Recherche appliquée
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reconstruction osseuse segmentaire fémorale avec greffe d’un biomatériau
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau, puis quatre séances d'imagerie sur trois mois avant d'être tué pour analyse des tissus. Le porteur indique une douleur modérée traitée par analgésique et précise que les rats dont le fémur n'a pas été correctement stabilisé sont tués et remplacés. Il présente cette étape animale comme un préalable "impératif" avant des essais sur de plus gros animaux puis en clinique.
Objectifs
La reconstruction des pertes de substances osseuses importantes, telles qu'elles se produisent dans les cas d'accidents graves, de cancers ou de métastases osseuses, reste un challenge. Les greffes d'os autologue (lambeaux osseux, prélevés chez le patient) sont le traitement de référence mais ils présentent de nombreux inconvénients, en raison de la quantité limitée d'os que l'on peut prélever sur un site sain, et des conséquences de ce prélèvement sur son état général et sur sa qualité de vie. En outre, ces procédés chirurgicaux complexes ne sont pas toujours réalisables en raison de contre-indications d'ordre anatomique, vasculaire ou médicale. Le but des recherches qui seront menées durant les 5 prochaines années, est de développer un procédé de reconstruction osseuse avec greffe d'un biomatériau capable de se substituer à l'os manquant dans un premier temps, puis idéalement de permettre la régénération d'un os nouveau.
Bénéfices attendus
Les résultats des expériences conduites sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite de travaux impliquant d'autres modèles, notamment chez le gros animal. Des résultats médiocres obtenus avec un biomatériau conduisent à l'arrêt de l'étude de celui-ci. A l'inverse, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 4 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J2, J28, J56, J72, éventuellement J90.
Impact sur les animaux
Les opérations réalisées pourront entraîner une douleur modérée. Celle-ci sera traitée par l'injection intra-péritonéale de buprénorphine. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux pourra être constatée, si les fixateurs externes destinés à stabiliser le fémur n'ont pas été parfaitement posés. Dans ce cas, les animaux concernés seront sacrifiés et remplacés par d'autres.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie jusqu'à 3 mois après l'opération. Ils sont tous sacrifiés à J90 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.
Remplacement
L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau (nHA +/- Sr) et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Le modèle de défait osseux critique sur la diaphyse fémorale de rat a été décrit dans plusieurs études antérieures.
Réduction
L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasie (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.
Raffinement
L'utilisation de l'imagerie non invasive par microtomographie de rayons X constitue en soi un raffinement dans la mesure où il limite le nombre d'animaux et permet d'obytenir un grand nombre d'informations sur le même animal tout au long de l'expérience. Pendant la chirurgie, une cage après l'autre sera amenée dans la salle d'opération afin d'éviter toute source de stress par contact visuel, olfactif et sonore des animaux opérés et des animaux à opérer. Après la chirurgie, chaque rat se réveillera dans une cage à part pour éviter le contact avec des conégnères non anesthésiés. L'anesthésie se fera par inhalation d'isoflurane, et la profondeur de l'anesthésie sera vérifiée par immobilité, réflexe de retrait et fréquence respiratoire. La prise en charge de la douleur sera prise en charge par l'injection sous-cutanée d'un analgésique: 0.3 mg par kg de buprénorphine juste avant l'intervention et 24 heures après comme recommandé. Si nécessaire, une troisième dose peut être appliquée après 48 heures. Pour réduire le risque d'infection au niveau du site opératoire, un antibiotique prophylactique (céfazoline, 100 mg/kg) sera injecté par voie sous-cutanée le jour de l'opération et le lendemain (protocole calqué sur celui utilisé en clinique). Après le réveil, le rat reviendra dans sa cage d'origine. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages comportant des tunnels, avec accès illimité à l'eau et à la nourriture, placées dans une salle dont les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie) sont parfaitement contrôlés.
Choix des espèces
le rat wistar a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés hostologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat. Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Autres critères retenus: animaux adultes , poids 225-250 grammes la croissance du squelette doit être arrivée à son terme il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure
Dépendances génomiques du myélome multiple surexprimant MYC
- Recherche appliquée
- Cancers
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois modèles de myélome leur sont greffés par injection de cellules tumorales, suivie de traitements administrés chaque jour pendant quatre semaines, l'animal étant tué en cas de détresse vitale ou quand la tumeur atteint deux centimètres cubes. Le porteur revendique l'importance de valider ces cibles thérapeutiques "in vivo" pour reconstituer le microenvironnement tumoral. Il affirme que l'utilisation des animaux est "essentielle" pour produire des données précliniques fiables.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence de ces dépendances géniques in vivo. Objectif. Etablir des approches thérapeutiques à partir de modèles précliniques in vivo pour cibler le MM surexprimant MYC. a. Etudier in vivo les stratégies de létalité synthétique dans des modèles murins de xénogreffes de MM surexprimant MYC. b. Etudier in vivo les stratégies thérapeutiques ciblant les dépendances géniques dans le modèle murin transgénique Vk*MYC
Bénéfices attendus
En utilisant le concept de dépendance génomique, nous avons pu prouver l'importance élevée du métabolisme de la glutamine dans les cellules MYC+, que nous étudions en tant que nouvelle stratégie de traitement. Notre travail vise à mettre en évidence la possibilité d'orienter précisément la thérapie vers certains types de cancers grâce à l'identification de leurs vulnérabilités.
Procédures
Trois modèles murins differents seront utilisés: 1-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injectées en intraveineux avec 3.5 millions de cellules des lignées de MM exprimant la luciférase disponibles dans le laboratoire (MM1S luc-GFP). Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 2-Modèle syngénique à partir de souris C57BL/6J injectées en intraveineux avec 3.5 millions des cellules disponibles dans le laboratoire vk*myc, les prises de sang se feront toutes les semaines pour suivre le pic monoclonal. Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 3-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injection sous-cutanée dans le flanc droit de 5millions cellules U266-CT ou U266-MYC dans du Matrigel. Le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains).
Impact sur les animaux
Les toxicités: Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume). CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels des souris sera surveillé pour identifier une éventuelle toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison
Devenir
Les souris sont sacrifiées par inhalation de CO2 pendant 5 minutes, suivi d’une dislocation cervicale. Les souris sont sacrifiées en cas de signe de souffrance ou de détresse vitale et en cas de volume tumorale atteignant 2cm3
Remplacement
L'utilisation des animaux dans cette étude est essentielle afin de valider l'efficacité de thérapies ciblées sur des tumeurs de myélome surexprimant MYC. Cette étape de validation in vivo est déterminante afin de produire des données pré-cliniques fiables, avec la reconstitution du microenvironnement tumoral, y compris du système immunitaire interagissant avec les cellules tumorales. Ces données pourraient permettre de développer par la suite des essais cliniques de phase précoce.
Réduction
A fin de respecter le principe de réduction, les experiences ont été conçues afin de coordoner plusieur paramètres d'analyse à partir d'expériences individuelles et permettent une analyse longitudinale. Cela réduit la nombre total d'animaux requis. De plus, si les premiers résultats obtenus sont statistiquement signifiatifs et suffisamment homogènes, le nombre d'animaux et de répétitions d'expérimentations sera diminue. Des groupes de 7 souris seront étudiés, permettant une puissance de 80% en projetant une différence de 1.5 déviation standard en utilisant un t test avec un risque alpha de 0.05. Chaque groupe sera exposé à des traitements en combinaisons de différents inhibiteurs d’intérêt ou aux inhibiteurs seuls ou à du DMSO
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions standards et auront une période d'acclimatation dans l'animalerie de 7 jours avant toute manipulation. Ils seront manipulés tous les jours avec douceur et calme par du personnel expérimenté. Les signes de souffrances seront activement recherchés. Lors des procédures (injections IP, SC ou mesure du volume tumoral), les souris seront maintenus sous anesthésie par inhalation d'isoflurane (2% d'isoflurane) afin de les maintenir immobile et d'empêcher l'angoisse des animaux. Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume) et CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels seront surveillés pour l’indication de toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison.
Choix des espèces
Les modèles murins sont adaptés aux lignées cellulaires utilisées dans le myélome multiple et permettant de générer les données in vitro. Deux modèles sont utilisés dans ce projet, un modèle de xénogreffe à partir des souris génétiquement modifiées SCID, injectées avec les lignées cellulaires MM.1S luc/GFP et U266. Ces deux lignées cellulaires sont des lignées de référence dans le myélome multiple. Afin de valider les données du modèle de xénogreffe, un modèle syngénique sera utilisé avec des souris BL6 injectées avec la lignée cellulaire murine Vk*MYC. Ce modèle permet une analyse de l’efficacité des thérapeutiques dans un contexte immunocompétent, plus représentatif des conditions biologiques humaines. La pertinence de ces modèles de xénogreffe et syngénique a été démontré dans de nombreuses études pré-cliniques, ce qui en fait le modèle de choix des analyses in vivo. Les souris SCID et C57BL/6J seront injectées entre 6 et 8 semaines d'âge, ce qui coorespond au modèles les plus fréquemments utilisés dans la litérature.
VaccinoLIV : Étude de l’immunogénicité et de l’efficacité chez la souris de candidats vaccins recombinants
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Toutes tuées à la fin de chaque procédure, 3 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer des candidats vaccins et des virus de la rougeole modifiés contre le cancer. Une partie est infectée par des virus humains ou par le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei, une infection qui peut entraîner selon le porteur fièvre, prostration, perte de poids et paralysie, avec une mise à mort dès le score 2 de sa grille de douleur. D'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et des injections de vaccins une à deux fois par semaine pendant dix semaines au plus. Pour la virothérapie des cancers, le porteur invoque un "besoin médical" et un "marché" qu'il dit "également immenses".
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.
Procédures
Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.
Impact sur les animaux
Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).
Raffinement
Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.
Etude sur modèle murin du rôle des streptocoques dans la prévention des pneumonies à bacilles à Gram négatif (BGN)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
2 907 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des bactéries par voie intratrachéale sous anesthésie, par voie intranasale et par gavage, puis sont euthanasiées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique une perte de poids transitoire et modérée après l'infection respiratoire. Il affirme que les paramètres étudiés ne peuvent aujourd'hui être "remplacés par des procédures in vitro" et que le recours au modèle animal est "indispensable".
Objectifs
Les BGN comme Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa sont fréquemment responsables de pneumopathies en Réanimation et l’évolution très préoccupante des résistances aux antibiotiques chez ces bactéries complique la prise en charge de ces infections.Elles peuvent conduire à des situations d'impasse thérapeutique, rendant nécessaire le développement de nouveaux traitements curatifs et/ou préventifs. La présence de certaines espèces au niveau pulmonaire (streptocoques, bactéries anaérobies) pourrait avoir un effet protecteur contre le développement de pneumopathies, mais les interférences entre cet écosystème et les bactéries pathogènes ont été peu explorées et les effets de ce microbiote sur la muqueuse pulmonaire et les défenses immunitaires locales ne sont pas encore bien compris. Notre projet vise à étudier dans un modèle murin, les effets de streptocoques oraux commensaux (S. mitis, S. oralis, S. salivarius) sur la muqueuse pulmonaire et les populations cellulaires résidentes, et à analyser les conséquences d’une colonisation pulmonaire par streptocoque sur l’implantation/infection secondaire àBGN.
Bénéfices attendus
Notre travail devrait permettre de décrire les effets de streptocoques oraux sur la muqueuse pulmonaire, l’immunité locale, et la prolifération pulmonaire de BGN pathogènes. De récentes études cliniques rapportent que l'administration de probiotiques (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus) chez des patients de réanimation, serait associée à une diminution du risque de pneumopathie. Cependant, les niveaux de preuve actuels ne permettent aucune recommandation. Le travail que nous proposons devrait fournir un rationnel pour leur utilisation ou non.
Procédures
Tous les animaux (mis à part les controles) seront soumis à une administration intra-trachéale de streptocoques en probiotique ou de PBS sous anesthésie générale par inhalation en continu d’isoflurane (3% débit de gaz frais0.8L/min). Le geste de l’injection intratrachéale, en tant que tel, dure au maximum 1 minute et le réveil est presque instantané Procédures 2, 3 et 4 : Tous les animaux de ces procédures (sauf les animaux contrôles) recevont une ou plusieurs adminitrations de supsensions bactériennes ou de PBS par voies intra-nasale et orale (gavage). Ces gestes durent quelques minutes et sont réalisés sur animaux vigiles. Procédure 4 : Tous les animaux de cette procédure (sauf les animaux contrôles) recevont une 2eme adminitration de supsensions bactériennes ou de PBS par voie intra-trachéale sous anesthésie. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections SC de 30µl de buprénorphine (0.05 – 1 mg/kg) pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Les modèles d’inflammation respiratoires aigues (partie 3) sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne en IT, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, les effets indésirables suivants : Poils hérissés et perte de poids.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Lesvariables seront considérées comme non-paramétriques. Elles seront exprimées en médiane et comparéesen utilisant le test de Mann-Whitney. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages enrichies en frisottis, de taille suffisante et dont la litière est changée une fois par semaine. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place (annexe 2). Les procédures sont de courtes durées et n’entrainent pas de douleur résiduelle. Pour chaque procédure nécessitant une anesthésie générale, le réveil complet des souris s’effectue en cage sous surveillance jusqu’à reprise d’un comportement normal. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite de lidocaïne (1mg/kg) afin d’anesthésier localement la trachée.
Choix des espèces
Les modèles murins de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Potentiel vaccinal de souches de virus du Nil Occidental atténuées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections de virus, une souche atténuée candidate au vaccin puis la souche pathogène, et subit jusqu'à sept prises de sang. Le porteur indique que l'infection par le virus du Nil occidental peut provoquer paralysie, prostration, dos voûté et perte de poids d'au moins 20 %, l'animal étant tué dès l'apparition d'un signe sévère. Il affirme que l'étude d'une réponse protectrice "ne peut être effectuée qu'in vivo".
Objectifs
Le virus du Nil Occidental (West Nile Virus) est un flavivirus pouvant conduire à des cas sévères d’encéphalite virale (dans 1 infection sur 150 environ chez l’homme). Cela pouvant conduire à la mort de la personne infectée. Il n’existe à ce jour que des traitements symptomatiques et il n’existe aucun vaccin efficace chez l’homme. La mise en place d’un vaccin atténué contre le WNV est donc d’intérêt clinique. Nous avons décrit dans les dernières années différentes mutations permettant d’atténuer le virus WNV. Ainsi des mutations dans la protéine de membrane réduisent significativement la production virale par rétention réticulaire. De plus une mutation dans la protéine d’enveloppe abrogeant la glycosylation de la protéine E conduit également à une souche atténuée. Cependant ces virus ne sont pas complètement atténués, et la probabilité de réversion est théoriquement importante. Notre objectif est de générer un virus vivant atténué comportant simultanément plusieurs des mutations décrites, et tester la capacité de ce virus à répliquer, et à éliciter une réponse immunitaire protectrice contre une infection d’épreuve. En un premier temps, nous testerons l’atténuation du virus in-vivo, i.e. l’absence de symptômes sévères et l’absence de mortalité. Nous confirmerons que chez l’animal aucun virus révertant n’émerge (i.e. les mutations sont maintenues). Enfin nous testerons l’efficacité de ce virus à induire une protection contre une infection secondaire par le virus WNV sauvage (challenge).
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier un triple mutant du virus WNV (1 mutations dans la protéine E, deux mutations dans la protéine M) qui pourrait constituer un virus atténué, sûr et au potentiel vaccinal. Les 3 mutations étudiées dans ce projet ont déjà été décrites indépendamment dans la littérature mais mis en évidence une atténuation partielle ou pourraient muter et redevenir pathogène.
Procédures
Chaque animal sera soumis à deux injections de virus (souche vaccinale puis souche pathogène ; quelques minutes par injections), et à 7 prises de sang au maximum (alternance veine caudale et rétro-mandibulaire ; quelques minutes par prise de sans).
Impact sur les animaux
Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort.
Devenir
Les souris ont reçu du virus et un traitement potentiellement vaccinal, elles ne peuvent donc ni être réutilisées ni replacées ni adoptées, et sont donc mises à mort.
Remplacement
L’étude de la capacité d’un virus atténué à induire une réponse protectrice ne peut être effectuée qu’in vivo. Nous aurons au préalable confirmé que le virus est capable de réplication efficace et incapable de réverter in vitro. Le modèle souris (Balb/c) est un modèle précédemment utilisé pour les essais vaccinaux précliniques contre les infections à WNV.
Réduction
Nous commencerons par une expérience préliminaire sur 18 souris femelles, qui permettra de valider le nombre d’animaux à utiliser dans les expériences suivantes pour atteindre la significativité. Les groupes contrôles pour lesquels on connait bien la mortalité en réponse au virus WT, est nécessaire pour tester l’inoculum viral ; nous aurons dans ce groupe 3 animaux. Les expériences ne seront réalisées sur les mâles que si les résultats sont concluants chez les femelles. Nous commencerons par travailler chez les femelles car elles sont plus faciles à gérer. Bien que des différentes immunologiques entre mâles et femelles peuvent être décrits dans certains, cas, il n’y a eu aucune différence observée au cours les études antérieures.
Raffinement
Les souris seront suivies 3 fois par semaine (quotidiennement à partir de J7 post challenge). Pour réduire les risques de souffrance inutile, les animaux seront mis à mort selon les critères de suivi. Les souris seront suivies et mises à mort dans le cas de souffrance selon les critères définis. Suite à l’infection par le virus West Nile, les souris sont susceptibles de développer les symptômes suivants : Symptômes sévères : paralysie, prostration, dos fortement voûté, perte de poids supérieure ou égale à 20%, facies douloureux. Symptômes légers : réduction de la motricité, isolement, dos légèrement voûté, perte de poids inférieure à 20%, poils ébouriffés. Dans le cas de l’apparition d’un symptôme sévère, l’animal sera immédiatement mis à mort. Dans le cas de l’apparition de deux symptômes légers, l’animal sera immédiatement mis à mort. En cas de problèmes de motricité, la nourriture et du gel d’hydratation seront déposés directement dans cage. En cas de symptômes légers, davantage de coton dentaire sera ajouté.
Choix des espèces
La souris Balb/c est un modèle à la fois simple et bien décrit de mammifère pour évaluer la capacité vaccinale de virus atténués WNV. S’ils sont positifs, les résultats chez la souris constitueront une première preuve de l‘efficacité vaccinale de ce virus atténué, permettant alors d’envisager la conduite d'autres essais précliniques. En règle générale, les jeunes animaux sont plus sensibles aux Flavivirus neurotropes et sont donc préférentiellement utilisés. Nous utiliserons dans cette étude des animaux âgés de 3 à 4 semaines, afin que les souris soient âgées de 8 à 9 semaines au moment de l’épreuve.
Impact de la perte d’expression de régulateurs clés du cycle de division de l’hépatocyte et de l’immunosurveillance dans la carcinogenèse hépatique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent dès le quatorzième jour de vie l'injection d'un carcinogène chimique, puis subissent un régime induisant une forte prise de poids, des prélèvements sanguins réguliers et un développement tumoral du foie pouvant provoquer amaigrissement et altération de l'état général. Les retombées annoncées pour les patients, de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" car il constitue selon lui le "seul modèle préclinique" permettant de modifier l'expression des gènes de façon ciblée.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour élucider la pathogénie sous-jacente de la maladie. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations génétiques, métaboliques et inflammatoires favorisant un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte, cellule majoritaire du foie. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique.
Bénéfices attendus
Les résultats de notre projet permettront de déterminer les mécanismes par lesquels l’hépatocyte assure le maintien de l'intégrité du génome, et en particulier lors des maladies métaboliques et inflammatoires du foie conduisant au développement d’un cancer du foie. Les retombées de nos travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié. Une injection intra-péritonéale de tamoxifène sera réalisée (une fois, à 6 ou 7 semaines de vie suivant le lot expérimental, durée 30 secondes) sur animal vigile. Un prélèvement sanguin au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière bi-mensuelle (16 répétitions, entre le 4ème et 12ème mois de régime, durée 30 secondes-1 minute). Une injection intra-péritonéale de Diethyl-nitrosamine (carcinogène chimique) sera réalisée (une fois, à 14 jours de vie, durée 30 secondes) sur animal vigile. Une injection intra-veineuse (veine de la queue) sera réalisée (une fois, à 6 semaines de vie, durée 5-7 secondes) sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Du par le régime alimentaire auquel seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Du fait de l’injection IV par la veine caudale, une douleur transitoire dans cette région pourra être ressentie. Du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général (asthénie, perte de poids...).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux (2240).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les processus de carcinogenèse du foie.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet, 2240 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection intra-orbitaire) sera précédée d’une courte anesthésie générale (mélange gazeux d'O2-Isofluorane [0.5-2.5%]). La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées dans ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
Stratégie innovante basée sur l’administration des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour le traitement des complications des radiothérapies cérébrales sur un modèle souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
246 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation du cerveau sous anesthésie puis des administrations par le nez de vésicules issues de cellules souches, avec des tests comportementaux comme le labyrinthe en Y, le labyrinthe surélevé et le rotarod, pour limiter les séquelles cognitives de la radiothérapie. Le porteur indique surveiller les animaux quotidiennement et les mettre à mort en cas d'écoulement nasal marqué, de tête penchée ou d'une perte de poids de 20 %. Il affirme qu'un modèle in vivo est obligatoire pour valider cette stratégie thérapeutique.
Objectifs
La radiothérapie ou un surdosage consécutif aux applications médicales sont très souvent associés au traitement des tumeurs du système nerveux central. 50-90% des patients survivants au traitement de tumeurs du cerveau par radiothérapie présentent dans les 6 mois suivant le traitement des troubles cognitifs tardifs. Les rayonnements ionisants induisent au niveau cérébral un stress oxydatif chronique, une neuro-inflammation, l’apoptose des cellules endothéliales, une raréfaction vasculaire et une atteinte des zones de neurogenèse induisant à terme des troubles cognitifs. Par conséquent, il est indispensable de développer de nouveau traitement. L’efficacité thérapeutique des vésicules extracellulaires issues de cellules souches mésenchymateuses pour le traitement des lésions intestinales radio-induites ou musculo-cutanées a été démontré. Les VE-CSM favorisent le processus de néovascularisation et le processus de réparation tissulaire. L’objectif de ce projet est de proposer une thérapie innovante basée sur l’administration intra-nasale des VE-CSM afin de limiter les conséquences vasculaires et neuropathologiques de la radiothérapie cérébrale et à long terme les troubles cognitifs. Dans le cadre du respect de la règle des 3R, les protocoles expérimentaux sont établis avec un nombre d’animaux réduit mais suffisant pour obtenir des résultats pertinents. Les animaux seront irradiés avec un Sarrp au niveau cérébral. Les animaux seront euthanasiés à différents temps post-irradiation. Les études fonctionnelles, moléculaires et cellulaires seront réalisé sur animaux vigiles ou anesthésiés. Des prélèvements seront réalisés sur un modèle murin anesthésié avant ou après euthanasie. Le nombre total d’animaux utilisés pour ce projet sera de 246.
Bénéfices attendus
Le succès de cette preuve de concept thérapeutique sur l’injection des VE-CSM sera complétée par un autre modèle de radiothérapie fractionnée (3*5Gy) et dans le futur avec une validation sur gros animal qui ouvrirait vers des perspectives de transfert clinique pour limiter la toxicité associée au traitement des tumeurs cérébrales par radiothérapie.
Procédures
Irradiation cérébrale sous anesthésie gazeuse : 10 min sous anesthésie gazeuse isoflurane Administration intra-nasale sous anesthésie gazeuse : environ 5 min par administration Tests comportementaux : - Labyrinthe en Y : 10 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Labyrinthe en croix surélevé : 5 min, réalisé 4 fois (1, 2, 4 et 6 mois) - Rotarod : 3 fois 3 min par séance (1h entre chacun des 3 passages), réalisé 2 fois (4 et 6 mois) Analyse echodoppler sous anesthésie gazeuse : 10 min sous légère anesthésie gazeuse isoflurane Prélèvement sanguin (80uL) 1 fois sous anesthésie gazeuse isoflurane avant euthanasie, durée du prélèvement sanguin 15 secondes
Impact sur les animaux
Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. La souffrance de l’animal sera évaluée quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (piloérection, perte de poids, prise alimentaire). Si un animal montre des difficultés à se déplacer tel qu’un comportement et/ou déplacement anormal, une prise alimentaire diminuée : des croquettes humidifiées ou du gel de transport seront déposés dans la cage. Également, après l’inoculation nasale, si un animal présente un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, il sera euthanasié. Enfin, si un animal montre une perte de poids de 20%, piloérection et/ou dos rond, l’animal sera euthanasié.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements des structures cérébrales.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques. Ici le 1er modèle utilisé est la souris sur lequel nous maîtrisons les techniques fonctionnelles (vasculaire, inflammatoires, comportementales/cognitifs) pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les modèles d’expérimentation utilisés sont fortement influencés par la physiologie. Pour l’évaluation des paramètres vasculaires et inflammatoires le nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque protocole expérimental est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement robustes (Anova, Ttest). Afin d’évaluer les paramètres cognitifs, un nombre de 15 animaux est indispensable pour obtenir des résultats exploitables (Anova, Ttest).
Raffinement
Un suivi des animaux quotidien sera réalisé afin d’appliquer les points limites pour limiter la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement.
Etude de l’activité anti-biofilm à Candida sur cathéter vasculaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
57 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Livrés déjà porteurs d'un cathéter vasculaire, ils reçoivent dans ce cathéter un composé d'origine lichénique contre la formation de biofilm à Candida, et sont hébergés seuls avant d'être tués pour récupérer les cathéters. Le porteur indique que l'isolement, lié à la fragilité du point de sortie du cathéter, est source de stress géré par de l'enrichissement. Il affirme qu'il est difficile de reproduire in vitro les conditions du flux et du système immunitaire, et conserve donc le modèle animal.
Objectifs
L'objectif du projet est de pouvoir montrer l'intérêt de l'utilisation de composés d'origine lichenique comme antifongique dans le cas de la formation de biofilm sur cathéter vasculaire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de selectionner de futurs candidats médicaments permettant d'inhiber la formation de biofilm à Candida dans les cathéters des patients.
Procédures
les animaux sont cathétérisés par le fournisseur. Un changement de lock solution doit être effectué toutes les 72h, au minimum, selon les recommandation du fournisseur. Celle-ci est utilisée pour remplir le cathéter afin que le sang ne remonte pas dedans entre 2 utilisations. Cela évite la formation de caillots présentant un risque d'obstruction du cathéter et/ou de diffusion de celui-ci ensuite dans l'organisme. Ces caillots pourraient ainsi entrainer des dégats au niveau des viscères de l'animal en obstruant les voies de circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Les animaux cathétérisés sont achetés chez l'éleveur après chirugie. Le traitement par les composés évalués sera administré seulement dans le cathéter pour un effet local (lock solution). Nous n'envisageons donc pas d'effet sytémqie chez le rat. Les animaux seront hébergés individuellement en raison de la fragilité du point de sortie du cathéter. Ce stress sera géré par l'ajout d'enrichissement.
Devenir
Les cathéters devant être récupérés en fin d'expérience pour être analysés, les animaux sont euthanasiés au préalable.
Remplacement
Il a été démontré que les espèces particulières de Candida, la nature de la surface de l’appareil, la présence d’un film de conditionnement dérivé de l’hôte et le débit de liquide affectent le développement du biofilm (Chandra, J. J. Bacteriol, 2001). En raison de la complexité du milieu entourant les dispositifs médicaux prothétiques implantés, comme les cathéters intravasculaires, il est difficile de reproduire avec précision les conditions in vivo dans les modèles in vitro. Bien que des progrès aient été faits pour reproduire le flux dans un modèle in vitro, pour imiter le conditionnement des dispositifs intravasculaires par une exposition préinfectieuse à divers composants sériques comme le fibrinogène, ces deux paramètres n'ont pour le moment pas encore été corcectement simulés en raison de la complexité du flux intavasculaire et intracathéter et/ou de la diversité de la composition protéique sérique . Il n’est pas possible d’inclure dans ces modèles chacune des protéines hôtes qui sont probablement importantes in vivo (Chandra, J. J. Bacteriol, 2001) . Plus important encore, le système immunitaire de l’hôte et le site d’infection n’ont pas été pris en compte dans ces systèmes in vitro. Il est donc souhaitable de tester des modèles de biofilms in vivo et le straitements permetatnt de les éliminer (Andes D., Infect Immun, 2004).
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé en utilisant le logiciel G*Power avec les paramètres suivants (test = anova, risque alpha = 0.05, puissance = 0.80, 4 groupes). Cette expérience sera réalisée en double pour valider les résultats obtenus lors de la première expérience. Afin d'améliorer le raffinement, une première expérience sera réalisée pour déterminer le meilleur paramètre de développement du biofilm reposant sur la détermination de la concentration de l'inoculum de levures à injecter dans le cathéter. Le nombre d'animaux a donc été réduit au strict nécessaire pour conduire à des résultats interprétables.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée et seront traités conformément aux indications du fournisseur, en particulier pour l'entretien du cathéter. Le choix de l'espèce Rattus norgegicus est issu de la littérature, ce modèle est décrit comme robuste et moins susceptible d'obturation du cathéter (information du fournisseur et expérience personnelle chez la souris). Le nombre d'animaux a été déterminé de façon rationnelle pour obtenir des résultats interprétables et analysables statistiquement. L'expérience a été conçue pour éviter toute souffrance inutile des animaux. Cependant tout animal montrant des signes de gravité sera euthanasié conformément aux critères indiqués dans les procédures.
Choix des espèces
Les modèles de biofilm sur cathéter sont décrits chez plusieurs espèces animales : la souris, le rat et le lapin. Les cathéters chez la souris sont difficles à manipuler et s'obstruent plus facilement en raison d'un diamètre interne faible. Chez le rat et le lapin, cet inconvénient est très fortement diminué. Le modèle de cathéter vaculaire chez le lapin est peu utilisé par les équipes de recherche, selon la littérature scientifique. De plus, l'expérimentateur n'a pas d'expérience dans la manipulation des lapins. Le rat a donc été choisi comme espèce dans les modèles décrits dans les procédures. Cette étude visant à évaluer le traitement de cathéters vaculaire chez des animaux en pleine possession de leur capacité de défense immunitaire, des animaux trop jeunes ou trop vieux ne réponderont pas à cette condition. De plus, le diamètre des cathéter utilisables chez des animaux jeunes sera plus restreint rendant le risque d'obstruction plus élevé.
Etude de l’efficacité in vivo d’un médicament candidat pour le traitement du syndrome de Hutchinson Gilford (HGPS)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant la progéria, elles reçoivent un composé par gavage cinq à sept jours par semaine pendant quatre semaines, pour évaluer un candidat médicament contre l'atteinte cardiaque de cette maladie. Le porteur décrit un phénotype dommageable, avec un poids dépassant rarement 15 à 17 grammes, une survie moyenne d'environ 117 jours, des anomalies du squelette et de la peau et des troubles cardiaques souvent mortels. Il affirme que ce modèle murin est le "seul" modèle mammifère reproduisant fidèlement la maladie humaine.
Objectifs
Le syndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS), ou Progéria, est une maladie génétique rare conduisant à un vieillissement prématuré. Les enfants atteints par cette pathologie présentent des atteintes sévères du système cardiovasculaire responsables d’une mortalité précoce par infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral vers l’âge de 13 ans. Cette pathologie est due à une mutation hétérozygote d'un gène conduisant à la production d’une protéine toxique. A l’heure actuelle, aucun traitement n’est disponible. Pour réfléchir à de nouvelles pistes thérapeutiques, nous nous sommes intéressés aux liens entre l’accumulation de la protéine toxique et la survenue de l’atteinte du système cardiovasculaire conduisant au décès prématuré des enfants. Nos travaux récents ont en particulier permis de démontrer que l’accumulation de cette protéine conduit à d’autres anomalies cellulaires qu’on a réussi à restaurer grâce à une molécule antivirale et antinéoplasique (anticancéreux) testée sur des cellules de souris mutantes de notre gène d’intérêt. De plus avant de réaliser des tests d’efficacité in vivo et d’envisager un essai thérapeutique sur les patients, nous avons évalué dans une étude précédente, la tolérance à cette molécule et défini les doses maximales tolérées sur des souris du même fond génétique que notre modèle de souris mutantes. Notre projet a donc pour but d’évaluer l’effet de notre molécule sur la survenue des troubles cardiaques observés dans la Progéria et de comparer ses effets à une autre molécule de référence. .
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement de la progeria et les enfants décèdent très jeunes d’une atteinte vasculaire. Plusieurs études ont clairement établi que la perte des cellules des vaisseaux sanguins induite par l'accumulation de la protéine toxique est l’un des facteurs majeur déclenchant le décès prématuré. Toute molécule capable de ralentir voire stopper la mort de ces cellules sera donc d’un grand bénéfice pour les patients. Enfin, nous avons choisi de réaliser ces tests en administrant les molécules par voie orale car il s’agit d’un mode d’administration peu invasif et compatible avec un transfert vers un essai thérapeutique sur des enfants.
Procédures
maintien d’une lignée à phénotype sévère, gavage (5X/semaine, sur une durée de 4 semaines pour 2 groupes, 7x/semaine sur une durée de 4 semaines pour un groupe): chaque gavage dure moins d'une minute pour une souris. mise à mort par prélèvement intracardiaque, la durée est de 5 min par souris.
Impact sur les animaux
Le phénotype du modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, il présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes pour la mutation, présentent un décrochage dans les courbes de poids, avec des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les males et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Enfin, des anomalies squelettiques sont également à noter, comme une lordokyphose, ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris.
Devenir
les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem
Remplacement
Cette étude a pour but d’évaluer les propriétés thérapeutiques d’un antiviral/anticancéreux sur l’atteinte cardiaque observée chez les patients Progeria. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle vivant. Notre modèle de souris mutantes est le seul modèle mammifère disponible à ce jour reproduisant fidèlement les anomalies observées chez les patients HGPS. Elle permet donc de réaliser des essais précliniques et d’obtenir des preuves de principe d’efficacité thérapeutique en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans cette étude, nous comparerons troix groupes de souris mutantes, à savoir des souris traitées avec notre molécule à tester, des souris traités avec une molécule de référence et des souris traitées avec une solution sans molécule active. Chaque groupe sera composé de 5 souris males et 5 souris femelles. Nous avons évalué le nombre de souris nécessaires pour pouvoir valider de façon statistique l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 10 souris par groupe seront nécessaires pour faire face à une perte éventuelle de 10% des souris au cours de l’essai.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gels, facile à ingérer par les souris. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le génome de notre modèle de souris reproduit exactement la même séquence génomique humaine, il a fait l’objet d’une étude poussée et reproduit les anomalies phénotypiques et moléculaires du HGPS. C’est donc le modèle le plus pertinent pour évaluer l’effet de nouveaux médicaments pour ce syndrome. Les animaux seront traités à partir de l'age de 4 semaines, avant que la pathologie ne se développe, jusqu'à l'age de 8 semaines, afin d'analyser les effets de notre molécule sur les troubles vasculaires.
Caractérisation des fibroblastes infiltrant les tumeurs pulmonaires dans le modèle transgénique Kras/Tp53.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Vingt souris de réforme servent, sous anesthésie et sans réveil, à entraîner un geste technique au niveau du larynx, tandis que 88 souris porteuses de tumeurs pulmonaires, dans des procédures de souffrance sévère, sont suivies par imagerie sous anesthésie pour étudier les fibroblastes qui isolent la tumeur des lymphocytes. Le porteur indique surveiller poids et respiration, avec une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour isoler et caractériser ces fibroblastes.
Objectifs
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par la chirurgie et la radiothérapie conduisent à des rémissions mais les stades métastatiques ont une faible survie. Les nouvelles approches par immunothérapie permettent de détruire les cellules cancéreuses en stimulant le système de défense immunitaire du patient (lymphocytes T). Ces nouvelles approches ont conduit à des résultats spectaculaires de rémission durable de tumeurs solides (mélanome et cancer du poumon principalement). Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (30% environ), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Une caractéristique fréquemment observée chez les patients ne répondant pas aux immunothérapies est l’exclusion des lymphocytes T des ilots de cellules tumorales. Maintenus à distance les lymphocytes T sont inaptes à détruire les cellules tumorales. Les fibroblastes associés aux tumeurs (CAF) semblent en partie responsables de cette exclusion en formant une barrière autour des ilots tumoraux. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo dans un modèle transgénique de tumeur pulmonaire chez la souris, les différentes populations de CAF et d’étudier leurs interactions avec les lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Pour cela nous avons choisi un modèle transgénique murin inductible de tumeurs pulmonaires qui permet d’étudier les interactions entre les cellules tumorales pulmonaires et le microenvironnement fibroblastique et immunitaire. Cette recherche fondamentale pourrait déboucher sur des applications cliniques en proposant des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et libérer les lymphocytes T afin qu’ils infiltrent les îlots tumoraux permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie.
Procédures
Tous les gestes techniques de ce projet sont réalisés sous anesthésie : - Induction de l’expression du transgène par administration à l’entrée de la trachée- réalisée sous anesthésie générale des souris transgéniques 108 souris sont concernées. Le geste n’est pas douloureux mais l’anesthésie générale est obligatoire pour garantir une immobilité de l’animal et l’accès au larynx. Durée de l'anesthésie : 20 minutes. - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour le suivi longitudinal des tumeurs pulmonaires par imagerie. Celle-ci est réalisée tous les 15 jours à partir de 8 semaines post induction : 3 imageries maximum pour le temps précoce 10-12 semaines (44 souris concernées) et 8 imageries maximum pour le temps tardif 20-24 semaines(44 souris concernées). Durée de l'anesthésie : 10 min - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour l’administration intra-veineuse de lymphocytes T La cornée est protégée par un onguent durant l’anesthésie générale. Durée de l'anesthésie : moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les souris inductibles élevées n’ont pas de phénotype dommageable car le transgène ne s’exprime qu’après une étape d’induction. Cette induction dans les cellules épithéliales pulmonaires conduit au développement de tumeurs pulmonaires chez 100% des animaux en 3 mois. Les dommages sont causés par le développement des tumeurs pulmonaires qui induisent à long terme une perte de poids importante et une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces permet d’éviter la survenue de douleur en suivant la croissance des tumeurs par imagerie et par suivi du poids des animaux.
Devenir
Mise à mort pour les 20 souris de réforme utilisées dans la procédure sans réveil d’apprentissage de la technique d’administration au niveau du larynx afin de vérifier la qualité du geste technique. Euthanasie des 88 souris induites porteuses de tumeurs pulmonaires pour prélèvement post mortel des poumons et analyse
Remplacement
Ce projet est fondé sur ces observations préliminaires réalisées sur des tumeurs humaines. L’établissement d’un modèle de tumeur pulmonaire murine est indispensable afin d’isoler et de caractériser la fonction de ces CAF. Il sera complété par des approches alternatives ex vivo Seul un modèle in vivo permet de modéliser toutes les interactions cellulaires et d’apprécier l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 108 souris pour 5 ans. L'imagerie des animaux permet des analyses et un recueil de données longitudinales et donc contribue à la réduction du nombre d'animaux Les analyses cellulaires des CAF seront réalisées sur N=6 souris par temps (10-12 sem et 20-24 sem post induction) . Une caractérisation des CAF sera réalisée et une corrélation avec une exclusion des lymphocytes T des ilots tumoraux sera recherchée (test de correlation de Pearson) Le nombre de souris par groupe a été défini à minima tout en permettant une analyse fiable. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée une fois avec le même nombre d’animaux par groupe. 10 souris transgéniques porteuses de tumeurs pulmonaires seront nécessaires à chacun des temps afin d’obtenir suffisamment de CAF pour les analyses de single cell RNA
Raffinement
La bonne connaissance du modèle tumoral, un suivi adapté des points limites (suivi des tumeurs par imagerie et pesées des animaux) et la manipulation des animaux sans stress, sous anesthésie si besoin, par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum le stress et la douleur des souris. Les tumeurs seront mesurées par imagerie. Les animaux sont pesés 1 fois/sem. La grille de score jointe est appliquée pour confirmer le bon état général de l’animal. Les points limites plus spécifiques pour ce modèle sont une perte de poids>20% du poids à l’induction, une dypsnée..
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées qui reproduisent la physiopathologie des tumeurs humaines. Le modèle transgénique choisi ici reproduit la pathologie de certains cancers pulmonaires humains. De plus, de nombreux outils sont disponibles (anticorps, cytokines, souris transgéniques possédant des lymphocytes T spécifiques de tumeurs) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris transgéniques seront induites à l’âge de 3 à 4 mois pour l’expression du transgène et utilisées dans les procédures, 10 à 12 semaines ou 20 à 24 semaines post induction donc âgées de 6 mois à 12 mois. Souris adultes avec un système immunitaire mature
Effets rénaux de la protéine Claudine 14 (Cldn14)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumises deux semaines à un régime riche en calcium, elles sont ensuite anesthésiées pour un prélèvement de sang et l'ablation des reins, qui entraîne leur mort, afin d'étudier le rôle d'une protéine rénale. Le porteur indique que le régime, jugé moins appétent, peut réduire la prise de nourriture et faire perdre du poids, avec des points limites de surveillance. Il affirme qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas restituer la complexité des transports ioniques d'un épithélium rénal.
Objectifs
L’adaptation de l’organisme aux variations des apports de calcium pourrait impliquer la protéine Cldn14 exprimée dans la branche ascendante large de l’anse de Henle (BLAH). L’expression de Cldn14 augmente en régime riche en calcium et, dans des modèles cellulaires de cellules épithéliales, la protéine Cldn14 peut interagir avec la protéine Cldn16. On ne sait ni si ces interactions protéiques existent dans le tissu natif, ni si elles sont nécessaires à l’adaptation de la BLAH, ni s’il est pertinent de chercher des anomalies de la protéine Cldn14 chez les patients ayant une perte rénale de calcium. Objectif: déterminer si l’adaptation du transport de calcium dans la BLAH native, en réponse à une augmentation des apports calciques, implique la protéine Cldn14.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer l'implication (ou l'absence d'implication) de la protéine Claudine 14 dans l'adaptation du rein à un régime riche en calcium. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes d'adaptation des mammifères aux variations de leur environnement, en particulier alimentaire. En effet les apports de calcium peuvent varier considérablement et rapidement en fonction du type de nourriture consommée : une adaptation rapide à ces changements est nécessaire dans le but de maintenir l ‘homéostasie.
Procédures
Les animaux sont soumis successivement - à un régime alimentaire riche en calcium pendant 2 semaines - à une anesthésie terminale au cours de laquelle un prélèvement sanguin puis une exérèse des reins sont pratiqués, entrainant la mort de l'animal
Impact sur les animaux
Le régime riche en calcium peut avoir un gout perçu comme moins agréable que la nourriture standard par certains animaux : dans ce cas, les animaux concernés peuvent diminuer leur prise de nourriture et perdre du poids. L'évolution du poids et la quantité de nourriture consommée font l'objet d'une surveillance et, le cas échéant, des points limites s'appliquent.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure : en effet, des tests fonctionnels rénaux doivent être réalisés à la fin de la procédure, nécessitant le prélèvement des reins sous anesthésie générale et donc l'euthanasie.
Remplacement
Le projet explore les mécanismes de l'adaptation rénale à un régime riche en calcium et permet la mesure directe de transport ionique à travers un épithélium spécialisé intact. La complexité des déterminants des transports ioniques transépithéliaux est telle qu'un modèle cellulaire in vitro ne peut pas la restituer
Réduction
Les méthodes choisies testent directement l’hypothèse énoncée en utilisant la microperfusion in vitro, méthode de référence dans le domaine : cette approche maximise la probabilité d’obtenir des réponses non ambiguës à la question posée. Les données seront comparées par un test de Student pour variables non appariées. Nous utiliserons 20 souris par groupe (10WT et 10KO pour le transport de calcium, 10WT et 10KO pour le transport de sodium) du fait de notre expérience des différences quantitatives attendues et des tests statistiques utilisés. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Les animaux bénéficient d’un environnement enrichi et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Les manipulations des animaux sont réduites au minimum et la seule contrainte imposée est l’alimentation avec un régime riche en calcium pendant 2 semaines. Des points limites ont été définis et les animaux sont l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation constitutionnelle du gène Cldn14, codant pour la proteine Cldn14, a été développé chez la souris Les animaux sont nourris avec le régime riche en calcium à partir de l'âge de 2 mois. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures ; la taille de leur rein permet la dissection d'une branche large ascendante de longueur suffisante pour pouvoir mesurer le transport transépithélial de calcium et celui de sodium
Modèles d’étude pour les pathologies infectieuses humaines : souris humanisées pour le système immunitaire et/ou le foie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.
Objectifs
Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.
Bénéfices attendus
Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.
Procédures
Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.
Remplacement
Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).
Réduction
Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.
Raffinement
Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (