Recherche appliquée

30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire

Réduction

Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance

300 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intraveineuses déclenchant une colite chronique puis des injections de traitement, la maladie pouvant provoquer douleurs abdominales, isolement et perte de poids. Le porteur indique qu'un score clinique atteignant 8 sur deux jours consécutifs déclenche l'euthanasie, et que des souris sont tuées à différents temps pour analyser la réponse immunitaire. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'animal "indispensable".

Objectifs

De nombreux mécanismes sont impliqués dans l’arrêt du processus inflammatoire engendré par le système immunitaire lors de la reconnaissance d’antigènes qu’ils soient étrangers (pathogènes extérieurs) ou propres à l’organisme (le soi). Les cellules myéloïdes qui sont une population du système immunitaire jouent un rôle très important dans ces mécanismes. Elles permettent pour certaines d’éteindre ce processus inflammatoire en phagocytant les cellules effectrices devenues alors inutiles sans créer d’inflammation elles-mêmes. Lors d’une inflammation chronique, il y a un déséquilibre entre l’activité des cellules effectrices et l’élimination de ces cellules par les cellules myéloïdes. Nous souhaitons examiner le potentiel de molécules sous la forme d’anticorps monoclonaux anti-protéine A ou anti-protéine B ciblant spécifiquement ces cellules myéloïdes à inhiber la réponse inflammatoire, qui diminuent notamment la sécrétion d’IL-12 et augmente la sécrétion d’IL-10 par les macrophages in vitro, et ce dans plusieurs maladies inflammatoires qui ne mettent pas en jeu les mêmes cellules effectrices.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dévaluer le potentiel thérapeutique d'une toute nouvelle molécule ciblant un processus immunitaire découvert récemment. Il sera comparé à des traitements standards dans le but d'évaluer le bénéfice d'une telle stratégie et de bien caractériser les mécanismes mis en jeu dans les phénomènes biologiques liés à l'activité de la molécule.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses (pour induire la pathologie) dans tous les cas, à des injections intrapéritonéales pour les traitements. Il y aura éventuellement des prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. La durée de l'acte en tant que tel ne durera pas plus de 5min et s'étalera sur 3 semaines comme indiqué dans le schéma protocolaire.

Impact sur les animaux

La colite chronique entraîne parfois des douleurs abdominales et un isolement des animaux concernés ainsi qu'une perte de poids. Un score clinique + un score pathologique lié à la colite seront réalisés pour maîtriser au mieux ces paramètres.

Devenir

Les animaux recevant des injections intrapéritonéales ou intraveineuses seront alors remis dans leur cage. A l'issu de certains axes, les animaux seront euthanasiés poru évaluer biologiquement la réponse immunitaire.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.

Réduction

L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur un traitement curatif ou prophylactique. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Enoutre, dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 animaux pour l’ensemble des groupes ainsi que l’ensemble des axes, ce qui permet d'interpréter de manière objective les résultats tout en utilisant un nombre réduit d'animaux.

Raffinement

Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’inflammation observée entre les groupes de souris. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. Seulement dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Adulte-8-10 semaines, car l’inflammation générée par le transfert de cellules pathogéniques est le plus homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

360 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées à l'issue et 312 remises dans un circuit d'élevage. Chaque femelle reçoit une marque électronique dans le muscle dorsal et subit jusqu'à six prélèvements de sang sur dix mois, pour définir le ratio en acides gras de l'alimentation des reproductrices. Le porteur présente l'objectif comme la mise au point d'aliments aquacoles durables sans farine ni huile de poisson, à visée agronomique et commerciale. Il affirme que l'étude portant sur la reproduction ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation.

Objectifs

Le développement durable de l’aquaculture en France, mais aussi dans le monde, pourrait rapidement être remis en question par la disponibilité de plus en plus limitée de la farine et de l'huile de poisson qui sont les ingrédients traditionnels des aliments pour poissons. Les résultats de la recherche dans le domaine de la nutrition des poissons ont permis de fortement diminuer la part de farine et d’huile de poissons dans les aliments aquacoles au profit d’ingrédients végétaux aujourd’hui majoritaires dans les régimes de toutes les espèces aquacoles. Toutefois, des taux de substitution très élevés restent critiques et ont des effets délétères sur la croissance, la robustesse et les performances de reproduction des poissons. L’une des causes repose sur la forte diminution des aliments en acides gras polyinsaturés habituellement apportés par la farine et l’huile de poissons. Il faut donc poursuivre l’effort d’optimisation des apports alimentaires et de l’utilisation des nutriments pour la croissance et la reproduction des poissons pour le développement durable de l’aquaculture. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les ratios optimums en acides gras polyinsaturés dans l’aliment et optimiser des formulations alimentaires pour accroitre la robustesse des génitrices ainsi que la qualité des œufs et des descendants. L’objectif est de créer des aliments plus performants et adaptés aux différents stades physiologiques de la truite reproductrice en restant dans une optique d’aquaculture durable.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acide gras essentiel dans l’aliment à destination des reproductrices de truite arc en ciel pour accroitre leur robustesse, leurs performances de reproduction et la qualité de leurs œufs. Elle permettra d’établir le lien entre la physiologie de la nutrition (stockage, mobilisation et transfert des acides gras, la physiologie de la reproduction (évolution des hormones de reproduction) ainsi que des paramètres liés à la santé de l’animal (eicosanoides) au cours du cycle de vitellogénèse. Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possibles aux besoins nutritionnels des génitrices de truite.

Procédures

Chaque procédure sera réalisée sous anesthésie (MS222). Un pit tag, pour permettre l'indentification individuelle des femelles de truite, sera injecté en début d'expérimentation dans le muscle supérieur dorsal. Des prélèvements de sang seront réalisés une fois tous les 2 mois (6 prélèvements maximum par individu) sur une durée d'expérimentation de 10 mois. La quantité de sang prélevée sera de 2ml sur des femelles adultes d'environ 1kg.

Impact sur les animaux

L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent aux besoins nutritionnels des poissons. Les prises de sang seront réalisées une fois tous les 2 mois sur les animaux. L'injection du pit tag et les prélèvements de sang (2ml) seront réalisés sur des poissons de grandes tailles (environ 1kg) préalablement anesthésiés (MS222). Le pit Tag une fois injectée créera une petite blessure au niveau de la piqure, le poissons devraient cicatriser et récupérer en quelques jours (le taux d'infection avec ce type de procédure reste très faible). La prise de sang ne posera aucun effet indésirable car les vaisseaux sanguins de la truite sont d'accès facile et leur volume sanguin important. La fréquence de prélèvement (une fois tous les 2 mois) ne créera pas non plus d'effets indésirables car la capacité de l'organisme à remplacer le volume sanguin prélevé ne sera pas impactée. Au moment de la ponte, 6 poissons par traitement (total = 48 poissons) seront euthanasiés et des prélèvements de tissus seront réalisés en vue d’analyses biologiques.

Devenir

48 poissons seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour permettre les prélèvements de tissus en vue d'analyses biologiques. Les 312 poissons non mis à mort repartiront dans un circuit classique d'élevage.

Remplacement

L'étude porte sur l'impact d'une stratégie alimentaire sur la reproduction des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.

Réduction

Nous avons prévu une densité optimale d’animaux par bassin permettant d’éviter les comportements agressifs qui peuvent survenir avec un petit groupe de poissons (relation dominant/dominé). Ainsi pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une densité minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et limiter les comportements agressifs. La densité d'élevage utilisée au cours de cette expérimentation correspond à celle préconisée en aquaculture biologique. Nous avons choisi de baser nos analyses biologiques sur du sang pour réduire le nombre de poissons euthanasiés pour des prélèvements biologiques. De plus, nous identifions les femelles par des pit tags pour avoir comme unité statitique un animal et non un bassin, ce qui nécessiterait beaucoup plus d 'animaux mis en élevage. Ceci nous permet ainsi de fortement réduire le nombre d'animaux mis en expérimentation tout en s'assurant d'une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats. En effet, des précedentes études présentant le même schéma expérimental ont permis de valider ce nombre minimal de poisson mis en élevage pour obtenir des résultats statistiques viables. Les animaux après leur reproduction repartiront dans un circuit classique d’élevage.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimisées. Le comportement et les mortalités seront contrôlés 2 fois par jour lors de l’alimentation des animaux. Si une perte de poids anormale ou un comportement atypique étaient observés (comportement de fuite anormal pendant l’alimentation, léthargie, hyperactivité locomotrice, perte d’intégrité physique suite à un cannibalisme ou à des comportements agressifs), les animaux concernés seraient euthanasiés. La personne qui injectera le pit tag et effectuera les prélèvements de sang est familiarisée avec l’espèce animale et la technique choisie. Les animaux seront manipulés avec ménagement et calme. Une faible quantité de sang sera prélevé (2mL sur des animaux de 2kg) ce qui ne provoquera pas d'effets notables sur le volume d'éjection cardiaque ou sur la pression artérielle.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel, espèce de salmonidé, est une espèce d'un grand intérêt agronomique.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses puis un gel associé à une chimiothérapie, avec un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie jusqu'à douze séances, avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme observer rarement l'atteinte d'un point limite et décrit une maladie bien supportée, tout en surveillant la perte de poids qui déclenche une mise à mort sous 24 heures. Sur le remplacement, il indique que les essais in vitro ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme vivant" et conclut à l'impossibilité de se passer de la souris.

Objectifs

La carcinose péritonéale est une situation médicale où le péritoine, qui est l’enveloppe qui entoure les organes de l’abdomen, se trouve recouvert de nodules de tumeur cancéreuse. Cette situation est un processus métastatique qui va conduire au décès du patient. La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés à un gel associé à une chimiothérapie de contact pouvant être appliqué en postopératoire, qui aurait la capacité d’inhiber l’adhésion des cellules cancéreuses disséminées suite à de la résection de la tumeur primitive ou suite à n’importe quelle chirurgie abdominale. L’objectif de cette recherche est d’évaluer l’apport thérapeutique, soit pour une carcinose déjà présente, soit pour éviter (prophylaxie) qu’une carcinose ne se développe, de ce gel thermosensible qui va se gélifier à température de l’animal (il est liquide a température ambiante) et laisser diffuser sur quelques jours la chimiothérapie qui a été incluse avec celui-ci.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale et également l'utilisation de ce gel en prévention, donc avant l'apparition de la carcinose péritonéale.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée deux heure après à une injection en intrapéritonéale également de gel associé à une chimiothérapie (1 fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale après une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses murines ovarienne ou colique. Nous avons une bonne expérience de nos modèles. Il est très rare d’observer une souris qui atteint un point limite. Les souris supportent très bien la maladie et la fin de l’expérience arrive avant que la maladie ne se développe de trop. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les points limites observés sont souvent corrélés ensemble avec une perte de poids de l’animal. Si cela devait se produire, l’animal serait mis à mort dans les 24h. Aussi, nous devons confirmer si ce gel pourrait induire une toxicité. Aussi, les doses de chimiothérapie ne seront pas toxiques non plus; la chimiothérapie étant au contact du gel.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus sains pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (gel) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 3 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane à 1%) et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie (Buprénorphine - 0,1mg/kg) et seront ensuite sous anesthésie générale (isoflurane à 3%). Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

90 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du foie humain sont greffées sous leur peau, puis elles reçoivent jusqu'à vingt injections d'anticorps sur dix semaines, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs. Le porteur décrit des ulcérations cutanées possibles aux sites de greffe et d'injection, et un anticorps pouvant endommager des tissus sains. Il indique avoir mené des essais in vitro préalables mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester différents anticorps dirigés contre une protéine localisée sur la membrane des cellules qui a été clairement montré comme participant au développement de différents cancers, notamment le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier au monde. Depuis une dizaine d’année nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette protéine membranaire. Nous avons montré que cet anticorps conduit à une inhibition partielle de la croissance tumorale de cellules cancéreuses humaines transplantées dans des souris très immunodéficientes. Nous avons ainsi montré que l’anticorps ralentit la croissance de la tumeur. Récemment, nous avons développé un panel de différents anticorps reconnaissant cette protéine membranaire. Ainsi, afin d’explorer et d’exploiter pleinement le potentiel thérapeutique de ces anticorps, nous souhaitons tester leur efficacité dans un modèle de souris immunodéficientes afin de déterminer lequel présente l’effet le plus prononcé sur la croissance tumorale. Cette étude nous permettra ainsi de déterminer quelle forme d’anticorps est la plus optimale pour un développement clinique ultérieur.

Bénéfices attendus

Ce projet doit nous permettre d’évaluer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour le traitement du cancer du foie afin de profiter aux patients atteints de ce type de cancer pour lequel les options thérapeutiques sont actuellement très limitées, voire inexistantes.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Une injection unique, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines, réalisée sous anesthésie générale gazeuse, temps nécessaire environ 5 minutes par animal anesthésie comprise. -Une injection bi-hebdomadaire d’anticorps sur animaux vigiles pendant maximum 10 semaines, soit un maximum de 20 injections. Temps nécessaire pour chaque injection environ 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. De même, les injections répétées d’anticorps peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Un de nos anticorps peut de se fixer à la protéine membranaire de la souris, ce qui pourrait éventuellement induire des dommages au tissus sains exprimant normalement cette protéine et entrainer une dégradation de l’état général des animaux.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tumeurs qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, les tailles d’effectifs ont été déterminée à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont des modèles reconnus dans la communauté scientifique pour la greffe sous cutanée de lignées cancéreuses humaines afin de tester rapidement la pertinence d’une approche thérapeutique. La souche immunodéficiente choisie possède néanmoins certaines cellules capables d’améliorer l’effet thérapeutique des anticorps. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin que ces cellules en question soient matures. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

312 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent spontanément des polypes intestinaux pouvant évoluer en prolapsus rectal, et reçoivent des injections d'anticorps deux fois par semaine pendant six semaines, avant d'être tuées pour compter les tumeurs. Le porteur indique renoncer à toute analgésie au motif qu'elle "risquerait de modifier la réponse" au traitement et ne traiterait pas le prolapsus. Il décrit ce modèle comme "indispensable" car proche de la physiopathologie humaine.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche d’un traitement contre le cancer colorectal. Il existe aujourd’hui de nouvelles solutions thérapeutiques mais malheureusement dans le cas du cancer colorectal notamment, ces traitements ont des effets limités. Nous voudrions tester si une combinaison avec notre anticorps pourrait améliorer la réponse à ces nouveaux traitements. Nous utiliserons comme modèle une souris transgènique qui a la particularité de développer des tumeurs intestinales à un âge précoce, ce qui permet d’étudier l’effet du traitement sur un modèle proche de la physiopathologie humaine. L’objectif est donc de tester l’effet de notre anticorps en combinaison avec un autre anticorps sur le nombre et la taille des tumeurs qui se développent au niveau de l’intestin chez ces souris.

Bénéfices attendus

Nous attendons un effet synergique de la combinaison sur le développement des polypes et/ou la progression tumorale. Cela sera determiné par un comptage des polypes et/ou lésions tumorale après sacrifice des animaux. Ces résultats nous permettront d'avancer sur notre stratégie de combinaison de notre anticorps avec d'autres traitements afin d'améliorer les effets thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par injection péritonéale deux fois par semaine pendant 6 semaines.L’injection sera faite du côté droit de l’abdomen à l’aide de seringues 29G. La durée de l'injection est de 15 à 20 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le modèle APC∆14 induit le développement de polypes intestinaux pouvant induire des prolapsus rectaux chez les animaux à un stade tardif. Notre traitement anticorps n’a, quant à lui, pas d’effet indésirable attendu et le mode d’injection intra-péritonéale n’est pas connu pour induire des douleurs autres que légères.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin du traitement pour pouvoir prélever leurs intestins et procéder au comptage des polypes et/ou tumeurs qui se seront développés. Nous n’avons pas d’autre moyen que de les sacrifier pour répondre à l’objectif initial.

Remplacement

L’étude chez la souris APCΔ14 est indispensable car elle développe des polypes évoluant en tumeurs malignes intestinales de manière spontanée. Cela permet d’étudier l’effet du traitement dans un modèle physiologiquement plus relevant car immunocompétent et à un stade précoce du développement tumoral.

Réduction

Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux et d’utiliser au maximum les portées obtenues par les croisements. Le nombre d’animaux par groupe a été établi à 12. Ce nombre, qui a été défini de manière statistique, tient compte de la variabilité du modèle qui est minime et du fait que nos résultats préliminaires ont montré un effet du traitement seul.

Raffinement

L’angoisse des animaux sera réduite par l’apport d’un enrichissement sous forme de papier et coton qu’ils pourront utiliser pour se faire un nid, et par le fait qu’ils cohabiteront par groupe de 5. Le degré de souffrance est estimé comme léger car le traitement est sous forme d’injection intra-péritonéale et le traitement en lui-même n’a pour le moment jamais montré d’effet secondaire. L’analgésie ne peut être utilisée car elle risquerait de modifier la réponse à notre traitement, de plus elle ne permettrait pas de traiter le prolapsus qui est le risque majeur de ce modèle. En cas de signes de douleur, les souris seront euthanasiées par asphyxie au CO2

Choix des espèces

L’objectif est d’étudier l’effet de la combinaison de deux anticorps sur le développement tumoral. L’étude chez la souris APCΔ14 est indispensable car elle développe des polypes évoluant en tumeurs malignes intestinales de manière spontanée. Cela permet d’étudier l’effet du traitement dans un modèle physiologiquement plus relevant car immunocompétent et à un stade précoce du développement tumoral. Les animaux seront utilisés à deux stades. Le premier stade est à 5 semaines de vie lors de l’apparition des premiers polypes. Le deuxième stade est à 12 semaines de vie lorsque les polypes sont installés et commencent à se développer en tumeurs malignes. Ces deux stades sont importants pour étudier l’efficacité de notre combinaison sur l’initiation des polypes et/ou le développement tumoral.

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du côlon humain sont greffées dans leur caecum par chirurgie, puis la tumeur est suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à trois mois, 266 souris recevant en plus douze injections d'inhibiteurs dans la queue. Le porteur décrit des atteintes digestives et un amaigrissement liés au développement tumoral, et vise à valider les canaux sodiques NaV comme cible thérapeutique. Il affirme que la complexité multicellulaire du cancer ne pouvant pas être étudiée in vitro, le recours aux souris est "indispensable".

Objectifs

Il a été montré l’expression aberrante des canaux sodiques dépendants du voltage NaV dans les cellules cancéreuses et leur implication dans la progression des cancers. Ces canaux sont anormalement exprimés dans les biopsies humaines de carcinomes, et dans des cellules cancéreuses non-excitables de différentes origines épithéliales. C’est le cas de NaV1.5 qui est anormalement exprimé dans le cancer du sein et dans le cancer sporadique du côlon, et dont le niveau d’expression semble associé à un mauvais pronostic chez les patients. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. Quant à NaVBeta4, son niveau d’expression est réduit dans les tissus cancéreux coliques en comparaison des tissus non-cancéreux appariés. L’inhibition de l’expression de NaVBeta4 dans les cellules cancéreuses coliques SW60 et HCT116 augmente l’invasivité cellulaire in vitro. L'hypothèse de notre client est que les canaux NaV1.5, qui peuvent être inhibés par des composés pharmacologiques existants ou en cours de développement, pourraient représenter des cibles pour des nouvelles thérapies anticancéreuses. Pour valider cette hypothèse, il est important d’utiliser un modèle orthotopique de cancer colique qui consistera à greffer au niveau du caecum de souris, des cellules cancéreuses coliques humaines (HCT-116 ou SW620) bioluminescentes. Les souris que nous utiliserons seront donc des souris immunodéficientes, à phénotype dommageable, qui seront hébergées en portoir ventilé dans des conditions n'entraînant pas l'expression du phénotype.

Bénéfices attendus

La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse.

Procédures

482 souris auront des greffes de cellules tumorales au niveau du caecum (procédures 1, 2, 3, 4) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirurgie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 482 souris auront une imagerie de bioluminescence 1 fois par semaine à partir du 7ème jour post greffe sous anesthésie gazeuse Isoflurane 2% dans l’air avec injection vigile 4 minutes avant l’examen de 100µL de luciférine par voie intrapéritoléale pour le suivi de la prolifération tumorale. En parallèle une échographie sera réalisée 1 fois par semaine ou toutes les 2-3 semaines en fonction de la vitesse de prolifération des tumeurs. Ces 2 examens successifs ont chacun une durée inférieure à 10min et seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% dans l'air), sur support chauffé à 37°C. Par ailleurs, un monitoring cardio respiratoire est réalisé simultanément en cours d’échographie qui permet de s’assurer que l’animal supporte bien l’examen. Soit sur une durée de 3 mois (temps maximal de l’étude) chaque souris aura 11 séances d’imagerie de bioluminescence et 11 séances d’imagerie échographique au maximum. 266 souris vigiles (procédures 2, 3 et 4) recevront 3 fois/semaine pendant 4 semaines (= 12 injections par souris) 150-200μLd’inhibiteurs par voie intraveineuse au niveau de la queue.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus pour les animaux sont liés au développement d'une tumeur primaire au niveau du colon et éventuellement de métastases (problèmes digestifs, amaigrissement).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chque procédure.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres complexes, multicellulaires et multiorganes, ne pouvant pas être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études pharmacologiques sur animaux sont nécessaires. Les expérimentations pourront mettre en évidence un nouvel acteur du développement métastatique, les canaux NaV, qui pourraient servir de nouveau marqueur prédictif et éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer colique.

Réduction

La mise en oeuvre de l'imagerie permet un suivi longitudinal du même animal ce qui permet de réduire leur nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale primaire et secondaire (métastases) sera réalisé par imagerie de bioluminescence in vivo et d’échographie, approches non invasives et indolores pratiquées par ailleurs sur animal anesthésié. Des antalgiques seront utilisés lors de la chirurgie et 24h après. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé et en accord avec les directives européennes. des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel observera quotidiennement les animaux afin d'anticiper la souffrance animale.

Choix des espèces

Dans notre projet, les informations attendues ne peuvent pas être obtenues in vitro car à ce jour l'animal de laboratoire reste le seul recours permettant d'étudier le développement tumoral et l'efficacité thérapeutique en tenant compte de la complexité de la physiologie d'un organisme vivant. La souris est un animal chez qui il est possible d'obtenir le développement de tumeurs d'origine murine et humaine. La souris est ainsi une espèce animale classiquement utilisée, pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), de par la possibilité d’avoir accès à des animaux immunodéprimés permettant l’implantation de cellules cancéreuses humaines, ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo (bioluminescence, échographie). Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris adulte (6 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, nous avons rencontré des difficultés pour implanter des cellules tumorales humaines avec un taux de prise de greffe moins important.