Recherche appliquée

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries seize semaines avec un régime riche en gras et en sucre, elles subissent des jeûnes, des gavages ou injections et des prélèvements de sang à la queue lors de tests de tolérance, avant une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Le porteur affirme que ce régime n'engendre ni douleur ni anxiété d'après l'observation du comportement, et classe en modéré la souffrance liée au jeûne, au gavage et aux prélèvements. Il affirme que l'usage d'animaux est "essentiel", une enzyme clé n'étant pas exprimée par les lignées cellulaires.

Objectifs

Les points de contact entre les mitochondries et le réticulum endoplasmique (RE), appelés MAMs pour Mitochondria-Associated Membranes, ont un rôle crucial dans le contrôle de l'homéostasie glucido-lipidique de l’hépatocyte. Ces plateformes dynamiques peuvent être régulées par différents facteurs, notamment les nutriments. Des données récentes montrent que les MAMs sont altérées dans le foie de modèles murins d'obésité, de résistance à l’insuline et de stéatose hépatique, faisant des MAMs une cible thérapeutique privilégiée pour la prévention ou le traitement des désordres métaboliques hépatiques associés à l’obésité. Ces derniers sont étroitement associés à une diminution de la concentration plasmatique en certains acides aminés comme l'arginine, la glycine et la bétaine. Par ailleurs, des travaux in vitro ont démontré que les acides aminés arginine, citrulline, glycine et bétaine sont capables de réguler les MAMs par des voies de signalisation que l'on peut cibler par des molécules pharmacologiques comme la tetrahydrobioptérine (pour arginine et citrulline) et la S-adenosyl-méthionine (pour la glycine et la bétaine). L'objectif de ce projet consistera à 1) valider l'intérêt d'une supplémentation en acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques (résistance à l'insuline, stéatose) associés à l'obésité, 2) démontrer que les bénéfices santé sont associés à une restauration de d'intégrité des MAMs dans le foie des souris traitées et 3) valider in vivo les voies de signalisation impliquées par l'utilisation de molécules pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à apporter des preuves de concept, d'une part sur l'intérêt de certains acides aminés dans la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité, d'autre de l'intérêt des MAMs comme cible thérapeutique pour la prévention des désordres métaboliques hépatiques associés à l'obésité chez l'Homme. Le projet apportera des connaissances mécanistiques solides pour soutenir une approche très originale et porteuse de potentiel d'innovation pour la santé humaine pour le futur proche.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera en de petits prélèvements sanguins au niveau de la queue lors de tests de tolérance au glucose et au pyruvate qui seront réalisés sur animal vigil, à jeun depuis 6h (tolérance au glucose) ou 10h (tolérance au pyruvate), respectivement. Après anesthésie locale (crème lidocaïne) et incision au scalpel à l'extrémité de la queue, des ponctions de 4-5 µL de sang seront réalisées à la veine caudale avant et 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après gavage oral (pour la moitié des souris) ou injection intrapériotonéale (pour l'autre moitié des souris) de glucose (2mg/g) ou injection intrapériotonéale (pour toutes les souris) de pyruvate (1.5 mg/g) pour suivre la glycémie à l'aide d'un glucomètre. Après le premier prélèvement, les suivants seront réalisés par simple grattage du caillot sanguin. La durée du jeune avant chaque test a été optimisée afin de limiter la nuisance infligée à l'animal tout en garantissant l'obtention d'un résultat métabolique fiable et reproductible, donc interprétable. Les protocoles se termineront par un jeune de 10h avant la mise à mort des animaux. Cette durée de jeune est indispensable pour garantir la qualité des mesures réalisées sur le foie de animaux.

Impact sur les animaux

D’après les premiers protocoles réalisés, 16 semaines de régime riche en gras et en sucre n’engendrent pas de douleur ou d’anxiété comme évalué par l’observation régulière du comportement des animaux, et n'empêchent pas les animaux de bouger dans la cage, notamment pour se nourrir et boire. Par ailleurs, selon les connaissances actuelles, il est peu probable que les interventions nutritionnelles testées aient des effets indésirables sur la santé et le bien-être des animaux. Lors de la mise à mort, l’utilisation de la dislocation cervicale sur animal anesthésié est une méthode rapide qui respecte les réglementations en vigueur pour les petits rongeurs. La douleur associée à la mise à jeun, au gavage ou aux injections intrapéritonéales, et aux prélèvements sanguins à la queue sont des contraintes dont le degré de sévérité est évalué de classe modérée.

Devenir

Les protocoles se termineront après anesthésie des animaux (kétamine/xylazine: 100/20 mg/kg soit 220µL de mélange pour une souris pesant 20g) et mise à mort par dislocation cervicale pour pouvoir récupérer différents tissus et organes. La nécessité de faire des anlayses histologiques et biochimiques justifie la mise à mort pour récupérer les tissus et organes.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l'analyse des effets de régimes sur un organisme complexe, et d'un point de vue mécanistique, l'étude ne peut être conduite sur des lignées cellulaires immortalisées, qui n'expriment pas une enzyme clé impliquée dans nos mécanismes, la GNMT.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été réduit au maximum afin que la taille de l'échantillon permette de dégager des résultats statistiquement fiables sur des souris mâles et femelles.

Raffinement

Nous aurons pour objectif d'optimiser les procédures expérimentales pour réduire au maximum l'inconfort et les stress subis par les animaux. En particulier, nous n'utilisons pas de procédures susceptibles d'induire un dépassement de point limite de souffrance. Le raffinement sera appliqué tout au long de la vie des animaux. Pour cela, nous planifierons les protocoles de façon à éviter les perturbations susceptibles de procurer le stress de l'animal. Les protocoles ont été prévus de façon à obtenir le plus d'informations possibles par animal en imposant en même temps, un "moindre coût" en terme de mal-être de l'animal. Nous utiliserons une procédure d'analgésie pour les prises de sang, et une procédure d'anesthésie et de mise à mort par dislocation cervicale. Enfin, nos procédures de raffinement nous permettront de générer des résultats de meilleure qualité et d'exploiter au mieux les résultats obtenus.

Choix des espèces

Le travail avec des animaux est indispensable pour mimer au plus près la réalité de la surnutrition, de l'obésité et des désordres métaboliques comme dans l’espèce humaine. Le travail en épidémiologie sur l’Homme permet, en effet, de faire des corrélations entre la surnutrition et l'apparition de l’obésité et des désordres métaboliques. Le travail sur l’animal nous permet de montrer un effet causal, des manipulations nutritionnelles sur les paramètres biologiques ciblés et leurs bénéfices métaboliques à l'échelle de l'organe et du corps entier.

Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (

Des symptômes de la maladie d'Alzheimer sont provoqués chez 15 macaques à longue queue adultes, voire âgés, qui reçoivent aussi de la lumière proche infrarouge délivrée par un casque. Ils sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec deux prélèvements de liquide céphalo-rachidien, deux prises de sang et des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas, puis tous tués par perfusion intracardiaque pour des analyses biochimiques et anatomiques. Le porteur affirme que les traitements "ne seront pas douloureux" et n'attend aucune gêne de "l'induction des symptômes", sans décrire cette induction ni la chirurgie pour laquelle il prévoit anesthésique et antidouleur. Il indique aussi que l'espèce de primate sera choisie selon celle qui sera "le plus facilement disponible", en invoquant une pénurie d'approvisionnement.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 15 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une phase de quarantaine et d’habituation - la photobiomodulation durant le temps déterminé par le groupe pilote - 2 prélèvements sanguins durant les procédures 2 et 3 - 2 prélèvements du liquide céphalo-rachidien durant les procédures 2 et 3 - des tests comportementaux - une perfusion intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimique et biochimiques.

Impact sur les animaux

Selon notre expérience et la littérature, les traitements ne seront pas douloureux et un stress pourrait s’observer lors des procédures. Afin de réduire ce stress, la première procédure consistera à habituer les animaux aux actes qui seront réalisés par la suite et de s’assurer de leur coopération. En ce qui concerne la douleur, tout point d’appel conduira à une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres du SBEA, de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire. Dans chaque procédure, nous avons détaillé les signes cliniques à considérer et les actions des expérimentateurs selon la situation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.

Raffinement

afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien-être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.

Choix des espèces

Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Pour l’étude nous allons bien sûr prendre une seule espèce de PNH mais les conditions sanitaires actuelles et la non validation du CEA d’obtenir des PNH d’origine asiatique induisent une pénurie d’approvisionnement des PNH et donc nous chercherons quel PNH est-il le plus simple à obtenir avec les âges voulus. Par la suite, on continuera exclusivement avec la même espèce. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.

59 840 animaux non-humains, en majorité des souris et des rats mais aussi des cochons d'Inde, des hamsters dorés et des gerbilles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent sur 28 jours maximum des administrations répétées de composés candidats médicaments à doses élevées, avec des prélèvements de sang, pour détecter précocement une toxicité. Le porteur indique que la recherche de doses toxiques ou maximales tolérées peut provoquer inconfort, stress, dommages réversibles voire irréversibles et douleur. Il reconnaît que des tests in vitro remplacent déjà des animaux mais affirme qu'il n'existe pas de test couvrant l'ensemble des systèmes biologiques, et cale le nombre d'animaux sur les normes ICH et OCDE.

Objectifs

Le projet a pour objectif : • d’étudier les putatifs mécanismes de toxicité liée à l’administration de la molécule d’intérêt. La détection précoce de toxicité permet d’arrêter le développement d’une molécule avant des études de toxicologie règlementaires couteuses d’un point de vue éthique et économique. Ces effets toxiques pourront être reliés à la concentration circulante du candidat médicament administré grâce à des données de toxicocinétique générées en parallèle. • de déterminer dans le cas de toxicité des biomarqueurs pertinents qui pourront être par la suite étudiés chez l’homme. •de caractériser éventuellement des populations répondeuses ou non à la molécule d’intérêt en associant des méthodes d’analyses ex vivo de génomique, protéomique ou métabolomique

Bénéfices attendus

Le projet vise à détecter très tôt dans le développement de effets de toxicité d'un composés test ce qui obligatoirment impliquerait l'arrêt du développement d’une molécule avant même les études de toxicologie règlementaires coûteuses d’un point de vue éthique, en animaux, et économique. Le projet

Procédures

Les animaux subissent des adminsitrations uniques voire répétées sur 28 jours maximum de composé d'intérêt à des doses élévées afin d'identifier des effets secondaires susceptibles d'être observés chez l'homme. Pour les voies d'administration contraignantes, les animaux sont anesthésiés pour éviter tout inconfort ou souffrance inutile. Des prélèvements de sang sur animaux vigiles ou anesthésié sont également effectués pour mesurer les concentrations du composés d'intérêt dans le sang ou les tissus pour évaluer l'exposition des animaux au composé ou suivre un biomarqueur qui réflète l'évolution de lésions. Le maximum d'administrations quotidienne est de 4 et ceux pendant 28 jours maximum. La durée de ces administrations vont de quelques secondes pour une voie orale à moins d'une heure pour les perfusions longue durée sur animal contraint et à plus d'une heure pour des animaux libre de leurs mouvements. Le maximum de prélèvements de sang est limité au volume totale de sang prélevé sur une semaine qui doit être infèrieur à 10% du volume de sang total. La durée de ces prélèvements n'excèdent pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

La recherche de dose toxiques ou de doses maximales tolérées occasionne de l'inconfort, du stress, des dommages réversibles voire irréversibles et potentiellement de la douleur chez les animaux. Les administrations et les prélèvements répétées de sang sur animal vigile vont également générer du de l'inconfort et du stress sachant que si la voies d'adminsitration ou de prélèvements est jugées douloureuse ou dangereuse pour l'animal ou l'opérateur , l'animal est systématiquement anesthésié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d'étude

Remplacement

De nombreux test in vitro de toxicité remplacent déjà les animaux. Il s'agit de tests orientés sur un organes. Il n'existe pas de tests englobant l'ensemble des systèmes biologiques

Réduction

Le nombre d'animaux est défini par les recommandations internationales comme les normes ICH, OCDE

Raffinement

L'ensemble des procédures contraignantes jugées douloureuses pour les animaux sont faites sous anesthésie générale par inhalation ou par injection de composés à propriétés anesthésiantes. Les étapes de contention sont limitées (

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est défini par les lignes directrices internationales (ex. ICH, CHMP, OECD, WHO, FDA, MHLW) et sur des bases scientifiques telles que la cible thérapeutique visée, le(s) véhicule(s) envisagé(s) et les données disponibles de pharmacocinétique, de métabolisme et de toxicologie in vitro. Le stade adulte est celui utilisé afin de disposer d’animaux dont les systèmes biologiques sont matures. Exceptionnellement, des animaux nouveau-nés pourraient être utilisés si un impact sur le développement de l’animal doit être évalué.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris hémophile reçoit une injection de thérapie génique, des prélèvements sanguins rétro-orbitaux toutes les quatre semaines, puis un test de temps de saignement où l'extrémité de la queue est sectionnée sur trois millimètres. Le porteur indique que les animaux, encore sous anesthésie et ayant perdu du sang, sont tués par dislocation cervicale sans réveil. Il affirme que les tests in vitro ne reproduisent pas l'ensemble du processus de coagulation.

Objectifs

L'hémophilie A est une maladie hémorragique rare affectant principalement les hommes (1 naissance de garçons sur 5000 environ). Il s'agit d'une maladie génétique et le gène affecté est celui du facteur VIII, une protéine clé de la cascade de la coagulation. Si la maladie n'est pas traitée, l'espérance de vie est en moyenne de 15 ans. Le traitement standard de l'hémophilie A repose sur l'injection intraveineuse régulière (2-3 fois/semaine) de facteur VIII soit recombinant, soit purifié à partir de plasma. Ce traitement est lourd et coûteux. Récemment un anticorps thérapeutique qui peut se substituer au facteur VIII a été développé. Cet anticorps (Emicizumab) a montré une très bonne efficacité chez les patients hémophiles A sévères et est désormais approuvé par les autorités de santé. Il est administrable par voie sous-cutanée 1-2 fois/mois. L’Emicizumab ne normalise pas la coagulation mais transforme une hémophilie sévère en hémophilie mineure. De ce fait, un traitement par Emicizumab n’est pas toujours suffisant et doit parfois être utilisé en combinaison avec d’autres agents procoagulants. L’effet de telles associations est encore très mal connu et lors des essais cliniques sur l’Emicizumab, il y a eu malheureusement des accidents pro-thrombotiques et des cas de décès de patients dus à un emballement du système de coagulation. De plus, son utilisation est coûteuse et de ce fait 70% des patients dans le monde n'ont pas accès à ce type de thérapie. L'objectif de ce projet est de répondre à ces 2 limites, le risque de thrombose par utilisation d'un anticorps thérapeutique mimant le FVIII et le coût élevé d'un traitement par injection d'un anticorps purifié de façon régulière. Pour répondre à cet objectif, le but de notre projet est de tester in vivo un nouvel anticorps thérapeutique développé par une biotech, qui comme l’Emicizumab a montré in vitro qu’il corrigeait l’hémophilie. Cet anticorps a montré dans des tests in vitro que contrairement à l'Emicizumab il évitait les thromboses. Il sera exprimé in vivo par l’utilisation d’un vecteur viral qui permettra en une injection une expression sur plusieurs années de la thérapie. Il s'agira de déterminer si cette nouvelle thérapie est efficace pour corriger les saignements anormaux observés chez un organisme vivant hémophile.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de répondre à plusieurs attentes actuelles concernant les traitements des patients hémophiles : 1) Eviter les effets secondaires des nouveaux traitements notamment les risques de thromboses chez certains patients. 2) Utiliser un système thérapeutique, la thérapie génique, éliminant les injections intraveineuses répétées qui sont douloureuses pour les patients. 3) Réduire le coût des traitements et rendre plus accessible les traitements au 70% de la population mondiale hémophile qui n'a toujours pas accès à une thérapie. L'espérance de vie d'un patient hémophile sévère sans thérapie est de 15 ans.

Procédures

Les souris sont injectées vigiles au niveau de la veine latérale de leur queue avec 200 µl d'un solution d'AAV. Elles sont observées pendant 12 semaines avec un prélèvement rétro-orbitalde sanguin toutes les 4 semaines. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane. Au terme des 12 semaines de suivi, un test de temps de saignement sera réalisé afin de vérifier l'efficacité fonctionnelle de l'anticorps exprimé. Le test de temps de saignement sera réalisé sur les souris sous anesthésie (l’extrémité de la queue de la souris est sectionnée sur 3 mm à l'aide d'un scalpel stérile). Les animaux sont gardés en vie au maximum 35 minutes lors du test de coupure de l’extrémité de leur queue (5 minutes pour l'anesthésie, suivie de 30 minutes pour le test de saignement).

Impact sur les animaux

Pendant les 12 semaines maximums de suivi de l'expérience, les souris hémophiles à la suite de l'injection de la thérapie génique risquent principalement de développer des hémorragies. Pendant le temps de saignement, l'animal sera sous anesthésie par un mélange Xylazine (10 mg/kg) –Kétamine (100 mg/kg). Si pendant cette période, l’animal présente des signes de réveil, une nouvelle dose d’anesthésiant sera administrée (demi-dose par rapport à la dose initiale).

Devenir

Tous les animaux sont encore sous anesthésie à la fin de la procédure où ils subissent un test de saignement qui dure 30 minutes. Ils auront alors perdu pour certain un volume de sang important. Il est plus éthique de ne pas réveiller les souris utilisées dans la procédure de ce projet et de les euthanasier par dislocation cervicale.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, autant des molécules procoagulantes que leurs inhibiteurs mais aussi des phospholipides membranaires, des cellules sanguines, les vaisseaux sanguins et les tissus. Actuellement les tests disponibles in vitro, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Par conséquent, afin de tester l’efficacité anti-hémorragique du Bi8 via thérapie génique, il est crucial de pouvoir tester son effet dans un modèle animal d'hémophilie A.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à l’ensemble de l’étude a été défini pour chaque procédure de façon à avoir une réponse statiquement analysable sur tous les paramètres mesurés. Les mêmes souris permettront de mesurer différents paramètres : taux d’expression de l'anticorps thérapeutique, efficacité du traitement à restaurer la coagulation, effet du traitement sur le bien-être et sur la survie de l’animal, sur le bilan de cellules sanguines. Nous prévoyons d’utiliser 50 souris déficientes en FVIII pour ce projet.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec des groupes sociaux stables sans isolement, un accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement du milieu : morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid, en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Les animaux seront suivis individuellement et ils seront obligatoirement euthanasiés aux points limites définis dans la procédure. L’anesthésie générale sera induite dès la sortie du groupe afin d’éviter tout stress. L’ensemble des expériences sera effectué par une personne habilitée à expérimenter sur animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin d'hémophilie A (souris déficientes en facteur VIII) est bien caractérisé et a été utilisé dans la littérature scientifique comme un modèle préclinique valide d’hémophilie, reproduisant la pathologie humaine et permettant ainsi les tests de nouvelles thérapies anti-hémorragiques notamment la thérapie génique. Les souris seront injectées entre 6-12 semaines lorsqu'elles auront atteint un poids de 18-25 gr. La durée de suivi des expériences de thérapie génique (6-12 semaines) est alors compatible avec une fin de procédure à un âge compris entre 12 et 24 semaines. A ce stade, leur poids est tout à fait compatible avec la réalisation des expériences de saignement pour tester l'efficacité de la thérapie.

158 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre heures pour poser une prothèse, puis un isolement pouvant durer soixante jours et plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie, pour mesurer le couplage neurovasculaire par TEP et ultrasons en neuropharmacologie. Le porteur indique que la fenêtre crânienne empêche de regrouper ou d'adopter les rats, qui sont donc euthanasiés dès la dernière acquisition. Il juge "indispensable" le recours à des animaux vivants, la modélisation et l'in vitro ne restituant pas ces interactions.

Objectifs

La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d’imagerie qui permet d’étudier la fixation d’un médicament sur sa cible cérébrale. L’imagerie ultrasonore (US) permet quant à elle d’étudier les variations du débit sanguin cérébral qui sont la conséquence de l’effet des médicaments sur le cerveau (réponse hémodynamique). L’objectif de ce projet est d’associer ces deux modalités de neuro-imagerie innovantes de manière simultanée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau. Le phénomène de pharmacorésistance ou la tolérance à certains médicaments pourrait s’expliquer par une réponse hémodynamique atténuée lors de l’interaction du médicament avec sa cible. Cela pourrait s’expliquer par un déficit des mécanismes de couplage entre les cibles neuronales et la réponse hémodynamique, c’est-à-dire le couplage neuro-vasculaire. On pense que la qualité du couplage neuro-vasculaire peut être appréciée in vivo en mesurant les paramètres TEP et US de manière simultanée. L’imagerie hybride TEP/US sera réalisée chez le rats témoins. Certains animaux recevront un médicament testé à dose unique et/ou après un traitement prolongé. L’os du crâne atténue les US. Une « fenêtre » chirurgicale devra donc être mise en place sur chaque animal. Cela consiste à ôter et remplacer une partie de l’os du crâne par une résine dans des conditions d’asepsie et sans générer de douleur. La chirurgie et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Au total, 158 rats seront utilisés sur 5 ans. Cela permettra d’optimiser les conditions expérimentales et de suivre les effets de 4 protocoles de traitements médicamenteux différents. Compte tenu des contraintes techniques liées aux traitements et aux modalités d’imagerie, la taille des groupes a été fixée à 8 rats par groupe. Les traitements étudiés sont des médicaments parfaitement connus, déjà utilisés chez l’animal voire chez l’Homme: ils n’induisent pas de toxicité. Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine. Ils feront aussi l’objet de mesures de comportement simples et peu génératrices de stress comme la mesure de l’activité locomotrice. Ce protocole ne peut pas être remplacé par des études de pharmacologie in vitro qui permettent seulement de mettre en évidence l’interaction d’une molécule isolée avec une cible ou un système biologique isolé. Seules les expériences in vivo récapitulent la complexité et l’ensemble des effets des médicaments sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Actuellement, chacune de ces techniques est utilisée séparément en routine en recherche préclinique. Réalisées en même temps, elles permettront de diviser au moins par 2 le nombre d’animaux nécessaires par rapport à l’utilisation de l’imagerie TEP puis US isolées. Surtout l’approche simultanée TEP-US ne nécessite pas le sacrifice de l’animal, il sera donc possible de réaliser plusieurs sessions d’imagerie chez un même animal pour mesurer l’évolution de l’effet des médicaments au cours du temps. Cela permettra de diminuer encore plus le nombre d’animaux grâce à la puissance des tests statistiques appariés. A terme, ce protocole devrait permettre d’offrir une méthode d’imagerie optimisée pour mieux comprendre l’effet des médicaments sur le cerveau et de mettre en évidence des mécanismes de tolérance ou de résistance.

Procédures

1. Procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Temps=4h 2. Isolement à 1 animal par cage afin de préserver l’intégrité de la prothèse, pendant 60 jours maximum avant euthanasie (le temps de réaliser les traitements et les sessions d’imagerie, en prenant en compte un risque d’échec de radiosynthèse du traceur et la reprogrammation des examens). 3. Les animaux utilisés pour la mise au point de l’acquisition US pourront participer à 5 acquisitions US de 90 min maximum, sous anesthésie générale, espacées de 48h au minimum. 4. Maximum 2 acquisitions espacées de 7 jours au minimum en TEP-US sous anesthésie générale incluant injections i.v par cathéter caudal Temps 90 min 5. 1 traitement chronique, quelques minutes quotidiennement, sur animal vigile pendant 15 jours maximum 6. Etude du comportement pendant 15 min, au maximum 2 fois par jour pendant la durée du traitement (15 jours maximum).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale est conduite sous anesthésie générale et des analgésiques sont également utilisés. La récupération post-opératoire inclut un traitement antalgique. Aucune douleur n’est attendue. Les injections nécessaires à l’enregistrement TEP-US se font également sous anesthésie générale à l’isoflurane. Pas de douleur attendue. Les animaux ne peuvent pas s’arracher la prothèse crânienne qui est parfaitement solidaire de l’os et qu’ils ne peuvent pas voir ou sentir. Cependant, afin de les protéger des conflits avec leurs congénères, les animaux opérés sont hébergés individuellement par cage, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’hébergement individuel en cage transparente et ouverte, à côté d’autres cage, permet ainsi un partage de l’odorat et du visuel avec les autres animaux présents dans le cages voisines afin de minimiser l’effet négatif sur le bien-être animal. De plus, un enrichissement supplémentaire tel qu’un deuxième matériel de nidification sera ajouté. Les médicaments testés auront vraisemblablement un effet sur le comportement (apathie, diminution ou augmentation de l’activité locomotrice) mais ne sont aucunement toxiques pour l’animal aux doses testées. Le stress induit par l’administration des médicaments sur animal non anesthésié est limité par une habituation à la manipulation préalable. Pour les injections répétées, les sites d’injection parentérale seront alternés afin de ne pas induite de lésion au point d’injection.

Devenir

La présence d’un volet chirurgical au niveau du crâne empêche le rassemblement avec d’autres rats et une adoption ultérieure : les animaux opérés seront donc euthanasiés dès que possible, soit immédiatement après la dernière acquisition TEP-US.

Remplacement

Ni la modélisation informatique ni l’expérimentation sur cellules in vitro ne permettent encore d’appréhender les processus complexes relevant de mécanismes impliquant des interactions entre neurones, cellules gliales et réseau vasculaire, dans un contexte de régulation circulatoire sanguine. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux vivants capables d’exprimer les troubles neurologiques et de valider les biomarqueurs d’imagerie étudiés. Au maximum, toutes les adaptations possibles de l’imagerie US (sensibilité, résolution spatiale, résolution temporelle…) seront mises au point au préalable sur des objets en plastique remplis d’eau ou de gel qui miment les propriétés physiques de la tête et du cerveau. Néanmoins, 30 rats seront tout de même nécessaires pour finaliser la mise au point de cette nouvelle technique d’imagerie : les données collectées sur ces animaux serviront à l’élaboration d’un référentiel (animaux non traités), ce qui permettra au final de réduire le nombre de sujets nécessaires. La réalisation d’une imagerie US sur tout la profondeur du cerveau directement chez l’Homme n’est pas possible à ce jour du fait de l’épaisseur de la boite crânienne.

Réduction

L’utilisation conjointe des deux techniques (imagerie TEP et ultrasonore (US)) permet de diviser par deux le nombre d’animaux actuellement nécessaire à la collecte séparée de données TEP et US indépendamment l’une de l’autre. De plus, ces techniques d’imagerie permettent d’étudier plusieurs régions cérébrales en même temps, dans l’ensemble du cerveau. Pour la mise au point de la méthode : 30 rats serviront à l’apprentissage de la technique chirurgicale et à la mise au point des paramètres physiques de la méthode TEP-US. Ce nombre pourra être revu à la baisse si les objectifs sont atteints avec un nombre inférieur d’animaux. Pour l’étude de l’effet de 4 traitements dont la tolérance chez l’animal voire chez l’Homme est parfaitement connue, le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé grâce à une planification précise afin d’en réduire au maximum le nombre. Il a été estimé à 128 pour les 5 ans à venir. Ce nombre est un minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant chirurgie : Les animaux seront acclimatés pendant les 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d’humidité de l’animalerie. Ils seront deux par cage (enrichie en tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et papier Kraft). Il y aura une période d’habituation des animaux aux manipulations par les personnes intervenantes sur ce projet avant toute expérimentation. Après chirurgie : Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et en étant vigilant sur les conditions d’asepsie. Une surveillance continue de l’état de l’animal aura lieu de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux seront observés individuellement tous les jours et pesés 3 fois par semaine. Le traitement sera administré en fonction du poids des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats adultes jeunes et matures sexuellement (180-250g au début de l’étude). Ils pourront être étudiés pendant un maximum de 3 mois après la réalisation de la chirurgie. Cet âge a été choisi car les animaux sont suffisamment matures dans leur développement mais leur taille reste compatible avec les outils d’acquisition qui sont réalisés dans un espace restreint.