Recherche appliquée

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles subissent des échocardiographies sous anesthésie et des tests d'effort sur tapis roulant, avant prélèvement terminal du coeur. Le porteur indique un déficit de poids dès la naissance et des points limites déclenchant la mise à mort en cas d'anomalie cardiaque. Cette caractérisation prépare un futur projet de test de candidats médicaments.

Objectifs

Dans cette Demande d'Autorisation de Projet, nous voulons caractériser finement le modèle souris du Syndrome de Barth en terme de suivi de poids, d'endurance, et de fonctionnement mitochondrial et cardiaque. Cette caractérisation permettra de mettre en avant des défauts du modèle souris qui serviront dans une future demande d'Autorisation de Projet où nous testerons la capacicté de candidats médicaments à supprmier ces défauts (dans l'optique de proposer un médicaments à des patients atteints du syndrome de Barth). Ce projet est conçu pour permettre le déroulement des procédures expérimentales de tests de composés médicaments, à suivre, dans les conditions les plus respectueuses de l’animal et de l’environnement.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome de Barth, dans nos animaleries afin de vérifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. La caractérisation du modèle souris au niveau du poids, du comportement, de la force musculaire ainsi que les analyses sur échantillons d'urine, de sang et d'organes seront réalisées dans une Demande d'Autorisation de Projet en cours. La présente demande d'Autorisation de Projet permet d'aller plus loin dans la caracterisation du modèle souris en réalisant échocardiogrammes et tests d'effort et d'endurance sur des appareillages uniquement présents dans une autre animalerie que celle où sont produits les animaux.

Procédures

pas de procédures chirurgicales sur animaux vivants. - échocardiographies - tests d'endurance sur tapis roulant - prélèvements terminaux du coeur sur animaux sacrifiés

Impact sur les animaux

Les caractéristiques du phénotype dommageable décrites par nos collaborateurs sont les suivantes : poids inférieur de 20 à 25% dès la naissance, défaut au niveau des ventricules cardiaques (plus fins : fonctions diastolique et systolique réduites), défaut au niveau de la morphologie des mitochondries (augmentation de la taille, baisse dans la densité des crêtes). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse échographique nécesite une analyse sous anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données échographiques. Le suivi des performances sur tapis de course teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux en fin de cinétique pour prélèvements terminaux du coeur. Afin d'utiliser au maximum tous les animaux, des prélèvements de coeurs seront effectués pour des analyses qui permettent d'évaluer l'état et le fonctionnement des mitochondries de coeurs. Si des défauts sont mis en avant chez la souris modèle du syndrome de Barth par rapport à la souris sauvage, nous pourrons par la suite, dans une prochaine demande d'Autorisation de Projet, tester la capacité des candidats médicaments à supprimer ces défauts.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés dans toutes les expérimentations de la procédure . Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés. Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 12 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 25% d’animaux en plus, soit 15 souris par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel compétent grâce à la grille de score des points limites. Le poids sera suivi 2 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48h aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des mutants est inférieur de 20 à 30% dès la naissance : si on dépasse les 25% d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. Les animaux seront élevés jusqu'au sevrage dans l'animalerie de production puis envoyés à l'animalerie où se feront les expérimentations de la présente DAP juste après le sevrage et utilisés durant 6 semaines. En effet le déficit de poids se voit normalement dès la naissance, il est donc intéréssant de corréler ce déficit avec d'autres phénotypes délétères (fonctions cardiaques et test à l'effort/endurance). Avant d'utiliser les animaux nous attendons qu'ils soeint sevrés.

6 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs veines saphènes sont traitées sous anesthésie par six techniques utilisées contre les varices humaines, avec un suivi échographique jusqu'à 28 ou 56 jours, avant mise à mort pour analyse des veines. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu car la sécurité est déjà validée chez l'humain, et surveille malgré tout hématomes, brûlures et nécroses. Il décrit le mouton comme le "modèle de référence" pour évaluer les traitements vasculaires.

Objectifs

Les varices sont des manifestations de la maladie veineuse chronique et leur prévalence est estimée à 25%. Elles sont liées à une perte d'élasticité des parois veineuses et à leur élargissement, ou à des lésions des valvules veineuses qui ne fonctionnent plus correctement. Plusieurs techniques sures et efficaces sont disponibles mais les mécanismes d’actions locales sur la paroi veineuse n’ont été que très peu analysés. L’objectif du projet est d’étudier six techniques existantes afin d’identifier les mécanismes d'action et les réactions inflammatoires locales.

Bénéfices attendus

Les varices sont des manifestations de la maladie veineuse chronique et leur prévalence est estimée à 25%. Les complications si les varices ne sont pas traitées sont des ulcères veineux. Le coût du traitement des ulcères veineux de jambe est très élevé ; le traitement des varices peut réduire l’incidence des ulcères de jambe de 50%, est il est donc très interessant d'un point de vue médiccal, économique et sociétal. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives les varices. Cette étude permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces différentes techniques existantes des traitements de varice et aidera à terme le praticien à choisir la technique la plus adaptée en fonction du type de patient à traiter et de limiter les risques de récidives.

Procédures

Les veines saphènes, des brebis, seront traitées par différentes techniques utilisées chez l’homme pour le traitement des varices (Radiofréquence, laser 980 nm ou 1940 nm, clarivein, veinaseal, mousse fibroveine) . Le jour du traitement, la zone à traiter sera marquée et des mesures seront effectuées par échographie. Le traitement se fera sous anesthésie et dure environ 20 minutes par veine saphène. Un suivi échographique aura ensuite lieu 7 jours, 14 jours puis 28 jours après le traitement. Si nécessaire, les animaux seront sédatés pour cet examen. Au bout de 28 jours, 3 brebis seront mises à mort après prélèvement de leurs veines saphènes traitées sous anesthésie générale dans le but de faire une analyse anatomopathologique. Les 3 dernières brebis auront une nouvelle échographie 56 jours après le traitement avant d’être aussi mises à mort après prélèvement de leurs veines saphènes traitées sous anesthésie générale dans le but de faire une analyse anatomopathologique. Pendant la première semaine post-traitement la zone traitée sera inspectée quotidiennement afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.

Impact sur les animaux

Le traitement se fera sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendue. A l'issu du traitement, aucun effet indésirable n’est attendu car la sécurité de la procédure est déjà largement validée chez l’homme. Les points à surveiller seront la réaction de la peau dans la zone de traitement : hématome au point de ponction, matting de la peau (cordon marron le long du trajet de la veine), brûlure, nécrose.

Devenir

Les six brebis du projet seront mises à mort à la fin de l'étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est le modèle de référence pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires.

Réduction

Le traitement sera appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons de veines saphènes. Un minimum de 6 brebis est nécessaire (soit 12 veines saphènes) pour évaluer les 6 traitements avec des prélèvements des veines saphènes à deux temps (J28 et J56).

Raffinement

Les brebis arriveront sur place au minimum une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer au lieu et ainsi de diminuer leur stress. Les ovins étant des animaux grégaires, les brebis seront logées en groupe, sur une litière de paille afin de les occuper et auront accès à de l'eau et du foin ad libitum pour respecter leur fonctionnement de ruminants. De plus, le personnel animalier observera régulièrement le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. Durant le traitement, les brebis seront placées sous anesthésie générale avec une association médicamenteuse permettant d’obtenir un effet anesthésique et analgésique. Afin d’éviter le dessèchement de leur cornée, une pommade ophtalmique est appliquée dans leurs yeux. Enfin, durant les examens angiologique, si les animaux présentent des signes de stress ou d’agitation, ils sont sédatés ou anesthésiés selon l'avis du vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est recommandé comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme (diamètre et profondeur des veines saphènes) et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme. De plus, certains animaux étant gardés plus de deux mois, il n'est pas possible d'utiliser des animaux en croissance..

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une irradiation localisée du côlon à dose unique pour provoquer des lésions tardives, puis sont tuées afin de prélever le côlon. Le porteur indique une dépilation de l'abdomen et affirme qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier ces séquelles des radiothérapies pelviennes.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers. L’objectif des médecins est la recherche d’un compromis entre le contrôle des tumeurs et la limitation des dommages aux tissus sains autour de la tumeur. En effet, dans le cas du traitement des cancers en zone abdominale, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon ou le rectum qui sont des « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement de leur épithélium muqueux. La toxicité induite par la radiothérapie du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, et donc impacter fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Le nombre de patients survivants au traitement d’un premier cancer et leur durée de vie augmentent grâce aux progrès de la médecine. L’augmentation de cette survie est associée à une augmentation du risque de complications. Une prise en charge globale du traitement du cancer intégrant le suivi des patients à long terme (> 20ans) est donc indispensable. De plus, réduire les risques de séquelles du traitement du cancer dans sa globalité et améliorer la qualité de vie des patients est un objectif du troisième plan cancer. À ce jour, la complexité physiopathologique de la PRD encore mal décrite, associée au contexte septique intestinal, limite l’efficacité des thérapies disponibles ainsi que la mise en place de nouvelles thérapies efficaces et pérennes. Les options thérapeutiques disponibles pour le traitement des complications des radiothérapies sont insuffisantes. Ce projet, utilisant des techniques d’exploration innovantes, permettra d’améliorer les connaissances sur l’effet des irradiations sur le tissu colique et de déterminer des nouvelles voies de traitement.

Procédures

Les souris seront anesthésiées à l’isoflurane pour la réalisation de l’irradiation localisée (max 20 min)

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du colon à la dose unique de 26 Gy, les souris vont avoir une dépilation au niveau de l’abdomen (zone irradiée). A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Les animaux sont observés tous les jours. Les animaux présentant une perte de poids trop importante seront euthanasiés

Devenir

Les animaux seront euthanasiés, les colons seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vaisseaux, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaire (Cytométrie en flux, single cell, culture et co-culture) et moléculaires des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues : utilisation de la dose de 26 Gy qui ne génère pas d’ulcères tardifs graves du colon mais de la fibrose comme les patients qui ont bénéficié d’une radiothérapie fractionnée. - Hébergement en groupe (5 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) -Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration) - Les animaux seront pesés régulièrement.

Choix des espèces

Le modèle d’irradiation de la souris permet de reproduire des lésions colorectales similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (8 semaines).

104 cochons vont être utilisés, 26 truies et 78 porcelets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les animaux étant gardés vivants dans l'élevage expérimental à l'issue. Les truies subissent des prises de sang au lasso nasal, des collectes de fèces après stimulation anale et des traites précédées d'une injection d'ocytocine, les porcelets étant séparés de leur mère quarante minutes avant chaque prélèvement. Le projet décrit les oligosaccharides du lait de truie pour la filière porcine, avec l'objectif affiché de réduire les troubles digestifs des porcelets au sevrage. Le porteur reconnaît la contention comme stressante et affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour des animaux de ce poids.

Objectifs

Les oligosaccharides sont des composés du colostrum et du lait, présentant une grande diversité de structure, non digérés par les jeunes mammifères mais utilisés par les bactéries intestinales. Dans l’espèce humaine, ils auraient des effets bénéfiques sur le microbiote intestinal des bébés (effet prébiotique), contre des pathogènes, bactéries, virus et parasites (effet anti-adhésion) et sur l’activité des cellules intestinales épithéliales et immunitaires. Leurs effets dépendraient de leur structure. Chez les animaux d’élevage, cependant, leurs bénéfices sont peu ou pas connus. En élevage porcin, les porcelets sont très susceptibles aux troubles digestifs (diarrhées notamment), qui sont généralement traités par des antibiotiques. Dans l’enjeu de démédication des élevages et d’amélioration du bien-être des animaux, il est impératif de développer des stratégies préventives qui permettent d’améliorer la santé des porcelets. Dans ce contexte, le projet vise d’abord à décrire les oligosaccharides du lait de truie et leur diversité de structure et ensuite à étudier les liens entre ces profils en oligosaccharides du lait et le microbiote intestinal et la santé des porcelets.

Bénéfices attendus

A court terme, les données sur les oligosaccharides du lait de truie, quantité et diversité de structure, alimenteront une base de données multiespèce qui sera mise à disposition dans un répertoire public. Le projet apportera aussi des connaissances nouvelles sur le lien entre les profils d’oligosaccharides et la santé intestinale des porcelets allaités. A plus long terme, ces connaissances permettront de tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets, en étudiant les effets d’oligosaccharides spécifiquement identifiés comme potentiellement bénéfiques. Nous fournirons ainsi des pistes à la filière porcine pour développer un aliment premier âge pour porcelet allaité qui serait enrichi en oligosaccharides bénéfiques, aliment qui permettrait de réduire les problèmes digestifs des porcelets au sevrage, une phase critique en élevage.

Procédures

Les truies seront soumises à une prise de sang (à 109 jours de gestation), une collecte de fèces (à 6 jours de lactation), une collecte de colostrum à la mise bas et 3 collectes de lait à 6, 20 et 27 jours de lactation. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Si une stimulation anale légère est nécessaire pour stimuler la défécation, celle-ci ne dure pas plus d’une minute. La traite pour collecter le colostrum et le lait dure entre 5 et 15 minutes. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes et celle de la collecte de fèces est limitée à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La prise de sang par ponction dans la veine jugulaire nécessite de tenir la truie au lasso nasal afin qu’elle soit la plus rapide et la moins douloureuse possible. La durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. Cette contention, même brève, est stressante pour la truie. A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative approuvée et utilisable de manière systématique sur des animaux de cet âge, de ce poids et de cette force. Les truies sont récompensées par un morceau de pomme à l’issue de la procédure. La collecte de fèces est réalisée à la défécation naturelle ou après stimulation anale légère, donc sans stress ni douleur. La collecte de colostrum n’entraine pas de douleur et tout au plus une gêne de la truie à l’approche des expérimentateurs. Par contre, chaque prélèvement de lait nécessite de séparer les porcelets de leur mère pendant 40 minutes avant le prélèvement. Les porcelets sont alors placés dans une caisse placée à proximité de leur mère afin de réduire le stress engendré chez les porcelets et la truie. Cette séparation est requise pour que le lait s'accumule dans la mamelle, elle facilite la traite. Les porcelets sont remis avec leur mère dès la fin du prélèvement. Le prélèvement de lait nécessite aussi une injection préalable d’ocytocine en intramusculaire afin d’induire l’éjection du lait, engendrant la douleur de la piqure. Les porcelets seront soumis à 3 prises de sang et 3 collectes de fèces à 6, 20 et 27 jours d’âge. La prise de sang est faite dans la veine jugulaire avec un dispositif de type Vacutainer en maintenant les porcelets immobilisés en décubitus dorsal. L’immobilisation ne dépasse pas 5 minutes et la durée de la prise de sang est limitée à 2 minutes. La collecte de fèces est réalisée sur des porcelets allaités. Le lait étant très digestible, l'obtention de quelques grammes de fèces peut être difficile, notamment à 6 et 20 jours d’âge. Elle nécessite de tenir le porcelet et de faire une stimulation anale avec un thermomètre tout en appuyant sur l’abdomen. Mais cette étape ne sera pas nécessaire pour tous les porcelets car la collecte se fait au moment de la prise de sang qui favorise la défécation. La durée de contention de chaque porcelet est limitée à 5 minutes.

Devenir

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Truies et porcelets poursuivent leur carrière dans l'élevage expérimental.

Remplacement

Les deux objectifs du projet sont de décrire les profils en oligosaccharides du colostrum et du lait de truie et d’étudier les liens entre ces profils et le microbiote intestinal et la santé des porcelets. Le projet porte donc sur le continuum truie-sécrétions lactées- porcelets et nécessite d’être réalisé sur des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux prévus est de 104 au maximum ; il correspond à 26 truies et 78 porcelets (3 porcelets/portée x 26 portées). Le nombre de truies (26 truies à la mise bas pour au final 20 truies avec un jeu de données complet) est suffisant et nécessaire pour décrire les profils en oligosaccharides du lait et leur variabilité au sein de truies d’un même génotype, d’un même élevage et conduites de la même façon. Il est suffisant aussi pour suivre la cinétique d’évolution de ces profils sur 4 semaines de lactation. Pour les porcelets, seul un nombre limité de porcelets par portée seront soumis aux interventions invasives. Ils seront représentatifs des porcelets de poids moyen dans la portée. Le choix de 2 et 3 porcelets pour les collectes de sang et de fèces permet d’évaluer l’effet de la mère dans les analyses. Deux ou 3 porcelets sur 20 portées (au final) permettent aussi de suivre la cinétique d’évolution du microbiote fécal et des indicateurs de santé des porcelets pendant leur phase d’allaitement. Ce choix est basé sur nos expériences précédentes, validées. Les cinétiques seront étudiées par analyse de variance comportant l’effet temps de prélèvement et l’effet truie.

Raffinement

L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des truies et des porcelets sera limitée à 5 minutes. Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes. Les collectes de fèces seront aussi interrompues si sans succès au bout de 5 minutes. Truies et porcelets seront particulièrement surveillés après chaque intervention invasive.

Choix des espèces

Le projet sera mené sur des truies et leurs porcelets jusqu'à la fin de la période d'allaitement. Les porcs sont ici l'espèce cible du projet qui consiste à apporter des éléments scientifiques sur le lien entre des composés spécifiques du lait, les oligosaccharides, et le microbiote et la santé intestinale des porcelets. Les connaissances serviront de base pour tester des stratégies de nutrition préventive pour les porcelets sous la mère qui permettrait de réduire les problèmes diggestifs des porcelets au sevrage. En élevage porcin, le sevrage est une phase critique pour les porcelets. Le projet porte sur la transmission d’éléments de la truie aux porcelets via le colostrum et le lait. Il utilise donc des truies en lactation et des porcelets allaités par ces truies.

1 088 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un surdosage de paracétamol par injection pour provoquer une atteinte du foie, puis sont tuées par dislocation cervicale afin de prélever foie, rate et reins. Le porteur affirme que le surdosage entraîne un inconfort mais aucune douleur dans les vingt-quatre heures. Sur le remplacement, il affirme que l'intoxication au paracétamol est un processus complexe non modélisable in vitro et une étape préclinique "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de trouver de nouveaux traitements de l'insuffisance hépatique induite par le paracétamol.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait aboutir à la mise en place de nouveaux traitements de l'intoxication au paracétamol basés sur l'utilisation de la N-Acétyl Cystéine et d'inhibiteurs de nécrose régulée.

Procédures

Deux injections intrapéritonéales pour procédure 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs", une injection intrapéritonéale et une injection intraveineuse par voie rétro-orbitale sous anesthésie isoflurane pour procédure 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse", et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitale avant sacrifice par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Le traitement par un surdosage contrôlé de paracétamol entraine certes un inconfort des animaux mais il n’est pas accompagné de douleurs dans les 24h qui suivent son injection (actions antalgique et antipyrétique du paracétamol).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie après la procédure n° 1 "Traitement par le paracétamol et les inhibiteurs" (soit 960 souris) ou la procédure n° 2 "Traitement par le paracétamol par voie intrapéritonéale et par l’inhibiteur par voie intraveineuse" (soit 128 souris). Tous les animaux (1088 souris) sont mis à mort après la procédure n°3 "Prélèvement du sang par voie rétro-orbitale" afin de prélever les différents organes (rate foie et reins) pour les analyses.

Remplacement

S’il est vrai que certaines questions peuvent être abordées grâce à la culture d’hépatocytes, celle posée dans notre projet cherche à identifier le rôle protecteur d’une molécule vis-à-vis d’une pathologie, l’intoxication au paracétamol qui implique un grand nombre d’évènements moléculaires et cellulaires. Cette pathologie est un processus complexe non modélisable in vitro. Enfin, cette étude préclinique est une étape pré-requise indispensable avant de futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre de souris engagées (1088) dans ces expériences a été réduit au minimum pour permettre une validation des résultats statistiques par des tests non paramétriques Kruskal-Wallis, Mann et Whitney et Spearman.

Raffinement

L’étude a été raffinée au mieux en privilégiant un traitement de courte durée permettant à la fois la mesure des paramètres d'évaluation de l'hépatite et limitant le développement de douleurs et malaise induits par le traitement. Enfin nous avons anticipé l’étude de tous les organes pertinents (3) qui permettront une étude complète de la pathologie et des molécules pour un maximum d’informations.

Choix des espèces

Cette espèce permet de modéliser ce qui se passe dans une pathologie sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cette espèce. Elle permet d’étudier les phénomènes en cinétique de la physiopathologie et de tester l’effet de petites molécules chimiques pour la prévention et/ou thérapie de la pathologie. Adulte de 9 semaines pour avoir des animaux avec une fonction hépatique normale et pour étudier une pathologie qui affecte surtout des adultes.

2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.

Objectifs

Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.

Procédures

L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.

Impact sur les animaux

Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.

Réduction

Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).

Raffinement

Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.