Recherche appliquée

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.

Procédures

270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)

Impact sur les animaux

Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).

Devenir

Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.

Remplacement

Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.

Raffinement

Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis la greffe chirurgicale d'un fragment de tumeur gastrique sous la peau, pour tester si cette vaccination ralentit le développement tumoral. Le porteur indique qu'une tumeur va croître et pourrait gêner les déplacements, avec une douleur modérée en cas d'ulcération. Il qualifie la vaccination de modèle "gold standard" dans la littérature et affirme qu'un passage à l'"organisme entier" est "indispensable" après la phase in vitro.

Objectifs

Notre projet repose sur une procédure de vaccination chez la souris en lui administrant des cellules traitées qui induirait une MCI (mort cellulaire immunogène). Cette MCI induite par vaccination permettrait de ralentir ou d’empêcher le développement de tumeur, induite dans un second temps chez les souris vaccinées en procédant à l’implantation d’une tumeur de cancer gastrique en sous-cutané. Cette procédure est considérée, dans la littérature, comme le " gold standard" permettant de démontrer l'induction de la MCI. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité.

Bénéfices attendus

Le cancer gastrique (CG) est un cancer très agressif associé à une médiane de survie de 10 mois et à un taux de survie à 5 ans inférieur à 25%. La stratégie thérapeutique actuelle repose sur la chirurgie combinée à la chimiothérapie à base de sels de platine (oxaliplatine). Ce traitement est agressif, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et le pronostic de ces tumeurs reste sombre. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur CG. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothèse qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées déjà utilisées dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particulière qui stimule le système immunitaire. Le but ultime est d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement des cancers gastriques.

Procédures

Les 36 souris engagées dans ce projet subiront d'abord une injection sous-cutanée. Une semaine plus tard, un fragment de tumeur de la même lignée cellulaire sera implantée en sous-cutanée . Cette intervention nécessite une anesthésie, en effet, une incision est faite sur le flanc droit pour insérérer le fragment tumoral et un point de suture est réalisé pour refermer. Les animaux sont ensuite suivis durant maximum 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux engagés dans ce projet subiront une première injection (vaccination) en sous-cutané au niveau du flanc gauche. Une semaine plus tard, une chirurgie sera pratiquée pour implanter en sous-cutané un fragment de tumeur sur le flanc droit des mêmes animaux. Cette étape nécessite de faire une incision de la peau sur quelques millimètres et donc de faire un point de suture après l’implantation. Cette chirurgie dura une quinzaine de minutes. Un développement de tumeurs est attendu sur les animaux. Les tumeurs grossiront et pourront gêner les souris dans leurs déplacements. Si la peau au niveau de la tumeur devait s'ulcérer, une douleur modérée pourrait apparaître.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. En effet, la démonstration la plus robuste de ces phénomènes repose sur la vaccination de modèles animaux. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum 36 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été définis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole limitant ainsi dans le temps la souffrance et le stress potentiels.

Choix des espèces

La preuve d'une Mort Cellulaire Immunogène (MCI) complète nécessite des éléments in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche vaccinale est la seule approche admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale. Il nous est donc indispensable, après la phase in vitro de passer à un modèle d'organisme entier, ici la souris. Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6 à 8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales du foie, par chirurgie dans l'organe ou par injection sous la peau, puis des traitements par voie intrapéritonéale ou par plasma froid et un suivi par imagerie sous anesthésie, pour évaluer de nouvelles thérapies des cancers hépatiques. Le porteur indique que la contrainte principale tient au développement tumoral et prévoit des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.

190 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'implantation sous la peau de pompes délivrant de l'angiotensine II pour accélérer une atteinte cardiaque, puis des prélèvements de sang, des épreuves de course sur tapis roulant et des échographies sous anesthésie, pour tester une thérapie génique de la glycogénose de type III. Le porteur indique attendre un possible dommage rénal lié à l'angiotensine, jugé limité par la durée courte d'administration. Il affirme que le mécanisme de défense contre les virus est "impossible à recréer en laboratoire" et que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

-Etudier l’efficacité d’une approche de thérapie génique pour la glycogénose de type III (GSD III) dans un nouveau modèle rat de la pathologie présentant une hypertrophie du ventricule gauche à 9 mois. -Administration de l'Angiotensine II pour accélérer le développement du phénotype cardiaque afin d’évaluer l’effcicacité des produits de therapie génique sur le traitement ou la prévention de l’apparition de la pathologie cardiaque.

Bénéfices attendus

Développement d’un traitement de thérapie génique pour la glycogénose de type III

Procédures

-Implantation de les pompes d’Ang II. Procédure chirurgicale légère car l’implantation se fait sous le peau. La procédure d'implantation durera 10 minutes maximum. Les pompes resteront sous le peau un maximum de 14 jours. -Prélèvements du sang sont réalisés sur animal anesthésié lors d’un prélèvement au sinus rétro-orbitaire ou sur animal vigile à la veine sous-maxilliare. La procédure de prélèvement de sang est rapide, 5 minutes maximum de l’endormissement de l'animal à son réveil après le prélèvement. Pour le prélèvement dans la veine sous-mandibulaire, le prélèvement durera entre 30 sec et 1min maximum. -Evaluation fonctionnelle: tapis roulant (course maximum 10 minutes) et wirehang (moins d'un minute). -Echocardiographie et ECG sur animaux anesthésiés : la durée maximale sera de 15 minutes pour chaque procédure de l’endormissement au réveil de l’animal après les examens.

Impact sur les animaux

Le dommage collatéral que pourrait causer l’administration d’Ang II pourrait être le développement d’un dommage rénal, car l’effet direct est l’augmentation de la tension artérielle. Par contre on n'éspère pas avoir un dommange rénal car le temps de dosage sera que de 15 jours.

Devenir

Ils seront éuthanasiés par surdosage d’anesthésique (0,35 ml/kg d'EUTHASOL en tant que 140mg de pentobarbital sodique par kilo) à la fin du protocole afin de prélever les tissues: coeur, foie et muscles squelettiques pour analyser en premier lieu l'accelaration de la cardiomyophatie avec l'infusion de la AngII (fibrose et hypertrophie des cardiomyocites), asin que la correction par nos produits de therapie genique de la cardiomyopathie et de la pathologie musculaire et du foie présent chez les patients GSDIII et que le modèle de rat reproduit.

Remplacement

Dans le cas particulier des maladies génétiques, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le cDNA de l’enzyme GDE (enzyme de débranchement du glycogène) jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire. Le recours à l'animal est donc indispensable pour vérifier le pouvoir thérapeutique des virus modifiés que nous utilisons. Nous testerons les virus que nous avons sélectionnés après nos premières expériences réalisées sur des cellules: tous les virus qui ne produisaient pas suffisamment d’enzyme GDE fonctionnelle ont ainsi été éliminés.

Réduction

Lors de la procédure 1, nous identifirons la dose, l’âge et le temps d’administration optimals de l’Ang II, cela nous permettra d’utiliser ces paramètres dans les procédures suivantes. Nous réaliserons une analyse statistique afin d'avoir le nombre d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée. Nous avons utilisé un test unilatéral standard de comparaison des moyennes afin d’avoir 90% de chance (Z1-β=-1.282) de détecter une baisse de la force chez le rat GSDIII avec un risque d’erreur de 5% (Z1-α =-1.645). Formule : n=2*((σ²/Δ²)*(Z1-α+Z1-β)²) - σ :déviation standard attendue (σ=0,261) - Δ : différence entre les moyennes (Δ=0,4998) D’où n=5 rats GSDIII par groupe.

Raffinement

Prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire sur rat vigile ou à la queue sur rat anesthésié pour mésurer la glycemie. L'échocardiographie est non invasive et sans douleur, mais pour réaliser cet examen dans les meilleures conditions pour les animaux, les rats seront anesthésiés par voie gazeuse, ça sera aussi le cas pour l'ECG. La minipompe d’Ang II est placée sous la peau des rats anesthésiés par voie gazeuse.

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle rat car dans un autre modèle rat de glycogénose de type II (maladie de Pompe), une atteinte cardiaque majeure a été identifiée. Le rat GDS III est le modèle de la glycogénose de type III, voilà pourquoi nous utiliserons ce rat et non le rat GDS II qui est le modèle pour la glycogénose de type II. De plus, le modèle rat a une taille qui permet de mieux étudier la morphologie du coeur par échocardiographie. Les procédures 1-2 nous permettront de définir la dose et le temps d'administration de l'Ang II ainsi comme la durabilite du phenotype apres l'enlevement des pompes. L'expérience que nous avons chez la souris et les rats nous a montré que les animaux accumulent du glycogène à partir de la naissance et qu'ils montrent un phénotype d'hypoglycemie à partir de 6 semaines. Donc nous utiliserons des rats de 6 semaines minimun.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, pour tester si une vaccination prévient l'apparition de tumeurs des voies aérodigestives. Le porteur indique que des tumeurs sont attendues, au moins dans les groupes témoins, et prévoit des points limites de taille et d'aspect. Il affirme que le recours à des souris immunocompétentes est "indispensable" et invoque le même fond génétique de l'"organisme entier" pour éviter le rejet de greffe.

Objectifs

Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) définissent un groupe hétérogène de tumeurs malignes qui se développent au dépend de l'épithélium des voies aérodigestives supérieures (cavité orale, pharynx et larynx). Les CETC sont le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde, avec plus de 600 000 cas diagnostiqués chaque année. Leur incidence est particulièrement élevée en Europe de l'Ouest, et dans le Nord et le Nord-Est de la France (23 cas/100.000 habitants). Les CETC diagnostiqués à un stade précoce sont traités par radiothérapie ou chirurgie, et le pronostic est bon avec une survie globale à 5 ans d'environ 90%. Cependant, la majorité des CETS sont diagnostiqués à un stade localement avancé. La prise en charge de ces tumeurs de haut grade est multimodale et repose sur la combinaison de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie à base de platine. Malgré des modalités de traitement agressives, le pronostic des CETC ne s'est que marginalement amélioré au cours des trois dernières décennies, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 45-50 %. Ces traitements sont agressifs, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et malgré cela, le pronostic de ces tumeurs reste sombre, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 50%. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur ORL. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothese qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées deja utilisees dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particuliere qui stimule le systeme immunitaire. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter leur efficacité. L’enjeu de ce projet est donc la réalisation d’une expérience d’immunisation (vaccination) sur de modèles murins de cancer et l’évaluation de la capacité de cette vaccination à prévenir l’apparition ou la progression tumorale de manière prophylactique.

Bénéfices attendus

Cette approche nous permettra d’établir si les protocoles de vaccination que nous avons mis au point sont capables de mobiliser le système immunitaire. Si une action anti-tumorale prophylactique est démontrée, cela permettra d’établir un rationnel solide sur l'induction d'une MCI. Cette mort cellulaire immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité pour des stratégies thérapeutiques futures.

Procédures

Chaque souris engagée dans ce projet sera d'abord injectée en sous-cutanée avec une suspension cellulaire pour la phase de vaccination. Une semaine plus tard, une deuxième injection sous-cutanée de suspension de cellules tumorales sera réalisée pour induire une tumeur.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 2 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle. Ce geste ne devrait pas engendrer de douleur ou de souffrance particulière. La deuxième injection a pour but d'effectuer une greffe tumorale. Nous nous attendons donc à observer l'appartition de tumeurs, au moins pour les groupes témoins si la vaccination devait être un succès. Les souris seront surveillées tous les jours afin d'observer leur état général (état du pelage, comportement...). Des points limites sont définis (aspect et taille de la tumeur par exemple) pour pouvoir soustraire un animal avant qu'une souffrance ou une douleur ne s'installe.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients. La démonstration de capacité de notre protocole vaccinla à induire une MCI complète nécessite des éléments de preuves in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche est la seule admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum de 120 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été établis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de la lignée C57BL/6. Ceci se justifie par le fait que les lignées cellulaires que nous allons utiliser sont dérivées de carcinome ORL de souris C57BL/6. Il est indispensable que les lignées cellulaires et l'organisme entier utilisé pour cette étude que faut le même fond génétique pour éviter un phénomène de rejet de greffe (les souris C57BL/6 étant immunocompétentes). Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6-8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.

2 112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations mimant la sclérose latérale amyotrophique et subissent des chirurgies cérébrales, implantation de pompes, pose d'électrodes sous-durales et injection intracérébrale, puis des tests glycémiques, métaboliques et des tests comportementaux non détaillés sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les chirurgies provoquent des douleurs atténuées par des analgésiques et prévoit de retirer un animal dont l'état ne s'améliore pas sous 48 heures. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal dont l'hypothalamus est bien caractérisé et conclut que la souris ne "saurait être remplacée".

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), la plus fréquente des maladies du système moteur adulte (2 à 3 nouveaux cas pour 100 000 habitants), reste une pathologie incurable et présente un pronostic extrêmement sévère, conduisant au décès, 2 à 5 ans après l’apparition des premiers symptômes. La SLA présente des formes sporadiques (90%) et familiales (10%). Diverses lignées de souris transgéniques ont été mises au point, récapitulant les symptômes de la maladie : une dégénérescence des neurones moteurs cortico-spinaux et des motoneurones spinaux, une dénervation des muscles striés squelettiques accompagnée d’une atrophie musculaire et d’une paralysie progressive se finissant par la mort. Ces lignées transgéniques sont à la base des recherches expérimentales dans le domaine de la SLA. Outre les symptômes moteurs, la SLA est aussi accompagné par une perte de poids très importante (chez l’homme et modèles murins) due à une diminution de la prise alimentaire, associée à un changement de la dépense énergétique. Il a été observé récemment que les modèles transgéniques ont aussi des dysfonctionnements du sommeil et du métabolisme. Ces altérations à l’origine de ces symptômes n'ont pas encore été demontrees. Chez la souris, l’hypothèse expliquant les bases cellulaires de ces dysfonctionnements sont un défaut fonctionnel des neurones hypothalamiques impliquées dans la régulation de la balance énergétique, la prise alimentaire et le sommeil. Ceci suggère l’existence d’un défaut hypothalamique touchant le contrôle de la prise alimentaire et la qualité/quantité de sommeil aussi chez le patient SLA. De plus d'un point de vue moléculaire, il a été montré que l'une des molécules impliquées dans la maladie, est un élément central de l’horloge interne. Ce dernier gène particulièrement contrôle de façon remarquable le rythme de prise alimentaire et le sommeil. Ceci faisant le lien entre la pathologie étudiée et les problèmes de l'horloge interne. Nous investiguerons donc, dans cette etude, le sommeil et le metabolisme de ces lignees transgeniques mimant la SLA.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront de déterminer si les défauts fonctionnels de l’hypothalamus peuvent être reversés et ainsi ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour la SLA. Au-delà de la SLA, ce projet est destiné à contribuer à l’effort commun de recherche sur l’étiologie des maladies neurodégénératives du système moteur.

Procédures

Les animaux subiront des procédures chirurgicales (implantation de pompes iPRECIO durée 2h, implantation d’électrodes subdurales durée 3h, injection intracérébrale durée 2h) en plus de test glycémique (durée 2h), comportementaux et métaboliques. Ces expériences dureront maximum 35 jours et prennent en compte le développement de la pathologie dans les 2 lignées transgéniques. Les prélèvements ne seront fait qu’en phase terminale d’une procédure.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à des douleurs causées par les procédures chirurgicales qui seront atténuées par des antalgiques et analgésiques avant, pendant et après la chirurgie ainsi qu’une surveillance quotidienne pendant la période de récupération des souris. Nous préviendrons toutes infections par l’apport d’antibiotique a la fin des procédures chirurgicales. Enfin, nous ne laisserons aucune souris dans la souffrance en nous référant à la feuille en Annexe 1. Il sera pris la décision de sortir une souris de l’étude si les conditions de la souris ne montrent pas d'amélioration sous 48 heures.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour des analyses biochimiques et immunologiques, après avoir collecté sang, tissus et organes.

Remplacement

La SLA est une maladie d’origine multifactorielle et multicellulaire. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré de cette pathologie. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent, en outre, une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, les animaux destinés aux analyses biochimiques ou histologiques seront au préalable inclus dans les études fonctionnelles. Le nombre de souris incluses dans ce projet a été précisément calculé à partir des observations faites dans le laboratoire lors d’études préliminaires ce qui a permis de calculer la puissance statistique et d’éviter les biais de taille d’effet (nombre suffisant permettant l’exploitation statistique). Le logiciel GPower nous a permis de calculer le nombre minimum nécessaire par groupe à 24. Secondairement lorsque les données seront récoltées nous utiliserons une analyse statistique ANOVA à un facteur avec une analyse post-hoc pour analyser les résultats.

Raffinement

Les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions d’hébergement conformes à la réglementation en vigueur. L’enrichissement de l’environnement des animaux (coton compressé pour faire des nids, maisons en plastique rouge), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront de s’assurer de leurs bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Des points limites (perte de poids, difficultés métaboliques, etc.) permettant de soustraire l’animal à la souffrance ont été établi. De plus, nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de pré-anesthésie, d’anesthésie et de prise en charge analgésique en cas de procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle important et pertinent dans l’étude de la SLA. Pour intégrer la complexité de la pathologie, et notamment des implications du dysfonctionnement de hypothalamus, il est indispensable de travailler avec un modèle animal possédant une structure hypothalamique bien caractérisée. De plus, les modèles transgéniques de souris sont des modèles expérimentaux très puissants (génétique connue, commercialisation d’outils moléculaires, etc.). En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal choisi ne saurait être remplacé par un autre. Les animaux seront utilisés à partir de 30 jours, au moment du sevrage, car l’injection de DREADDS nécessite d’être faite sur des souris âgées de 30 jours car le DREADDS est laissé 15 jours avant de pouvoir conduire un quelconque effet. Pour les pompes iPRECIO et l’EEG des animaux de 65 jours seront utilisés pour pouvoir observer les effets au stade présymptomatique.