérimentations ou bien si l’effet est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié des animaux. Tous les efforts seront faits par les expérimentateurs pour réduire le nombre d’animaux mis en expérimentation tout en permettant d’atteindre l’objective scientifique.
Raffinement
L’état clinique des animaux sera régulièrement observé. Dès que l’animal manifestera l’une de ces réactions négatives spécifiques leur surveillance sera renforcée : perte de poids, douleur post opératoire, position anormale, vocalisation anormale, signes neurologiques, crises épileptiques persistantes. La surveillance renforcée consistera à trois observations par jour et pourra s’étendre à un accompagnement continu. Pendant cette mise en observation, le protocole de recherche sera interrompu et un protocole de soins sera mis en place. Le vétérinaire de l’installation sera alerté sans délai afin de décider de la mise en œuvre des traitements médicaux appropriés : 1. Traitement antidouleur dès les premiers signes de douleur 2. Traitement Antiépileptique si nécessaire 3. Anesthésie général pour tout soin, procédure chirurgicale, prise du sang ou imagerie. 4. Soins de la plaie chirurgicale post opératoire et suivi : Si signes d’infection présentes, les soins locaux seront augmentés en fréquence at une thérapeutique antibiotique sera mise en place 5. Entrainement a la chaise de contention pédant au moins 1 mois. L’animal doit rester calmement assis sur la contention pour la durée de la séance. 6. Les primates qui ne reproduiront pas les crises attendues, seront sortis de l’étude par anticipation. Les animaux isolés gardent un contact tactile, visuel et olfactif avec leurs congénéres ; l'enrichissement environnemental est augmenté (plus de jouets, friandises, ....) et les contacts avec les expérimentateurs accrus.
Choix des espèces
L’utilisation de primates non humains (PNH) dans l’étape finale d’évaluation préclinique est nécessaire avant un usage clinique chez l’Homme pour valider la sécurité et l’efficacité du dispositif. En effet, les PNH ont un cerveau semblable à l’Homme aussi bien sur le plan anatomique que fonctionnel (structure cellulaire, communication et connectivité neuronales, capacités cognitives etc…). En effet, un modèle alternatif ex vivo permettant d’obtenir toutes les données biologiques n’existe pas. De plus les PNH peuvent reproduire des crises d’épilepsie pharmaco résistantes similaires aux crises hippocampiques chez le patient. Notre protocole expérimental vise à arrêter les crises en utilisant des moyens implantables, comme dans un futur système clinique. Règlementairement, Le modèle animal peut être à l’origine d’essais expérimentaux nécessaires avant une expérimentation humaine. Les PNH servent donc, bien souvent, de tremplin avant une application chez l’homme. Les dispositifs médicaux implantables font l’objet de procédures d’évaluation rigoureuse avant de recevoir une autorisation de mise sur le marché. Depuis les années 80, dans tous les pays du Monde, sous la pression des politiques et de la société, une procédure, la « nouvelle approche », s’est progressivement imposée, qui codifie très précisément les différentes étapes de l’évaluation, in vitro, chez l’animal et en clinique pour permettre la mise sur le marché. Chacune de ces étapes, chacun des tests requis connaît des limites, mais au final, le système apparaît efficace, le nombre d’accidents étant particulièrement réduit, eu égard au nombre d’utilisation des dispositifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux d’un âge supérieur à 40 mois et un poids de +/- 7-10 kg, afin de pouvoir faciliter la manipulation et l’entrainement comportemental des sujets adultes.
REALISATION DE TESTS DE TOXICITE ANORMALE CHEZ LE RONGEUR
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons d'Inde : 5000
16 250 rongeurs, 11 250 souris et 5 000 cobayes, vont être utilisés, tous tués par inhalation progressive de CO2 en fin de protocole, 10 625 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 625 à un niveau sévère. Chacun reçoit une administration unique d'un médicament par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale, jusqu'à 25 ml par la bouche pour un cobaye, et les souris passent 10 minutes dans une enceinte chauffée à 38 °C avant l'injection intraveineuse. Le porteur écrit qu'il s'attend, avec ce test de "toxicité anormale" imposé par les pharmacopées avant la libération de lots de médicaments, à "prouver l'innocuité du produit". Il affirme que la "mortalité d'un animal ou l'apparition d'un signe clinique sur celui-ci n'est donc pas attendue", tout en prévoyant que, dans l'une des deux procédures, un rongeur qui atteint un point limite ne soit pas mis à mort.
Objectifs
L’objectif de ce test est de détecter une éventuelle toxicité d’un produit pharmaceutique, après son administration aux animaux. Les produits administrés aux animaux sont des produits pharmaceutiques déjà sur le marché ou nouvellement produits. Nous recherchons par ce test une toxicité anormale, c’est-à-dire que nous nous attendons à prouver l’innocuité du produit. A noter que ce test est réalisé en respect des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments à des patients. Le test de toxicité anormale sur rongeurs est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques.
Procédures
-Administration par injection intraveineuse, sur souris uniquement : volume maximum 0,5 ml / souris -Administration par injection intrapéritonéale : volume maximum 1 ml / souris et 5 ml / cobaye. -Administration par voie orale : volume maximum 1 ml / souris et 25 ml / cobaye -Administration sous-cutanée pour les cobayes : volume maximal 10 ml Note : des injections uniques sont prévues dans les deux procédures de ce projet.
Impact sur les animaux
Les tests sont réalisés sur des produits pharmaceutiques fabriqués selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Ce test est à visée libératoire – c’est un test requis pour la mise à disposition de certains médicaments aux patients. La mortalité d’un animal ou l’apparition d’un signe clinique sur celui-ci n’est donc pas attendue sur ce type de test libératoire. Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques (par injection IP, IV, SC ou gavage), -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés par inhalation d’une concentration progressive de CO2 en fin de protocole ou en cas d'atteinte de points limites (sauf pour la procédure 1). La réutilisation des animaux pour un autre test de toxicité anormal n’est pas possible car cela pourrait interférer avec le résultat de ce second test.
Remplacement
Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Il n’existe pas aujourd’hui d’équivalent in vitro au test de toxicité anormale. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM du produit pharmaceutique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal requis par les pharmacopées et les demandes réglementaires (e.g. dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché – AMM). Si l’intervalle de poids requis pour réaliser le test est faible, un animal supplémentaire peut être commandé. Par exemple en cas de retest selon la pharmacopée Russe ; il est demandé l’utilisation de 5 souris pesant entre 19 et 21 grammes le jour de l’injection. La marge de poids étant faible, 1 animal supplémentaire sera commandé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée du protocole Les souris disposent d’un enrichissement de type enviro-dri, spécialement conçue pour améliorer l'activité de construction de nids afin de pouvoir se cacher. Les cobayes disposent d’un enrichissement de type tunnel afin de pouvoir se distraire et se cacher. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. Une observation quotidienne est réalisée : elle consiste à vérifier l’état clinique des animaux, leur alimentation et leur boisson. En cas de point limite observé, l’animal est euthanasié (sauf pour la procédure 1).
Choix des espèces
Le choix des expèces et de leur poids est imposé par les référentiels réglementaires Pharmacopées.