Recherche appliquée

28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une minipompe est implantée sous leur peau par chirurgie pour diffuser deux molécules provoquant une hypertension, avec des échographies sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, avant mise à mort pour analyses. Le projet ne vise pas une connaissance nouvelle mais à vérifier la fiabilité du matériel servant à modéliser l'hypertension chez la souris. Le porteur juge cette étape "indispensable" pour valider ses futures études pharmacologiques.

Objectifs

Le but de ce projet est d'analyser de manière précise une modalité d'administration d'un mélange de composés utilisé chez la Souris pour modéliser l'hypertension. En effet, afin de reproduire des conditions pathologiques sur le modèle Souris, nous utilisons une diffusion continue d'une faible dose de deux molécules (Angiotensine 2 et Phenylephrine) dans la cavité péritonéale. Cette diffusion est gérée par une mini-pompe placée en sous-cutané, qui doit envoyer durant une période de 28 jours complets une concentration continue de la solution dans l'organisme afin de soumettre le système cardiaque à une surcharge vasculaire entrainant une hypertension. Ce protocole est ensuite utilisé pour modéliser les atteintes observées chez l'Homme afin d'étudier des gênes ou des composés potentiellement utilisables pour réduire ces symptomes. Néanmoins, nous avons observé dans une étude précédente que durant la dernière semaine de traitement, après le 21ème jour de diffusion, nous observions une forte réduction de l'hypertension sur une modèle génétiquement modifié. Cela nous questionne sur la durée réelle de diffusion des composés dans l'organisme. Pour répondre à ce point, nous souhaitons réaliser une étude de validation de ce protocole.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mettre en évidence de manière robuste la variabilité expérimentale possible due au matériel employé pour modéliser l'hypertension chez la Souris. Cette étape est indispensable pour pouvoir poursuivre nos études pharmacologiques sur le modèle Souris et conclure sans équivoque sur les données générées dans ce cadre.

Procédures

Les animaux subiront plusieurs échographies pour surveiller leurs fonctions cardiaques. Elle seront anesthésiée par voie gazeuse. Des prélevements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la décision du manipulateur, afin de favoriser le bien-être de l'animal (le prélevement vigile se fait à la veine temporale superficielle et s'avère moins stressant qu'une anesthésie gazeuse couplée au prélevement au sinus orbital) Une implantation de minipompe sera réalisée sous la peau lors d'un geste chirurgical. Celui-ci sera couplé à l'utilisation d'antalgiques avant, pendant et après l'incision pour éviter toute souffrance aux souris.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une implantation sous-cutanée des mini-pompes. Celles ci restent sous la peau durant l'ensemble du projet, et ont une longeur de 3 cm et un diamètre de 0.7 cm. La chirurgie est simple et maitrisée pour cette implantation et aucune complication n'a été observée dans le projet précédent. Une couverture analgésique durant l'implantation et dans les jours suivant celle-ci, couplée à des conditions antiseptiques permettent de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions optimales. Suite à cette implantation, les animaux effectueront une anesthésie gazeuse pour passer une échographie cardiaque chaque semaine. Celle-ci dure environ 30 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Durant cette anesthésie, un prélevement sanguin à la veine temporale superficielle sera effectué.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques et histologiques.

Remplacement

Etant donné que ce protocole vise à modéliser un phénomène cardiaque complet, à savoir la mise en place d'une hypertension, nous ne disposons pas actuellement de modèles alternatifs n'utilisant pas l'animal.

Réduction

Dans ce protocole, nous avons planifié d'utiliser 14 animaux par groupes expérimentaux. En effet, nos études précédentes nous ont montré que l'effectif idéal se situe entre 12 et 14 animaux par groupe expérimental selon la variabilité de la réponse au mélange pharmacologique observée. De ce fait, nous prévoyons un total de 28 animaux recevant une minipompe, pour obtenir des conclusions statistiques tout en anticipant une variabilité possible. Les données générées seront analysées par des tests paramétriques (analyse de variance et test de Student).

Raffinement

Les animaux seront hebergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté. Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. Lors des échographies, les animaux seront anesthésies par voie gazeuse. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

nous utilisons le modèle souris car il nous offre un accès à de nombreuses lignées génétiquement modifiées et que le système cardiaque peut être étudié et est suffisamment proche de l'humain pour offrir une valeur prédictive dans notre approche translationnelle. Les animaux seront agés de 1 an, afin d'être dans des conditions similaires à notre étude précédente.

6 porcs miniatures vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie puis des séances d'imagerie au fil d'une succession de cinq procédures dont la dernière est terminale, pour tester une substance censée moduler la détection du sucre près du foie. Le porteur présente le diabète de type 2 comme concernant environ 500 millions de personnes et annonce une "solution thérapeutique innovante". Il justifie le recours au porc par sa taille proche de l'humain et l'impossibilité de reproduire in vitro la régulation de la glycémie sur un "animal entier".

Objectifs

Le projet vise à définir la dose minimale d’une substance susceptible de moduler la manière dont le système de détection de l’arrivée de sucre situé à proximité du foie renseigne le cerveau après le repas. L’objectif final est de traiter le diabète de type 2 en limitant les effets secondaires néfastes qui sont malheureusement classiques avec les thérapeutiques actuelles. Le modèle retenu est celui du porc miniature car il développe spontanément un des permisses du diabète de type 2 lorsqu’il est soumis à un régime alimentaire pléthorique. De plus, la taille de l’animal permet un abord chirurgical identique à celui qui sera réalisé à terme chez l’homme. Enfin, sa taille est adaptée à une imagerie du système de détection de l’arrivée du sucre.

Bénéfices attendus

Le bénéfice prévu vise à disposer d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement du diabète de type 2. Cet objectif est réaliste car nous avons préalablement mis en évidence les mécanismes qui conduisent à la réduction d’efficacité du système de détection de l’arrivée de sucre. Cette réduction est parallèle à la survenue de la réduction de l’efficacité de l’insuline - un phénomène connu comme étant la prémisse de l’établissement du diabète de type 2. Cette cascade survient, en l’absence de prise de charge, chez tous les patients au cours de l’apparition du diabète de type 2, c’est à dire environ 500 millions de personnes dans le monde par an.

Procédures

Pour ce projet, 6 animaux seront utilisés sachant que les données sur des animaux témoins ont déjà été obtenus dans le cadre d’un projet antérieur. Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale dont la durée interventionnelle est de 10 minutes. Les animaux subiront également des imageries (2 imageries par animal) pour évaluer l’efficacité de la thérapeutique. Ces animaux sont produits à cet effet dans une structure agréée qui tient compte de l’éthique animale et assure l’élevage et le suivi quotidien des animaux dans les meilleures conditions de bien-être conformément à la législation et à la règle des 3R.

Impact sur les animaux

Ce projet sera réalisé́ en s’assurant qu’aucune angoisse, douleur ou souffrance inutile ne soit ressentie lors de toute intervention sur les animaux. Une observation quotidienne et une interaction positive quotidienne avec les animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. En cas d’effet inattendu, les traitements appropriés seront mis en œuvre en accord avec les responsables du bien-être animal de notre établissement utilisateur.

Devenir

Ce projet correspond à la succession temporelle de 5 procédures - les 4 premières conduisant à la réutilisation de l’animal pour la procédure suivante, la cinquième et dernière étant terminale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront suivis par un vétérinaire pour décider d’enclencher la procédure suivante. Trois procédures sont de classe légère, une procédure de classe modérée (chirurgie) et une sans réveil.

Remplacement

Les procédures ne peuvent être faites que sur l’animal entier car la régulation de la glycémie est liée à une série de réponses biologiques non reproductibles intégralement in-vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est volontairement réduit car les données sur les animaux témoins ont déjà été obtenues dans le cadre d’un projet antérieur. Cette réduction significative du nombre d’animaux n’induit donc pas une réduction de la significativité statistique alors qu’elle divise par deux le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Des points limites sont fixés au préalable, et un suivi des animaux est effectué́ de façon très régulière. Les procédures chirurgicales et d’imagerie ont été́ conçues et validées par un vétérinaire en incluant une valence analgésique forte. Les méthodes d’imagerie sont les plus sophistiquées possible à ce jour indépendamment de l’espèce utilisée. La méthode chirurgicale est reconnue comme celle produisant les suites post-opératoires néfastes les plus limités possibles.

Choix des espèces

Le porc s’impose comme un modèle privilégié pour les études en nutrition et neurosciences. En contexte nutritionnel délétère, le miniporc adulte développe une obésité similaire à la pathologie humaine. Les animaux seront des jeunes adultes lorsque leur croissance aura atteint un plateau i.e. > 1,5 an. Ceci se justife par le fait que la condition visée par notre solution thérapeutique est celle de l'obésité chez l'adulte

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.

8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie intracérébrale d'environ quatre heures pour l'injection d'un vecteur viral, puis six mois de suivi avec huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, avant d'être tué pour analyse histologique. Le porteur destine ces données de toxicologie à une demande d'essai clinique auprès de la FDA et de l'ANSM. Sur le remplacement, il affirme que le cerveau du primate est le plus proche de celui de l'humain et que le recours au "gros animal" est exigé par l'agence réglementaire.

Objectifs

Les vecteurs adeno associés (AAV) sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Huntington. Le but de cette étude est de completer les données de toxicologie d’évaluer la faisabilité/efficacité de l’administration par voie chirurgicale intracérébrale (IC) dans la région du cerveau qui concerne la pathologie en question, de façon à choisir le type d’AAV le plus adéquat pour une pathologie donnée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont l'obtention de toutes les données de tolérance à long terme pour l'application immédiate en recherche clinique à la fin de cette étude afin de répondre aux demande de la FDA (Food and Drug Administration) afin d'obtenir l'autorisation pour un essai de phase I/II et ainsi traiter les patients Huntington.

Procédures

- Une procédure chirurgicale (environ 4h) - 8 prelevements sanguins, 7 prelevements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang + LCR maximum 15min), - 6 Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 45min). Dans ce projet, comme decrit precedemment, une meme anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + EMG ou IRM selon le timepoint d'étude).

Impact sur les animaux

Les 5 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'administration intracerebrale - un risque chirurgical lié à l'administration intracérébrale via des catheters - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang

Devenir

A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, l'ensemble des animaux (n=8) sera euthanasié pour permettre les etudes histologiques et de biodistribution composant l'etude Tox GLP permettant la soumission aux agences reglementaires (FDA et ANSM).

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique afin d'autoriser l'essai clinique chez l'Homme.

Réduction

8 animaux au total: 3 animaux par dose d'AAV et 2 animaux vehicule est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet. L'etude statistique etant assez limité en terme de tox, prinicpalement T test ou Anova. La majeure partie des analyses etant une étude histologique par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l'administration intracérébraleréalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe et recevront un enrichissement adapté.. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV est parfaitement tolérée (expérience passée sur 20). Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les memes volumes et frequence que decrite dans ce projet) sont menée en routine sur tous les animaux suivis par l'equipe et ne generent pas d'effets néfastes sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si necessaire. Si un animal ne presentait pas d'amelioration dans le suiv, il sera euthanasié avec avis vétériaire.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs adeno associés (AAV) à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du primate non humain (NHP) en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 3 ans et 15 ans selon la disponibilité en elevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau completement developpé.

Une injection de collagénase dans le tendon patellaire déclenche l'inflammation d'un genou, puis, sous anesthésie générale, les nouveaux vaisseaux formés autour du tendon sont bouchés par voie artérielle, avec un risque d'ischémie lié aux agents testés. 60 cochons âgés de deux à trois mois vont être utilisés pour tester les matériaux d'embolisation de "différentes équipes", dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme qu'"aucune nuisance supplémentaire n'est attendue", l'étude précédente n'ayant selon lui montré aucun signe de douleur, et prévoit pourtant un morphinique pour "quelques gestes possiblement douloureux". Tous sont tués à l'issue, deux semaines après l'injection, pour prélever leurs tendons.

Objectifs

Les inflammations chroniques des tendons et des articulations sont fréquentes et difficiles à soigner. C'est un problème de santé publique avec un coût médico-économique important et des arrêts de travail prolongés (douleur épaule, coude, poigner, genou) et arrêt de sport.. Dans cette pathologie, des nouvelles artères (néovaisseaux) se forment et entretiennent cette inflammation. Une équipe de chercheurs rapporte que le fait de boucher ces néovaisseaux, c'est à dire de réaliser une embolisation, permet d'améliorer les patients souffrant de ces maladies chroniques. L’agent utilisé pour boucher les vaisseaux est un antibiotique, et n’a pas l’autorisation en France pour être utilisé dans les artères. Cette approche doit être validée sur un modèle animal avant de pouvoir faire des tests chez l'Homme notamment pour prouver qu'il n'existe pas de risque à priver de sang les tendons ou les articulations inflammatoires et d’étudier les différents agents d’embolisation possibles. Dans une étude précédente, notre équipe a mis au point un modèle porcin reproductible d’inflammation du tendon du genou qui associe une inflammation du tendon et le développement de vaisseaux pathologiques. Il a été utilisé pour tester l'embolisation avec des microbilles définitives, montrant l’absence de complication sévère chez l’animal. Cependant l’embolisation avec ces petites billes semble avoir des résultats nettement moins bons sur la douleur que les publications utilisant l’antibiotique comme agent d’embolisation. Dès lors, il est nécessaire d’étudier l'efficacité de cet antibiotique sur notre modèle animal, ainsi que celle de nouveau agents d’embolisation pour orienter la prise en charge future de ces patients. L’objectif de ce projet est donc de proposer notre modèle validé, reproductible et maîtrisé par les radiologues interventionnels, à différentes équipes pour tester la sécurité et l'efficacité de leurs matériaux d'embolisation.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’embolisation dans la pathologie tendineuse. Ceci permettra de mieux comprendre les douleurs des patients et ainsi de leur apporter un nouveau traitement antalgique qui permettra de limiter le recours aux médicaments, soins de kinésithérapie, d’accélérer la reprise du travail et la reprise du sport.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une seule procédure opératoire qui se déroulera en plusieurs étapes : - J0 : induction d'une inflammation au niveau du tendon patellaire du porc (un genou) par injection intra-tendineuse de collagénase de type 1 (25 mg/ 0,5 ml / genou). L'autre genou ne sera pas injecté, l'animal sera son propre témoin. - J7 : réalisation d'une angiographie afin de valider la présence de néovaisseaux et embolisation le cas échéant (comparaison avec le coté controlatéral sain). - J14 : Réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite de l’embolisation des différents pédicules vasculaires avec néovaisseaux par les matériels d'embolisation testés, évaluation de la perméabilité artérielle, et quantification des néovaisseaux. Puis mise à mort des animaux et prélèvement des tissus pour étude anatomopathologique de la destruction tendineuse, des thromboses vasculaires, des néovaisseaux.

Impact sur les animaux

L’étude précédente ayant permis la validation de la dose de collagénase n’a montré aucun signe d’apparition d’inconfort ou de douleur, ni de changement de comportement chez les animaux. Ainsi, le modèle étant désormais maîtrisé, aucune nuisance supplémentaire n'est attendue. Concernant les effets indésirables, devant le risque ischémique lié à l’utilisation des agents embolisants testés, il conviendra de s'assurer de l'absence de complication locale visible au niveau des cuisses de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer le prélèvement des tendons.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir une différence significative entre les groupes en cas de comparaison, ou un groupe suffisamment important pour valider un groupe pilote sur un nouvel agent.

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permetant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Ce modèle ayant été mis au point dans les mêmes conditions, toutes les techniques expérimentales ont été optimisées. Pour la phase d'injection dans le tendon, une anesthésie légère serait réalisée par injection intramusculaire de kétamine (10mg/kg) + azapérone (5 mg/kg). Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (sufentanil 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille.

Choix des espèces

De manière générale, le porc est un bon modèle d'étude proche de la physiologie humaine, notamment au niveau de la vascularisation, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. Nous profiterons également de la mise en place de ce projet pour réaliser des formations aux radiologues interventionnels sur cette nouvelle technique d’embolisation. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.

628 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit, par chirurgie stéréotaxique, une lésion chimique des neurones dopaminergiques reproduisant la maladie de Parkinson et l'implantation de fibres optiques, d'électrodes et d'un implant miniaturisé, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur nomme les tests comportementaux imposés, activité locomotrice, coordination sur tige tournante et épreuve en milieu aquatique, et reconnaît des déficits moteurs induits par la lésion. Sur le remplacement, il affirme que ces déficits ne peuvent être étudiés ni sur des organismes moins évolués ni in vitro et juge le recours à la souris nécessaire.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester in vivo l’efficacité d’un implant miniaturisé (de quelques μm3) permettant à la fois de moduler par optogénétique l'activité des neurones d’intérêt au niveau des circuits des ganglions de la base, d’enregistrer les activités neuronales et de libérer des nanovolumes de différentes substances (L-DOPA, anti-inflammatoire) chez les souris vigiles sans contention et de valider ses effets bénétifiques sur les symptômes moteurs de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et à terme permettre de développer un outil technologique innovant pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1) une stéréotaxie sous anesthésie générale réalisée une seule fois (durée 30-45 min selon le type d’implantation, grade de séverité: modérée) pour induire la lésion unilatérale des neurones dopaminergique et implantater en même temps des fibres optiques, des électrodes d’enregistrement et/ou un implant miniaturisé, suivit, 2) d'un exemen neurologique (series de 6 tests comportmentaux, grade de séverité: légère) ) pour évaluer les effets bénéfiques de la stimulation optogéntique sur les fonctions motrices et motivationnelles (3-5 semaines d’analyses avec 1 à 2 jours séparant deux tests comportmentaux successifs durant 30 sec-30 min en fonction du test), 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.puis 3) une perfusion intracardiaque (5 min) pour effectuer des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Impact sur les animaux

1) Les animaux seront soumis à la lésion des neurones dopaminergique qui induit certains déficits moteurs. La lésion 6-OHDA a été largement caractérisée par la communauté scientifique et induit certains symptômes moteurs (ralentissement moteur, déficit d’initiation du mouvement et asymétries posturales) de la maladie de Parkinson. 2) Une manipulation lors de la connexion des fibres optiques ou des électrodes d’enregistrent. 3) une exposition à des tests comportementaux évaluant les effets bénéfiques des divers modulations optogénétiques sur les fonctions motrices et motivationnelles. Ces tests impliquent une mesure de l’activité locomotrice exploratoire spontanée dans differents environnements et une évaluation des capacités de coordination motrice sur une tige tournante et dans un milieu aquatique. L’inconfort généré par chacun de ces tests est réduit au minimum en habituant les animaux au préalable et en raccourcissant la durée d’exposition. 4) une perfusion intracardiaque pour mener des analyses complémentaires au niveau cellulaire.

Devenir

Mise à mort à la fin de la procédure pour les analyses au niveau cellulaires

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez la souris qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. La maladie de Parkinson fait intervenir des mécanismes complexes nécessitant l'utilisation d'animaux pour créer un modèle pouvant reproduire les symptômes de cette maladie. La dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques induite par la neurotoxine sélective des neurones catécholaminergiques (6-OHDA) s’accompagne d’une réorganisation fonctionnelle des circuits neuronaux des ganglions de la base qui sous-tend le développement et l’expression des symptômes de la maladie de Parkinson. De fait, il est nécessaire de prélever le cerveau entier pour les analyses immunohistochimiques et biochimiques. Les cultures cellulaires ou organotypiques ne peuvent répondre à ce type de recherche. L'implant prototype doit également être caractérisé chez l’animal vigile avant l’approche chez l’homme.

Réduction

Ce projet, d'une durée de cinq ans, nécessitera l'utilisation de 628 souris mâles et femelles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 6 à 14/groupe en fonction du type d’expérience). Cet effectif tient compte de notre expérience de nombreuses années dans ce type d’expérimentation et il est basé sur une approche statistique permettant de vérifier notre hypothèse à 80% de chances pour un seuil de significativité de 5%. Cependant, il pourra être réduit en fonction des résultats marquants obtenus dans les tests comportementaux et du nombre de dispositifs à tester. En effet, au vu de la difficulté technique du projet, nous pourrons être amenés à tester moins de prototypes qu’anticipés. En fonction de leur taille finale, ils pourront être implantés dans d’autres structures telles que le cortex moteur ou le striatum également impliquées dans le contrôle du mouvement. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie de la maladie de Parkinson et permettre à terme de développer une technologie nouvelle pour traiter les troubles moteurs des patients parkinsoniens et probablement d’autres pathologies du système nerveux central.

Raffinement

La chirurgie stéréotaxique pour effectuer la lésion dopaminergique, l’implantation les fibres optiques, et les optrodes a été optimisée pour réduire la durée de l’opération et minimiser la souffrance grâce à notre expérience depuis de nombreuse années dans ce type d’expérimentation. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde. Les principaux paramètres vitaux (température, fréquence respiratoire) sont également contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique morphinique puissant à action prolongée (buprénorphine), est administré en préopératoire. En complément, un analgésique anti-inflammatoire (Rimadyl dilué dans 1ml de NaCl) est administré par précaution en début et fin d'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Les animaux ne présentent pas de signes de souffrance ni stress après réveil de l’anesthésie. Le personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Une grille d’évaluation clinique (Annexe 1) est mise en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. Pendant la période post-opératoire des trois semaines, les animaux sont hébergés dans la pièce de post-chirurgie chauffée à 25°C, et le rythme des visites est augmenté (2 visites par jour). Après la période de récupération post-opératoire, les animaux sont remis dans leur pièce d’hébergement habituelle à l’animalerie et ne sont manipulés par l’expérimentateur en charge qu’après une période de réhabituation d’une à deux semaines. Ils sont hébergés en petits groupes (2 à 4) dans des cages individuellement ventilées (Techniplast), avec eau et nourriture à volonté. Ils ont à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi que des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale. L’analyse comportementale est réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour cela, ils sont manipulés quotidiennement 3 à 4 jours avant le début des tests comportementaux et familiarisés à la connexion des fibres optiques ou des électrodes pour s’habituer à se mouvoir dans les différents environnements sans stress.

Choix des espèces

Le modèle de Parkinson chez le rongeur (injections 6-OHDA) est le plus utilisé au niveau international et considéré comme un bon modèle. L’expérimentation animale utilisant des souris sauvages et génétiquement modifiées est indispensable à la réalisation de notre projet et permet de cibler slectivement des propulations neuronales d'intêret et elucider leurs contributions dans le developpment des déficits moteurs de la maladie de Parkinson. L'ensemble des études est mené sur des animaux adultes à partir de12 semaines. Ce temps est nécessaire pour que le système nerveux soit mature et est classiquement utilisé pour mesurer les performances comportementales de souris adultes. Ceci nous permet de comparer les résultats obtenus avec nos données antérieures et ceux de la litterature.