Recherche appliquée

6 300 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique. Selon les cas, ils reçoivent des injections deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, sont des lignées génétiquement modifiées ou ont été opérés, avant d'être mis à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélèvement de tissus nerveux. L'objet est de mesurer ex vivo l'effet de molécules candidates sur le système nerveux. Le porteur affirme que des réseaux neuronaux "plus physiologiques" sont nécessaires et qu'aucune reproduction in silico n'est possible.

Objectifs

Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleur appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le developpement de modèle rongeur génétiquement modifé (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’evaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ ou de cellulles nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le PATCH = un enregistrement à l'echelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques (composés « LEADS ») en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule, le cas échéant - afin de pouvoir déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire. Notre direction scientifique valide une stratégie d’étude, comportant plusieurs conditions, en se basant sur des données bibliographiques.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphallique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développment de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Procédure 1, par étude, 60 animaux vigiles seront injectés deux fois par jour. Ces injections seront réalisées par du personnel entrainé, qualifié et du matériel adapté. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne un mois. L’animal sera habitué à la contention, limitant le stress lors des gestes à venir. La plus grande vigilance de suivi sera portée pour éviter les problèmes dus aux injections répétées. 2700 animaux maximum entreront dans les 5 ans du projet. La Procédure 2 permettra de phénotyper 60 animaux génétiquement modifiés par étude, 2700 animaux sur 5 ans. Nous travaillerons sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Procédure 3 : 900 animaux subirront une chirurgie par notre partenaire, 15 jours avant leur envoi. Avant réception dans nos locaux, les animaux auront pleinement récuperer leur état de santé. En fonction de l’opération subie, les animaux devront être isolés depuis leur intervention jusqu’à leur MAM et donc être isolés 3 semaines. Tous ces animaux seront mis à mort par deux techniques: *- en fonction de leur âge, l’animal sortira de la zone d’hébergement par décapitation rapide sous anesthésie gazeuse; *- certains animaux sevrés seront mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthéise gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables: La procédure 1 peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. Nous habituerons les animaux concernés à ces manipulations avant leur entrée dans le projet; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. Pour éviter, par exemple, les inflammations génerées, nous varierons les sites d’injection autant que possible et assurerons une surveillance précise des animaux pour limiter la persistance d’effets indésirables provoqués en suivant nos règles de point limites. Nous utiliserons, aussi, le matériel d’administration adapté à l’espèce, au poids et l’âge des animaux ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important. Elle sera réalisée par du personnel dûment formé et quanlifié régulièrement avec utilisation d’un analgésique ; La procédure 2 peut par : *-La nature des animaux GMs, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptômatiques. Nous adapterons, tout de même, notre surveillance et nos points limites en fonction des symptômes possibles pout anticiper toute apparition précoce de douleur, qui ne devraient pas se declencher avant leur mise à mort et nos enrigistrements dans ce projet ; La procédure 3 peut par : *-la nature des opérations faites sur les animaux reçus et opérés par notre partenaire, induire des problèmes de type post-opératoire. Nous contrôlerons avec notre partenaire que les animaux opérés sont stables et aptes à être transportés, deux semaines après leur chirurgie. De plus, les conditions d’hébergement ainsi que les points de surveillance spécifique enrichieront nos points limites et nos points de surveillance au cours des 3 semaines d’hébergement des animaux. .

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Tous les animaux génétiquement modifiés de la procédure2 et tous les animaux opérés de la procédure 3 sont mises à mort pour enregistrement électrophysiologique, ex vivo. Ces mis à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégéneratives et nos protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale que nous maitrisons.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ».Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato encephalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne sgnificativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils béneficent d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le founisseur ou le partenaire. Pour les animaux opérés, ils seront adaptés au mieux et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. Les animaux utilisés en Procédure 1 seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur inoccuité. Les animaux seront surveillés deux foix par jour et pesés. Pour la procédure 2, les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptomes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deça de la limite préetablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Pour les animaux opérés (Procédure3), les conditions d’hébergement seront transmises par notre partenaire. Les animaux seront reçus après une complète récuperation de la chirurgie. Toutefois, un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera exercé. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée ou opérée (Procédure 2 et Procédure 3) fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques ou ayant pleinement récupérés de leur chirurgie. Toutefois, la connaissance des phénotypes et chirurgies ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limite modifiés pour palier à des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux. Les animaux, des procédures 1 et 3, seront exclusivement des animaux post sevrage. L’âge des animaux de la procédure 2 dépendra de l’âge de l’apparition des symptômes de la maladie.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le foie par chirurgie ou sous la peau, parfois un traitement par injection ou par plasma froid, un suivi par imagerie sous anesthésie, puis sont euthanasiées pour prélèvements. Le projet cherche à évaluer de nouvelles thérapies contre le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome. Le porteur affirme qu'on ne peut recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et retient des souris immunocompétentes pour préserver le microenvironnement immunitaire.

Objectifs

Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.

40 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cette phase 1/2 consistant en une intervention chirurgicale de deux à trois heures sur l'intestin, anastomose iléo-rectale ou shunt du gros intestin. Les animaux opérés sont ensuite transportés vers un autre établissement pour des mesures de digestibilité, ils ne sont pas tués à l'issue de ce projet mais réutilisés. L'objet est d'évaluer la valeur nutritionnelle de matières premières pour l'alimentation des porcs d'élevage. Le porteur affirme que l'usage de l'espèce cible est "indispensable", tout en indiquant qu'une méthode in vitro pourrait à terme réduire ou remplacer ces essais.

Objectifs

Les essais de digestibilité iléale sur porcs en croissance sont réalisés partout dans le monde, par des équipes de recherche spécialisées dans ces méthodes, afin d’évaluer de la manière la plus précise possible la valeur nutritionnelle des matières premières (MP), coproduits ou aliments destinés aux porcs, particulièrement celle des protéines et des acides aminés. En effet, les MP et coproduits ne cessent d’évoluer, par les changements des itinéraires techniques plus respectueux de l’environnement, l’apparition de nouvelles sources de protéines locales et l’optimisation des procédés. Les résultats obtenus permettent aux producteurs d’aliments et aux éleveurs d’adapter au mieux la formulation aux besoins des animaux, contribuant au maintien d’une flore digestive équilibrée et d’une bonne santé des animaux mais aussi à réduire les rejets azotés dans l’environnement, à améliorer leur santé digestive (moins de fermentations indésirables) et à appuyer la recherche sur les procédés appliqués en vue d’améliorer la qualité des MP ou leur empreinte environnementale (ex. procédé de trituration). En effet, la présence d’éléments nutritifs non digérés et en particulier les protéines, augmente les fermentations des déjections et dégrade les conditions sanitaires de l’élevage. In fine, tous ces rejets se retrouvent en tant que polluants dans l’environnement (sol, air, eau). Ce projet est la continuité dans l’acquisition des données d’un projet précédent avec les mêmes objectifs. Il contribue à la validation d’une méthode alternative ayant pour but de réduire ou remplacer à terme les essais in vivo en utilisant une méthode in vitro qui est à raffiner avec des avancées méthodologiques du procédé et en agrégeant les résultats dans des modèles mathématiques avec d’autres informations sur les propriétés physicochimiques des aliments et MP ou leurs spectres proche infrarouge. Des données de digestibilité iléale issues d’essais in vivo réalisés sur plusieurs années ont été mises en commun servant de base au projet. Dès l'obtention des modèles, des essais de validation seront nécessaires. Dans ce type de projet, l’utilisation de l’espèce d’élevage est indispensable, puisqu’il s’agit de la cible directe de la thématique. Deux parties permettent de mener à bien ce protocole : un projet de modification chirurgicale nécessaire aux mesures (1/2) et un projet avec préparation, transport des animaux avant / après préparation chirurgicale et hébergement en cage individuelle (2/2).

Bénéfices attendus

Ce projet (1/2) est la phase de préparation des animaux, nécessaire à la réalisation du projet 2/2. Le programme global permettra de continuer l’acquisition de données de digestibilité iléale chez le porc nécessaire afin de formuler au mieux les aliments d’élevage pour limiter les désordres digestifs liés à un déséquilibre protéique mais aussi les rejets dans l’environnement tout en développant les connaissances sur des matières premières notamment locales. Les essais de digestibilité permettent d’évaluer des hypothèses de manière fine et donner des valeurs de référence de la valeur nutritionnelle d’une matière première ou d’un aliment avec un nombre d’animaux très réduit. Ces matières premières ne cessent d’évoluer d’où le maintien de ce type d’essai, mais le développement en parallèle des méthodes in vitro pourra à terme réduire ou remplacer la méthode in vivo. Ces résultats sont importants pour les filières animales et de plus en plus avec le développement d’une alimentation locale. Aucune autre méthode ne permet de faire la mesure avec un meilleur rapport bénéfice / risque. La seule autre technique est avec utilisation d’un marqueur et abattage de l’animal pour prélèvement du contenu. Non seulement elle est moins précise, mais avec un nombre identique de répétitions (n=6), il faut abattre 6 porcs pour une seule matière première, alors qu’avec 6 porcs nous pouvons évaluer 10-12 matières premières.

Procédures

Les porcs sont soumis à 1 intervention chirurgicale (anastomose iléo-rectale termino-terminale ou shunt du gros intestin). Un porc subit une seule fois l'opération, qui dure entre 2 et 3h en moyenne.

Impact sur les animaux

Comme dans toute intervention chirurgicale, la douleur potentielle de l’acte est gérée par un apport d’analgésique en périodes pré et post-opératoire, et par la maitrise de la technique par l’équipe chirurgicale. L’effet indésirable ultime est la complication opératoire qui pourrait donner lieu à la mort de l’animal, mais c’est assez rare dans l’historique de plus de 30 ans de pratique. Les autres nuisances sont plutôt liées au transport, à la période post-opératoire ou aux mesures in vivo qui sont décrites dans le projet 2/2.

Devenir

Les porcs issus de la procédure d'intervention chirurgicale sont transportés ensuite vers un autre établissement utilisateur (EU), dans le cadre d'une utilisation continue, pour des mesures in vivo de digestibilité iléale des nutriments présents dans les aliments.

Remplacement

La mesure de la digestibilité iléale des acides aminés chez le porc ne peut aujourd’hui être réalisée que par des essais sur des animaux de l’espèce cible ayant suivi la procédure de préparation chirurgicale décrite dans ce projet. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées dans le monde, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo. Néanmoins, ce programme sert également à alimenter les bases pour le développement d’une méthode in vitro qui pourrait à terme, réduire ou remplacer les essais sur animaux.

Réduction

Ce projet permet de préparer chirurgicalement 6 animaux qui serviront à évaluer environ 10 matières premières différentes, sans recourir à d’autres interventions. Un dispositif en carré latin permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés par année (6 répétitions) utilisés dans un essai. Ce dispositif a été validé par notre service d’études méthodologiques et statistiques. 6 répétitions par aliment nous permettent d'obtenir une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives ayant un sens biologiquement sur les différents critères d'intérêt mesurés. Le traitement des données est réalisé en deux temps : un test permettant d’écarter un arrière-effet pour toutes les variables (semaine, animal, poids des animaux), et ensuite une analyse de variance et un test a posteriori (Tukey, méthode des contrastes, …).

Raffinement

Dans le programme global, le raffinement a été réfléchi sur les deux projets le constituant, d’abord sur les conditions pré-opératoires (EU A), puis sur l’intervention chirurgicale de ce projet (EU B) et enfin sur la phase post-opératoire et d’essai du projet 2/2 (EU A). Les mesures de raffinement décrites ci-dessous sont celles concernant uniquement l’EU B. Les animaux sont transportés par le personnel de l’EU A, dans un véhicule spécialement équipé pour le confort des animaux. Ils arrivent à l’EU B le jour même de l’intervention (30 minutes de transport). L’animal est accueilli directement dans un sas chauffé pour le préparer à l’intervention. Le raffinement est assuré par les bonnes pratiques chirurgicales et par une gestion adaptée de la douleur en pré et peri opératoire. L’acte chirurgical est réalisé par du personnel formé et autorisé, sous anesthésie gazeuse générale, analgésie et antibiothérapie appropriées. Les signes vitaux sont monitorés. Après l’intervention, l’animal est préparé pour le transport (bandage de la zone abdominale et placé en observation jusqu’aux premiers signes de réveil. Puis, il est replacé dans le véhicule conditionné pour le transport, sous sédation préalable. Le choix de replacer l’animal dans l’EU A pour la phase post-opératoire a été fait en considérant le peu de km de distance (36 km, environ 30 minutes) entre les deux sites et les bénéfices pour l’animal. En fait, les animaux sont habitués à leur lieu d’hébergement avant l’opération et le retrouvent rapidement après, évitant ainsi un stress supplémentaire. Une analgésie et une antibiothérapie adéquates sont prévues avant, pendant et après l'opération.

Choix des espèces

Ces essais concernent la mesure de la digestibilité iléale des acides aminés chez le porc. Ce type d’essai a déjà contribué à établir des valeurs de référence largement utilisées, mais la production de nouvelles matières premières et coproduits, d’additifs améliorants ou de process, nécessite d’établir de nouvelles références, qui ne peuvent être évaluées que par les études in vivo sur des animaux ayant suivi la procédure ici détaillée. Les animaux sont opérés à 25-30 kg pour faciliter l’acte chirurgical, puis laissé un temps long (1 mois) de rétablisement avant la réalisation de mesures. Les mesures de digestibilité (projet 2/2) sont réalisées en phase de croissance (35 - 80 kg), ce qui refléte au mieux les animaux ciblés en élevage par ce modèle.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée à partir de cellules cancéreuses, puis elles reçoivent jusqu'à huit injections d'un anticorps, avant mise à mort au plus tard trente jours après. Le porteur décrit une perte de poids et des difficultés respiratoires possibles liées au développement de métastases. Il annonce espérer démontrer l'efficacité d'une immunothérapie et juge le modèle animal seul capable de reproduire ces mécanismes tumoraux.

Objectifs

Un des cancers du sein les plus agressifs, qui représente 15 à 20% des cancers du sein, présente un taux élevé de rechute. L’absence de thérapies spécifiques le rende difficile à traiter. Nos données montrent que les cellules de cancer du sein triple négatif résistant à une irradiation présentent de façon plus abondante une protéine particulière appelée Gal9. Cette protéine pourrait servir de cible thérapeutique pour lutter plus efficacement contre cette maladie. L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’efficacité thérapeutique d’un anticorps ciblant Gal9 dans un modèle de cancer du sein triple négatif chez la souris. Notre projet consistera dans un premier temps à faire pousser des tumeurs à partir de cellules irradiées in vitro. Les cellules seront irradiées puis injectées dans la glande amammaire. La croissance des tumeurs sera suivie et comparée à des tumeurs issues de cellules non irradiées. La deuxième phase de notre projet dépendra de l’efficacité de notre première procédure. Elle consistera à injecter des cellules irradiées ou non irradiées à des souris et de traiter immédiatement ces souris avec un anticorps ciblant Gal9. Ce traitement devrait permettre de minimiser le développement du cancer, en particulier chez les souris dont les tumeurs expriment fortement Gal9.

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer l'efficacité d'une thérapie ciblant Gal9 dans ce cancer particulièrement agressif. Les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif et soumises à de la radiothérapie pourraient être particulièrement éligibles à cette thérapie.

Procédures

1 Injection sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (10 minutes) Injections intra-péritonéales sur animaux vigiles (jusqu’à 8, à raison de 2 par semaine)

Impact sur les animaux

Le développement des tumeurs pourrait s'accompagner d'une perte de poids en plus d'une gêne physique pour les animaux. Des effets indésirables liés à la présence de métastases sont envisageables ; ils se traduiraient par des difficultés respiratoires plus ou moins prononcées. La grille de points limites que nous proposons permettra de tenir compte de ces potentiels effets indésirables. En ce qui concerne l'injection d'anticorps anti-(gal9), plusieurs papiers ont déjà été publiés à ce sujet et ne montrent pas d'effets indésirables particuliers.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, au maximum 30 jours après le début du traitement. Les raisons sont les suivantes: - le score maximum de points limites sera atteint, - les souris n'auront pas de tumeur primaire mais seront susceptibles d'avoir développé des métastases pulmonaires - les souris auront bien répondu à l’immunothérapie et l’analyse des réponses immuno-inflammatoires sera nécessaire pour l'expliquer.

Remplacement

Nous avons accumulé de nombreuses expériences sur modèles cellulaires mais nous devons maintenant tester l’utilité de notre traitement sur l’animal puisqu’il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes complexes impliqués dans le développement tumoral et les réponses immunitaires associées.

Réduction

Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécéssaire et suffisant de souris. Pour chaque condition expérimentale, un nombre de 10 souris par groupe pour un total de 70 souris.

Raffinement

L’état général des souris sera contrôlé visuellement quotidiennement en ouvrant chaque cage. Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours (lundi au vendredi). La grille sera également utilisée tous les 2 jours. La souffrance des animaux ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalent à l’introduction d’une aiguille. Cependant, une grille d’évaluation de la douleur, adaptée à ce projet, a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur. En cas d’atteinte d’un niveau défini de points limites, la mise à mort de l’animal sera anticipée.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisée dans des modèles développés in vitro et vise à valider la pertinence de notre travail dans le cancer du sein triple négatif. Il est essentiel de tester la pertinence de notre cible thérapeurique dans un modèle beaucoup plus complexe que des cultures cellulaires et de tester son action anti-cancéreuse. La souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement les étapes du développement du cancer du sein en intégrant les réponses des cellules de l'immunité observées chez l'humain. Le cancer mammaire est majoritairement présent chez l'adulte. Pour cette raison, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines.