Recherche appliquée

Âgés de deux jours, des souriceaux sont anesthésiés par refroidissement sur la glace, reçoivent dans le cerveau une injection de vecteur viral ou de solution saline, puis retrouvent leur mère au réveil. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau. Le porteur attend des pertes lors des injections et des rejets de portée par les mères, et injecte des souriceaux dont le génotype reste inconnu à ce stade, pour tester une thérapie génique sur une lignée porteuse d'une mutation à l'origine d'une forme familiale sévère de SLA. Le comportement moteur doit révéler l'effet du traitement, avec un minimum de 18 souris pour "le test comportemental", sans que le résumé précise lequel.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par un agent chimique, une bactérie ou des cellules, puis des composés leur sont administrés jusqu'à six semaines, parfois via une minipompe implantée sous la peau, pour évaluer des candidats médicaments contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que les animaux développeront diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" pour une vue globale de la maladie que les modèles in vitro ne donneraient pas.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires une à deux fois par étude. Certains de ces modèles utiliseront des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés pendant 6 semaines maximum. Un prélévement sanguin sera également effectué une fois pendant l'étude pour suivre la pharmacocinétique des composés testés. Une minipompe pourra être implantée en sous cutané pour une administration continue pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

184 souris vont être utilisées, 120 tuées à l'issue et 64 réutilisées ou écartées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues prédiabétiques par un régime riche en graisses, elles subissent des gavages quotidiens pendant quatre semaines et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec coupure de la queue et injections, pour évaluer des bactéries et un métabolite comme futur complément alimentaire. Le porteur indique un stress lié à l'isolement en cage individuelle et aux contentions répétées, et fixe une perte de poids de 20 % comme point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne simule les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.

Objectifs

Des résultats préliminaires obtenus dans notre laboratoire ont mis en évidence un effet anti-hyperglycémiant de souches bactériennes commensales du groupe Streptococcus salivarius inactivées par la chaleur, et d’un métabolite dérivé de la sérine (sécrété par les bactéries et les plantes) dans un modèle murin de prédiabète (définit pas une glycémie à jeun > 1.26g/L) induit par un régime riche en graisse. L’objectif de notre projet est de déterminer les mécanismes par lesquels ces souches bactériennes naturellement présentes dans l’intestin et ce métabolite exercent cet effet anti-hyperglycémiant dans un modèle de souris pré-diabètique . Le prédiabète désigne une glycémie, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang, plus élevée que la normale. Il est réversible s’il est traité avant son évolution vers le diabète qui lui est un état irréversible. Pour ce faire, plusieurs souches bactériennes ainsi que ce métabolite dérivé de la sérine seront administrées à un modèle de souris rendues prédiabétiques via un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L’objectif final de ces recherches est de déterminer si les bactéries commensales étudiées et le métabolite bactérien dérivé de la sérine permettent la réversion du prédiabète c’est à dire de réduire l’intolérance au glucose et l’insulino-résistance induites par des régimes déséquilibrés. Si tel est le cas, ceux-ci pourraient servir de traitements pour prévenir le développement du diabète de type 2 chez l’homme. En effet, ce projet de maturation vise à developper un complément alimentaire, pour l’homme, à partir des bactéries et/ou de ce métabolite.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention régulière nécessaire lors des gavages quotidiens (quelques secondes) sur une période de 4 semaines et au cours des tests de tolérance au glucose et de tolérance à l’insuline. Pour ces deux tests (réalisés deux fois sur chaque animaux) les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes) et à une piqûre (5 secondes) lors de l’injection de l’insuline en intrapéritonéal . Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure 2 avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure et à un stress au cours de la contention nécessaire lors des gavages, des prélèvements et des injections quotidiens sur une période de 4 semaines D’après les résultats préliminaires du laboratoire, le gavage des souris avec ces différents composés tests, n’induit pas de perte de poids ni d’effets négatifs sur les souris. La prise de poids associée au régime riche en graisses et la période de jeune necessaire au test de tolérance oral au glucose (OGTT) et au test de tolérance à l'insuline (ITT) génèreront des stress faibles à modérés.

Devenir

En procédure 1 environ 64 souris non répondeuses au régime seront euthanasiées ou mutualisées et 120 souris seront utilisées pour la procédure 2. A la fin de la procédure 2 les 120 souris seront euthanasiées pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les interactions inter-organes impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données phénotypiques (poids, prise alimentaire) et biologiques obtenues à partir du sang (glycémie), des tissus endocrines (stimulation de la sécrétion d’insuline) et intestinaux (tissus producteurs d’incrétine) ainsi que des organes impliqués dans la régulation de cette homéostasie glucidique (foie et muscle).

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que ce nombre est nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, un bâton à ronger et d'un abri en propylène rouge. Les animaux seront surveillés deux fois par semaine (surveillance visuelle) au moment de la mesure du poids et le prise alimenaire mesurée (par pesée de l’aliment) une fois par semaine. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite. De même des comportements atypiques de type poil hérissé, prostration, absence de toilettage ou léthargie pendant plus de trois jours ou stéréotypie seront également considérés comme des points limite entrainant l’arrêt précoce du protocole sur les animaux concernés et leur euthanasie . Au moment du test de tolérance oral au glucose (OGTT) et du test de tolérance à l'insuline (ITT), les animaux seront placés dans la salle d’expérimentation (differente de celle d’élevage) 1h avant le test afin de limiter le stress dû à un environnement nouveau.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal et ce travail fait suite à des travaux conduits depuis 2018 sur ce modèle. Nous avons choisi de travailler sur des animauxde 8-12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé et car nos données préliminaires ont été réalisées sur des animaux du même âge.

405 poussins vont être utilisés, tous tués entre le 6e et le 34e jour pour prélever leurs caeca, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par voie orale une souche de Salmonella puis un probiotique administré jusqu'à quinze fois sur 34 jours, pour tester une stratégie de réduction de la contamination dans la filière du poulet de chair. Le porteur indique que l'infection reste souvent asymptomatique mais que les inoculations répétées peuvent stresser les animaux. Il présente le projet comme une réponse aux attentes des industriels de l'alimentation animale et qualifie la validation in vivo de "nécessaire" après les essais in vitro.

Objectifs

La salmonellose, représente la deuxième cause d’infection humaine d’origine alimentaire en Europe. Cette infection, est une maladie qui peut être transmise à l’Homme tout au long de la chaine alimentaire, mais plus généralement par le biais d'aliments d'origine animale contaminés. Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. L’objectif principal de ce projet est de réduire la présence de Salmonella, prédominante dans cette filière par l’ajout d’un probiotique comme source de molécules bioactives. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail, l’inhibition du passage de la barrière intestinale de différents sérotypes de Salmonella (S. Typhimurium, S. Senftenberg), a été mis en évidence in vitro. Cet essai permettra de valider les effets bénéfiques obtenus in vitro, en vérifiant en animalerie expérimentale l’effet inhibiteur sur Salmonella de B. fragilis. La réduction du portage de Salmonella sera mesurée au niveau intestinal, au sein des caeca, de sa diffusion dans le sang et par la réponse immunitaire. L’impact de B. fragilis sur le microbiote digestif en présence de Salmonella sera également considéré. Développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage permettra de réduire la charge qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce travail permettra de valider les effets bénéfiques du probiotique B. fragilis observés in vitro sur la colonisation de Salmonella. Ces données sont nécessaires pour l’acquisition de connaissance, et pour le développement d’une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage. Cela permettrait de limiter à terme, l’usage d’antibiotiques en cas de salmonelloses animales, de réduire la charge bactérienne qui arriverait sur la chaine alimentaire, et ainsi répondre aux attentes des industriels de l’alimentation animale et des différents acteurs de la filière avicole dont la priorité est d’assurer l’innocuité de leurs produits auprès des consommateurs. Par ailleurs, cette étude nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo dans l'objectif de réduire le recours à l’expérimentation animale lors de futures études.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation par voie orale de Salmonella spp. et du probiotique B. fragilis. Les prélèvements de caeca et de sang auront lieu après mises à mort des animaux (J6, J13, J20, J27 et J34). Dès la mise en place (J0), 400 poussins tout venant de 1 jour de l’espèce Gallus gallus de souche commerciale de chair (type ROSS PM3), seront inoculés par voie orale avec 100 µL de B. fragilis pour le Lot 1, Lot 4 et Lot 7, et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8. L’inoculation par voie orale, à la pipette, (d’une durée maximale d’une minute par animal) sera réalisée au maximum tous les 2 jours (hors week-end) sur une période de 34 jours, pour un maximum de 15 inoculations. A J0, il y aura aussi une mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vitellines afin de vérifier le statut indemne des animaux en Salmonella. Le lendemain de la mise en place (à J1), tous les animaux seront pesés et les poussins inoculés recevront 100 µL de la suspension de Salmonella adequate (S. Typhimurium ou S. Senftenberg) par voie orale à la pipette, à une dose de 10^5 UFC/ml (Lot 3, Lot 4, Lot 5, Lot 6, Lot 7 et Lot 8) et 100 µL de Tryptone Sel pour le Lot 1 et Lot 2. A partir de J2 jusqu’au J20 le Lot 1, Lot 4 et Lot 7 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que le Lot 2, Lot 3, Lot 5, Lot 6 et Lot 8 recevront 100 µL de Tryptone Sel. A J20 le Lot 1, Lot 2, Lot 4, Lot 5, Lot 7 et Lot 8 recevrons 100 µL de B. fragilis tous les deux jours, tandis que les Lot 3 et Lot 6 recevront 100 µL de Tryptone Sel.

Impact sur les animaux

Les infections à Salmonella chez les volailles passent généralement inaperçues. Principalement asymptomatiques, elles peuvent provoquer parfois une réduction des performances de ponte chez les poules, une perte d’appétit, de la prostration et des diarrhées liquides. Les salmonelles se multiplient dans le tube digestif des oiseaux et peuvent être excrétées en grande quantité dans les déjections. Toutefois, les souches de S. Typhimurium et S. Senftenberg utilisées dans cette étude ont déjà fait l’objet d’essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est pas attendu d’effet indésirable tout au long de cet essai. La souche de B. fragilis utilisée est considéré comme un probiotique. Toutefois, l’apport d’une solution de probiotiques ou de tryptone sel, par voie orale, tous les 2 jours peut conduire à une situation de stress pour les poulets de chair.

Devenir

Les prélèvements de caeca nécessitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente une source importante de salmonellose pour l’Homme. Ainsi, il est nécessaire de contribuer au développement d’un moyen de lutte contre Salmonella dans la filière avicole afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Salmonella. Des essais préliminaires, réalisés in vitro sur des cellules humaines, montrent un effet bénéfique de B. fragilis en inhibant le passage de Salmonella au travers de la muqueuse intestinale. Toutefois, ces essais ont été réalisés en présence de cellules humaines en absence de lignée cellulaire intestinale de poulet disponible. Il est par conséquent necessaire de valider ses résultats lors d’un essai sur le poulet de chair. Cette validation nous permettra de vérifier que les résultats obtenus in vitro sont transposables in vivo afin de réduire par la suite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante des niveaux de colonisation par les bactéries étudiées et de la variabilité du microbiote au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe (8) était nécessaire pour chaque temps donné (5) afin d’assurer la robustesse des tests statistiques. Ainsi, 405 animaux seront nécessaires à cette étude (5 animaux seront utilisés au début de l’étude pour vérifier l’absence de contamination par Salmonella et 400 pour observer l'effet de B. Fragilis sur la contamination par Salmonella).

Raffinement

L’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Bien qu'aucun effet indésirable ne soit attendu au cours de cet essai, les animaux seront observés quotidiennement. Le raffinement des conditions d’hébergement vise à assurer l’inconfort des animaux. Les paramètres d’ambiance utilisés en animaleries sont ceux préconisés pour les élevages de poulets de chair. Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol sur une litière composée de copeaux de bois (qui servira d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). De plus, des alvéoles en carton seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie. Tout au long de l'essai, les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment spécifique à leur âge et leur espèce.

Choix des espèces

Les salmonelloses humaines sont principalement attribuées à la filière avicole. Ce projet à pour pbjectif de développer une stratégie de lutte efficace pour limiter la colonisation des animaux par Salmonella dès l’élevage afin de réduire la charge qui arrive sur la chaine alimentaire. Par conséquent, le poulet de chair est l’espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 34 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre l’effet de l’ajout du probiotique B. fragilis sur la colonisation de Salmonella, la modulation du microbiote et l’influence sur des marqueurs de l’immunité.

848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par exsanguination et perfusion intracardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance elles reçoivent des injections intragastriques, puis subissent une restriction alimentaire ramenant leur poids à 85 % pendant deux mois et des tests d'équilibre, d'attention et de flexibilité comportementale, pour clarifier le rôle des cellules murales dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux. Le porteur reconnaît que la manipulation des nouveau-nés peut provoquer leur cannibalisme par la mère et que la perte de cellules murales peut entraîner lésions cérébrales, troubles moteurs et mort prématurée, tout en qualifiant ces lésions de très bien tolérées. Il affirme ne pas pouvoir substituer au modèle animal une approche in vitro ou informatique.

Objectifs

Les vaisseaux sanguins sont des conduits qui transportent le sang dans l'organisme. Ils sont schématiquement constitués de l'intérieur vers l'extérieur d'une monocouche interne de cellules endothéliales en contact avec le sang et d'une ou plusieurs couches de cellules murales permettant la contraction ou la dilatation du vaisseau. Dans le cerveau, il existe au moins 3 grands types de vaisseaux: les artères/artérioles, les capillaires et les veines. Les cellules endothéliales et les cellules murales présentent des caractéristiques moléculaires, histologiques et fonctionnelles qui différent en fonction du type de vaisseau. Les maladies des petits vaisseaux cérébraux sont définies par la présence de lésions structurales ou fonctionnelles des cellules endothéliales ou des cellules murales. Elles sont responsables chez l'homme d'environ un tiers des accidents vasculaires cérébraux, de lésions de la substance blanche diffuse, de microsaignements, d'une atrophie cérébrale et sont une cause majeure de déclin cognif. IL n'existe à ce jour aucun traitement spécifique pour ces maladies, une des raisons étant que les mécanismes physiopathogéniques de ces maladies sont encore très mal connus. Des données de la littérature suggèrent que la perte des cellules murales joue un rôle important dans le déterminisme de ces maladies mais il existe des données contradictoires quant à l'implication des cellules murales des artères versus celles des capillaires. L'objectif de ce projet est de clarifier l'implication des cellules murales de ces différents types de vaisseaux cérébraux dans les différentes manifestations cliniques des maladies des petits vaisseaux cérébraux chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet de recherche fondamentale permettront de clarifier de façon définitive le rôle respectif de la perte des cellules murales des artères, des capillaires et des veines dans la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. S'il s'avère comme nous le pensons que la perte des cellules murales des artères joue un rôle déterminant dans ces maladies, nos résultats conduiront à une ré-orientation des travaux de recherche dans ce domaine et à l'exploration de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

3 injections intragastriques quotidiennes après la naissance (durée 10 min/injection). Restriction alimentaire visant à réduire le poids à 85% du poids initial d’une durée maximale de 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. Tests de comportement d'une durée de 5 min à 1 heure / jour pendant 2 mois, de l’âge de 4 à 6 mois et de l’âge de 10 à 12 mois. 1 injection intraveineuse 6 heures avant la mise à mort (durée de l'injection 10 min). Mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque (durée 30 min).

Impact sur les animaux

La manipulation des nouveaux nés en vue de la réalisation des injections intragastriques de tamoxifène pourrait conduire au cannibalisme par la mère mais ceci peut être très largement évité en soupoudrant les souriceaux de sciure de la cage après leur manipulation. La perte des cellules murales des vaisseaux peut conduire à des lésions histologiques du cerveau, des troubles moteurs et la mort prématurée de la souris mais dans notre expérience ces lésions sont extraordinairement bien tolérées chez la souris car d'apparition très progressive. La restriction alimentaire pourrait conduire à une perte de poids supérieure à celle souhaitée (environ 85% du poids original) mais pour prévenir celà les souris seront pesées tous les jours.

Devenir

mise à mort par exsanguination et perfusion transcardiaque de fixateurs. La perfusion intracardiaque de fixateurs permet de fixer le cerveau in situ avant son prélèvement et donc de préserver la morphologie des tissus et des vaisseaux du cerveau , ce qui est indispensable dans notre projet.

Remplacement

La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas substituer au modèle animal un modèle in vitro ou computationnel.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Les mêmes animaux seront utilisés pour étudier différents aspects de la symptomatologie des maladies des petits vaisseaux cérébraux. Plus spécifiquement, les mêmes animaux seront utilisés pour examiner l’équilibre et la cognition de l’âge de 2 à 12 mois et la présence de lésions des vaisseaux et du cerveau à 12 mois. Comme il n’est pas recommandé de réaliser chez la même souris 2 tests cognitifs distincts qui requièrent plusieurs semaines d’apprentissage et que les modalités de conservation du cerveau prélevé après la mise à mort pour l’analyse des lésions en histologie et en immunohistochimie sont très différentes de celles requises pour l’étude en IRM qui requière le prélèvement de la tête entière, nous utiliserons une première série d’animaux chez lesquels seront analysés les processus attentionnels et les lésions du cerveau en IRM et une deuxième série d’animaux chez lesquels seront analysés la flexibilité comportementale et les lésions du cerveau en immunohistochimie. De plus, les analyses en histologie et en IRM seront réalisées de façon séquentielle. Nous commencerons pour chaque modèle par l’analyse des souris de 12 mois. L’analyse des souris âgées de 6 mois ne sera effectuée que si nous détectons des lésions à 12 mois ; idem pour les souris âgées de 2 mois qui ne seront analysées que si nous détectons des lésions à 6 mois. Nous ne pouvons pas fournir de calcul de puissance puisque les souris avec les génotypes décrits dans cette saisine n’ont encore jamais été explorées avec les tests proposés dans cette saisine. En revanche, nous avons calculé la taille des échantillons en nous basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes similaires mais avec des souris de génotype différent. 10 Males et 10 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de lésions en histologie ou en IRM. 20 males et 20 femelles par groupe sont suffisants pour détecter la présence de troubles de l’équilibre ou de la cognition.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Les injections intragastriques sont réalisées, entre jour 1 à 3 après la naissance quand l’estomac des souriceaux est facilement identifiable du fait de sa couleur blanchâtre et avant l’apparition de la pigmentation de la peau. La restriction alimentaire, nécessaire pour la réalisation de certains tests du comportement, aura pour objectif d’obtenir une réduction du poids de la souris de 15% par rapport à son poids initial. Elle sera étroitement surveillée par la pesée quotidienne de la souris et l’apport de nourriture sera adapté individuellement afin de maintenir le poids à 85% du poids initial. La durée de la restriction alimentaire n’excédera pas 2 mois et ne sera renouvelée au maximum qu’une fois. Les injections intraveineuses seront réalisées sous analgésie. La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde. Nous veillerons au bienêtre des animaux en mettant en place une grille de score et en utilisant des points limites adaptés, un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé au préalable avec des analgésiques.

Choix des espèces

La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Elles permettront de déléter des populations spécifiques de cellules murales vasculaires. La majorité des animaux utilisés seront des souris jeunes âgées de 2 mois à souris âgées de 12 mois car il est nécessaire de pouvoir analyser la progression des lésions au cours de la maladie. Un nombre limité d'animaux seront analysées à l’âge de 18 jours afin de valider le modèle expérimental.

131 chiens vont être utilisés, dont 81 chiots qui subissent chacun, sur environ 33 semaines, trois ouvertures de l'abdomen par une large incision sous anesthésie générale pour des biopsies intestinales, douze biopsies de peau et huit prises de sang. Dès six semaines d'âge, ces chiots reçoivent de la cacahuète deux fois par semaine pendant sept semaines, par la bouche ou sur une peau dont la couche la plus superficielle est rompue par des calques cutanés, puis une prise orale censée déclencher l'allergie, avec la possibilité, écrit le porteur, d'une éruption, d'un gonflement sous la peau, "voire d'une réaction allergique importante". Environ six mois plus tard vient une sensibilisation par la peau "jusqu'à obtention d'un eczéma", et les 50 chiens adultes subissent la même application d'allergène sur peau fragilisée, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance modéré. Tous restent en vie et sont déclarés réutilisés, certains pouvant aussi "entrer dans un programme d'adoption" selon le porteur, qui cite parmi les bénéfices la possibilité "de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples : 1) Déterminer le rôle et les mécanismes de sensibilisation à travers la peau d’allergènes alimentaires chez le chien. 2) Evaluer la possibilité de rétablissement de la tolérance aux allergènes alimentaires chez les chiens allergiques. 3) Explorer les risques de rupture de la tolérance, induite par contact précoce digestif, par pénétration des allergènes par voie cutanée chez les chiens tolérants. 4) Déterminer si des modifications des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané, sont associées à la sensibilisation à des allergènes alimentaires et à l’allergie alimentaire. 5) Evaluer si la composition des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané est modifiée par la sensibilisation à des allergènes alimentaires ou l’allergie alimentaire, et déterminer si ces modifications sont réversibles. 6) Identifier des biomarqueurs de la sensibilisation à des allergènes, présents dans la couche cornée. 7) Comparer ces résultats avec les mêmes paramètres évalués à partir des modèles expérimentaux de dermatite atopique canine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront, en plus de la connaissance scientifique sur les mécanimes pathogéniques de ces allergies (dermatite atopique et allergie alimentaire), d’en améliorer la prise en charge. En effet, aujourd’hui, l’éviction alimentaire (croquettes hypo / anallergéniques strictes) semble la seule méthode de diagnostic fiable d’allergie alimentaire, qu’elle soit associée à une dermatite atopique ou pas. Nous souhaitons mettre en évidence des biomarqueurs diagnostiques dans le sang et dans la peau (désensibilisation par immunothérapie) qui évitera la lourdeur d’un régime d’éviction alimentaire et de nombreux dosages d’IgE sériques inutiles car non validés et permettront : 1) d’accélerer la démarche diagnostique et donc la prise en charge de cette dermatose, 2) de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses. Ces biomarqueurs pourront églement servir lors du suivi thérapeutique. De plus, le modèle actuel d’allergie alimentaire étudié est un modèle murin, très éloigné de l’Homme. Il serait intéressant de montrer une similarité avec notre modèle d’allergie alimentaire canin car le chien est un modèle plus pertinent, de part la proximité qu’il partage avec l’Homme : environnement, alimentation, pression allergénique.

Procédures

Chez chiots (actes étalés sur une période d’environ 33 semaines) : écouvillons cutanés et prélèvements de selles (à 5 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prises de sang (à 8 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 4 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois), biopsies intestinales (à 3 reprises, avec 2 biopsies à chaque fois, sous anesthésie générale par ouverture de l’abdomen par une incision large, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 heure à chaque fois entre l’induction de l’anesthésie, l’acte chirurgical et le réveil des animaux). Un test cutané explorant la sensibilisation à divers allergènes sera également réalisé (sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 15 minutes). Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines, avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Chez chiens (actes étalés sur une période d’environ 7 semaines) : prises de sang (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prélèvements partie superficielle de la peau (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 2 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois). Application cutanée de l’allergène après rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois).

Impact sur les animaux

Prises de sang au début de la sensibilisation, puis en fin de sensibilisation 42 jours plus tard, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain. Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes). Puis, environ 6 mois plus tard, sensibilisation à travers la peau 2 fois par semaine jusqu’à obtention d’un eczéma lors de la phase de rupture de la tolérance. Biopsies cutanées réalisées par voie sous-cutanée en début de sensibilisation, puis 42 jours plus tard en fin de sensibilisation, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Biopsies intestinales réalisées lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Ces biopsies impliqueront donc une ouverture de l’abdomen par une incision large sous anesthésie générale. La possibilité d’une éruption se manifestant par des plaques rouges au niveau des lèvres, d’un gonflement de zones de tissu sous la peau, voire d’une réaction allergique importante est attendue lors de la phase de déclenchement (administration par voie orale de la cacahuète) et cette réaction sera la preuve de l’allergie alimentaire induite par sensibilisation transcutanée.

Devenir

Après chaque procédure, les animaux seront gardés en vie, car les procédures ne devraient pas impacter l'état de santé des animaux sur le long terme. Le vétérinaire et le directeur d'étude valideront systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation. Certains animaux pourront entrer dans un programme d'adoption, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, des possibilités éventuelles de réutilisation, et de leur comportement. Il n'est pour le moment pas possible d'anticiper le nombre d'animaux qui seront adoptés.

Remplacement

Une première étude in vitro sur peau reconstruite permet de caractériser l’inflammation induite par le contact avec la cacahuète, mais il n’est pas possible de réaliser la phase de déclenchement (qui consiste à administer l’allergène par voie digestive), d’où la nécessité d’utiliser des animaux vivants. Ce projet repose sur l’étude de la voie d’administration de l’allergène et de la comparaison entre l’induction de tolérance digestive versus la sensibilisation par voie transcutanée, qui n’est possible que sur animaux vivants. Enfin, le projet utilise des animaux vivants car il fait intervenir des réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Pour atteindre les objectifs du projet, les résultats seront analysés statistiquement.

Réduction

L’étude repose sur la formation de 9 groupes de chiots. Le nombre de chiots nécessaires pour une puissance statistique satisfaisante est de 81. La comparaison avec des modèles expérimentaux de dermatite atopique se fera sur 50 chiens pour avoir un nombre assez proche de chiots et des résultats interprétables.

Raffinement

Période d’acclimatation systématique de 2 à 3 semaines avant le premier acte technique. Animaux hébergés en groupe et avec des jouets. Des points limites adaptés permettront de sortir un animal de l’étude afin de limiter la douleur à son minimum. Actes techniques réalisés par du personnel formé et habitué à travailler avec les chiens, toujours accompagnés de renforcement positif (calins, croquettes). Présence de vétérinaires et surveillance accrue des animaux lors du déclenchement de l’allergie alimentaire. Pour les chiots, des lampes chauffantes seront installées. Paramètres d’ambiance des salles surveillés avec possibilité de modifier la température, afin d’optimiser le bien-être des chiots. Les chiots seront en présence de leur mère jusqu’au sevrage complet. Biopsies cutanées réalisées sous anesthésie locale et biopsies intestinales réalisées sous anesthésie générale, avec observation quotidienne des sites après interventions et prise en charge de la douleur.

Choix des espèces

Chez le chien, l’allergie alimentaire est souvent évoquée, exceptionnellement confirmée, car surtout mal comprise, en particulier chez les chiens souffrant de dermatite atopique. C’est la seule espèce qui présente une dermatite atopique comparable (sur plans cliniques et pathogéniques) à celle de l’Homme. Ce modèle permettra de vérifier les données obtenues uniquement dans le modèle murin expérimental et permettra d’approfondir les connaissances de la dermatite atopique du chien et d’explorer le rôle des allergènes alimentaires, en particulier la voie de pénétration de l’allergène. Utilisation d’animaux vivants car intervention de réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Le chien est l’espèce cible mais le projet peut, par la suite, servir à l’étude de l’allergie alimentaire chez l’Homme. Le chien est l’espèce idéale pour réaliser un modèle d’allergie alimentaire et de dermatite atopique (de plus, c’est la seule espèce pouvant développer une dermatite atopique de manière spontanée). L’étude s’interesse à une sensibilisation de chiots dès l’âge de 6 semaines pour la comparaison avec l’Homme (les bébés se sensibilisant par voie transcutanée dès la naissance et ayant une diversification alimentaire le plus tôt possible pour induire une tolérance, c’est-à-dire dès 2 mois). Il est donc choisi de commencer à sensibiliser les chiots dès qu’ils commencent une diversification alimentaire et ne se nourrissent plus exclusivement de lait maternel. Ce phénomène se produit à l’âge de 6 semaines chez le chien. Ils seront suivis pendant 2 ans pour la sensibilisation, l’induction de tolérance, la rupture de la tolérance acquise et l’immunothérapie (ce qui renforce le besoin d’animal jeune). Les chiens permettant l’établissement d’un modèle de dermatite atopique seront des jeunes adultes qui seront ainsi comparés aux chiots ayant grandi et pour lesquels l’étape de déclenchement aura eu lieu. Ils présentent, à cet âge, un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée une plaie cutanée qu'on infecte par des bactéries avant de poser un pansement au chitosane, avec un suivi par imagerie sous anesthésie pendant cinq à quatorze jours. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie. Il présente l'étude comme une preuve de concept préalable à des tests sur "gros animal" puis à un essai clinique humain.

Objectifs

Les infections de plaies traumatiques et chirurgicales sont un problème majeur dans le domaine médical. L’émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques est un phénomène inquiétant. La notion de «bon usage » des antibiotiques doit être élargie à la notion de « moindre usage ». Dès lors, il existe un besoin croissant d’utilisation de produits antimicrobiens topiques (application directement sur le site d'infection) pouvant être appliqués sur des plaies potentiellement infectées. Le chitosane est utilisé pour de nombreuses applications médicales et pharmaceutiques. Les préparations de chitosane ont beaucoup attiré l’attention en raison de leurs propriétés biologiques potentiellement bénéfiques. Ces propriétés incluent notamment l'hémostase (la coagulation), l'activité antimicrobienne et la stimulation de la guérison. L'activité antimicrobienne à large spectre du chitosane a suggéré qu'il pourrait être utilisé comme pansement pour plaie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de montrer qu’un pansement guérit une plaie cutanée infectée sans traitement antibiotique : c’est une alternative à la thérapie actuelle, lourde et source de résistance aux antibiotiques. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal et ensuite un essai clinique chez des patients humains.

Procédures

Les souris subiront une intervention chirurgicale sur la peau (création de la plaie + traitement, 30 minutes en tout) puis seront suivies 5 jours (18 souris, 5 suivis) ou jusqu'à 14 jours (24 souris, 8 suivis) par imagerie PhotoImageur. Chaque procédure PhotonImageur dure 5 minutes (les souris seront anesthésiées).

Impact sur les animaux

L’expérimentation implique l'anesthésie, la réalisation de la plaie, l’inoculation des bactéries, la pose du pansement avec une suture, puis la réalisation d’imagerie. L’infection provoquée pourra provoquer des démangeaisons au niveau de la plaie cutanée.

Devenir

Suite à l’euthanasie, la plaie sera observée : - Signes inflammatoires locaux - Présence d’abcès - Taille de la plaie. Une analyse bactériologique et histologique sera réalisée sur chaque plaie avec les tissus adjacents.

Remplacement

En raison des interactions complexes entre l'hôte et l'agent pathogène, les systèmes in vitro ne peuvent pas reproduire fidèlement les conditions d'infection et de guérison des tissus. Il est donc nécessaire de disposer de modèles animaux qui reflètent l'infection des tissus pour évaluer les stratégies d'ingénierie tissulaire.

Réduction

Un suivi par photonimagerie diminue le nombre de souris nécessaires à l’étude en permettant un suivi bactérien longitudinal et en évitant les sacrifices aux temps intermédiaires. L’étude sera réalisée sur 6 souris par groupe et les résultats seront analysés avec les tests statistiques adaptés.

Raffinement

- Un personnel qualifié sera mobilisé autour des animaux avant, après et pendant les interventions. Le chirurgien est chevronné. - Les conditions expérimentales ne provoquent pas de contraintes pouvant affecter le bien-être des animaux : pas de diminution de l’enrichissement ni de la socialisation, accès normal à l’eau et à l’aliment et respect des comportements normaux. L’hébergement est réalisé en cages ventilées individuellement. Elles sont stérilisées par autoclavage. L’enrichissement est adapté. - Des protocoles précis de prémédications, d’analgésie, d’anesthésie et de mise à mort sont mis en place. - Plusieurs points limites éthiques généraux et spécifiques seront suivis tout au long du projet afin d’éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les résultats de cette étude préclinique serviront pour la prise en charge de plaies infectées avec la mise en place d’un nouveau pansement. Cette étude ne peut en effet être réalisée directement chez le patient mais détient un potentiel translationnel car elle est réalisée chez le mammifère. La souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur la cicatrisation de la peau et l’effet de différentes modalités de traitement. La région dorsale sera utilisée pour l’évaluation des pansements pour la réduction des possibilités de grattade par la souris et la facilité d’évaluation quotidienne. L’utilisation des souris permet de répondre à un certain nombre de questions et d’être prédictif des résultats chez l’homme car il tient compte de la biologie tissulaire. En effet, le modèle animal cherche à répliquer l’environnement biologique et la réponse biologique face aux bactéries. Les souris seront âgées de 7 semaines et pèseront environ 20-25gr. Des souris âgées de plus de 6 semaines sont choisies afin qu'elles aient atteint une taille adulte pour diminuer les risques anesthésiques et pour faciliter l'intervention chirurgicale. Toutes les souris auront le même âge pour une meilleur comparaison des résultats mais également pour que la taille de la plaie soit proportionnelle à la taille de la souris.