Recherche appliquée

192 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent une injection dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique ou une injection intraveineuse, puis sont gardées trois mois avant une mise à mort permettant l'analyse des neurones et des synapses. Le porteur affirme qu'aucune méthode autre que ces modèles animaux ne permet d'étudier la perte progressive de neurones adultes. L'étude cherche à savoir si moduler une protéine, l'APOE, protège contre la maladie d'Alzheimer, cible thérapeutique évoquée au conditionnel.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par une perte de synapses et de neurones, la perte de synapses étant corrélée au déclin cognitif. Des mutations dans les gènes codant pour l’ « Amyloid Protein Precursor » (APP) ou ses enzymes de clivage Presenilins (PS) 1 ou 2 entraînent des formes familiales précoces de MA. A l'opposé, l’isoforme APOE2 de l'Apolipoprotéine E procure une résistance exceptionnelle à la maladie. De plus, un individu homozygote pour la mutation APOE3ch ne présente pas de détérioration intellectuelle à 70 ans en dépit d’une mutation dans PS1 qui entraine normalement un début d’altération cognitive vers 45 ans. Les protéines APOE2 et APOE3ch sont caractérisées par une faible affinité pour leurs récepteurs, et donc une diminution de leur internalisation. Ces données indiquent qu’une réduction de l’internalisation (perte de fonction) ou une augmentation de la concentration extracellulaire d’APOE pourraient exercer un effet protecteur contre la MA. Nous avons pour objectif de déterminer si les pertes de synapses et de neurones observées dans un modèle transgénique murin de MA pourraient être réduite par une perte de fonction de l’APOE induite par une diminution de son expression, ou au contraire par une augmentation de la concentration extracellulaire d’APOE.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de déterminer si la modulation positive ou négative des niveaux d'APOE est une cible thérapeutique envisageable pour la MA.

Procédures

Les procédures utilisées reposent sur la réalisation d’une chirurgie unique (injection stéréotaxique) sur animaux anesthésiés/analgésiés, ou sur une injection intraveineuse unique sur animal vigile, et le maintien de l'animal en cage d'habitation pendant 3 mois. La procédure de chirurgie dure une heure, celle d'injection intraveineuse dure 5 minutes.

Impact sur les animaux

La réalisation d’une chirurgie nécessite de placer la souris dans un cadre stéréotaxique (contention au niveau des incisives et des oreilles), puis de réaliser une incision de la peau sur le crane, une fenêtre cranienne, et enfin une suture. Cela est effectué sous anesthésie, mais pourrait entrainer des douleurs post-opératoires. Nous administrons donc un antalgique en pré- et postopératoire.

Devenir

Nous étudions les effets d'une diminution ou d'une augmentation d'APOE sur le maintien des synapses et des neurones chez des souris adultes modèles de MA. Comme ces pertes deviennent significatives à 6 mois, et que nous modifions les niveaux d'expression par des injections d'AAV chez les souris de 3 mois, nous devons attendre 3 mois après chaque procédure pour analyser les effets. Les effets sont analysés suite à une procédure terminale permettant leur mesure. L'euthanasie des souris est nécessaire pour les analyses post-mortem des effets des traitements sur le nombre de neurones et de synapses.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de synapses et de neurones adultes, comme ce qui se produit dans la maladie d’Alzheimer.

Réduction

Nous utiliserons au total 192 souris. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux étant définie en fonction de nos expériences antérieures pour nous permettre de générer des données reproductibles et donc solides

Raffinement

Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) et régulière des animaux (pelage, comportement, locomotion, etc) est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie ; (iii) les chirurgies sont réalisées dans les conditions usuelles d'anesthésie-analgésie, avec un traitement analgésique et un suivi post-opératoire. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, de perte de poids importante, l’avis du vétérinaire sera demandé, et si il le recommande les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris transgéniques modèles de MA. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Chez ces souris adultes les AAVs seront injectés avant que les pertes de synapses et de neurones ne soient observées, et leurs effets seront analysés 3 mois plus tard, quand ces pertes sont significatives.

140 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ces rats d'une lignée naturellement atteinte d'une maladie du foie reçoivent des injections intraveineuses et de nombreuses prises de sang sur deux mois, tantôt vigiles sous contention, tantôt sous anesthésie. Le porteur indique que le traitement testé peut provoquer des réactions allant jusqu'au choc anaphylactique, une hypotension ou des troubles rénaux, et affirme que le recours à l'animal est obligatoire pour le développement clinique. L'objectif est d'élargir l'accès à la thérapie génique aux patients porteurs d'anticorps, retombée renvoyée à la clinique future.

Objectifs

Aujourd’hui, dans le cadre d’une utilisation clinique de la thérapie génique utilisant un virus adeno-associé recombinant, seuls les patients séronégatifs, c'est-à-dire ceux qui ne possèdent pas d’anticorps préexistants dirigés contre ce virus, peuvent bénéficier du traitement. Cette réponse en anticorps est variable selon le type de virus adeno-associés : les études ont montré que 5% à 70% de la population possèdent des anticorps neutralisants, y compris parmi la population pédiatrique. Cette forte immunisation limite considérablement l’accèssibilité au traitement. Pour remédier à cela, différentes approches ont été explorées au cours des dernières années : (i) immunomodulations pharmacologiques ou physiques, telles que l'utilisation d'immunosuppresseurs ou de la plasmaphérèse, (ii) ingénierie des virus recombinants pour contourner les défenses immunitaires, etc... mais aucune de ces techniques ne permet aujourd’hui l’inclusion des patients séropostifs, c'est-à-dire les patients qui possèdent les anticoprs, dans les essais cliniques. L'utilisation de l’imlifidase, une enzyme d'origine bactérienne capable de dégrader les anticorps humains, semble être une approche très prometteuse que nous souhaitons développer jusqu’à la clinique. Notre laboratoire a conçu un virus adeno-associé recombinant spécifique pour traiter le syndrome de Crigler-Najjar, une maladie métabolique extrêmement rare (1 naissance sur 1 million en France). Il est important de permettre à tous les patients atteints par cette maladie, y compris aux patients séropositifs, de bénéficier de ce traitement. Pour cela, nous souhaitons étudier l'efficacité de l'imlifidase à éliminer les anticorps préexistants dirigés contre notre virus recombinant et évaluer ses potentiels impacts sur la thérapie génique pour Crigler-Najjar. Ces études seront réalisées chez le modèle animal de cette pathologie, le rat Gunn. Les résultats de ces travaux serviront non seulement pour cette maladie, mais aussi à l’ensemble des programmes utilisant le virus adéno-associé recombinant pour une thérapie génique.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, de nombreux patients ne peuvent pas avoir accès aux traitements innovants qui sont développés à base de virus adeno-associés recombinants, car ils possèdent des taux d’anticorps neutralisants trop importants. Le statut sérologique des patients est aujourd’hui un des critères d’exclusion qui écarte le plus de patients d’un essai clinique. Les travaux de recherche pouvant aboutir à l’inclusion de ces patients sont donc extremement attendus par la communauté scientifique mais surtout par les patients eux-même, qui espèrent voir un jour la possibilité de recevoir un traitement. Nous souhaitons développer cette approche jusqu’à la clinique, dans un premier temps pour le syndrome Crigler-Najjar, mais elle pourra être étendue à tous les programmes scientifiques basés sur l’administration de virus adeno-associés recombinants, soit plus de 260 études cliniques référencées courant octobre 2021.

Procédures

En début de procédure, à j0 et j1, des injections intraveineuses (2 à 3 selon les procédures) seront reálisées sur les animaux vigiles placés sous contention (~200uL/injection). Les rats seront suivis et pesés pendant 2 mois et des prises de sang régulières seront effectuées (à j-2, j0, j1, j14, j30, j45, j60). Le volume maximal prélevé sera ~600uL/semaine. Ces prises de sang seront réalisées alternativement sur rat vigile, sous contention (veine caudale) et sur rat anesthésié sous isoflurane (veine submandibulaire).

Impact sur les animaux

Le rat Gunn est atteint d’une hyperbilirubinémie modérée pouvant provoquer chez lui, dans de rares cas, une atteinte neurologique. Toute manipulation/contention du rat vigile est susceptible de provoquer chez lui un stress. Aucun effet indésirable n'est attendu suite à l'administration des traitements décrits dans ce projet. Il est toutefois décrit quelques effets secondaires possibles comme : des réactions d’hypersensibilité/allergiques pouvant aller jusqu'au choc anaphylactique, une certaine hypotension, ou des troubles rénaux.

Devenir

A la fin des procédures 1 et 2, les rats sont euthanasiés afin de collecter les organes pour analyses.

Remplacement

Imlifidase étant une enzyme qui fonctionne essentiellement sur les anticorps humains, la grande majorité des informations essentielles à la démonstration de la faisabilité et de l’efficacité de cette approche seront tirées des expériences réalisées in vitro, sur des prélevements sanguins de donneurs et/ou patients (i.e cinétique d’action, dose efficace, ...). De plus, cette molécule étant déjà commercialisée (domaine des transplantations rénales), beaucoup de données sont disponibles dans la littérature. Cependant le recours à l’animal s’avère obligatoire pour le développement clinique de cette molécule dans une application en thérapie génique, afin d’étudier ses interférences éventuelles sur l’efficacité des virus adéno-asscociés recombinants, nottament celui que notre laboratoire a developpé pour la maladie de Crigler-Najjar. En effet, les paramètres physiologiques tels que la biodisponibilité du virus, une/des réponse(s) immunitaire(s) qu’il peut engendrer, une réaction inflammatoire, etc… sont autant de facteurs qui interviennent dans ces études et qui ne peuvent pas être reproduits, à l’heure actuelle, in vitro. De plus, pour apporter ces preuves que la loi exige avant tout essai chez l’Homme, nous devons nous assurer de l’absence de contre-indications éventuelles de l'imlifidase avec notre traitement de thérapie génique. Pour cela, il n’existe aucune méthode substitutive. Le rat Gunn est le modèle animal atteint du syndrome Crigler-Najjar qui est le plus prédictif pour évaluer l’efficacité du produit de thérapie génique développé pour cette maladie, c’est pourquoi il a été choisi pour ce projet.

Réduction

Nous avons réfléchi cette étude dans le souci d’utiliser le nombre adéquat d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, tout en veillant à ce que ce nombre soit le plus bas possible. Nous avons optimiser les procédures de façon à ne pas dupliquer des groupes contrôles inutilement. Ainsi la dose d'imlifidase efficace sera définie dans la même étude que l'evaluation des interactions avec le virus adéno-associé recombinant. Le nombre d’animaux par groupe experimental a été établi par étude statistique. Puisque l’efficacité du transfert de gène est le paramètre essentiel dans ce projet, nous avons choisi d’utiliser le niveau de bilirubine plasmatique comme marqueur discriminant pour l’étude statistique. Nous avons donc décidé d’utiliser un nombre d’animaux approprié pour détecter une diminution d’environ 50% de la valeur contrôle : un traitement efficace doit être capable de faire passer un taux de bilirubine plasmatique de 7mg/dL (chez les animaux malades) à un taux maximum de 3 mg/dL, reflet d’une activité enzymatique restaurée dans le foie. Au regard de nos études précédentes (pour déterminer variance et écart-type) et à l'aide d'un test unilatéral standard de comparaison des moyennes pour calculer ce nombre, 6 rats seront utilisés par groupe : n= 2x(SD²/Δ²)x(zα/2-zpuiss)² • la différence attendue entre la moyenne d’un groupe contrôle et celle d’un groupe traité : Δ = 7-3=4 • les écart-type observés au cours des études précédentes= environ 2mg/dL • une puissance statistique de 90% et un risque d’erreur à 5% (loi normale, zα/2= 1.96 ; zpuiss =-1.28), n=2x(2²/4²)x(1.96-(-1.28))²=2x(4/16)x3.24²=2x0.25x10.5=5.2

Raffinement

La taille des cages devrait permettre aux rats de démontrer des comportements importants pour leur qualité de vie : ils seront hebergés par 2 ou 3 individus (selon leur poids) de même âge, favorisant les comportements normaux de l’espèce, comme le jeu et les relations sociales. L’enrichissment des cages avec des élements tels que des aménagements pour favoriser l’activité physique ou se cacher / éviter le contact (tubes, séparateur), des matières pour permettre de creuser, des objets à macher (blocs en bois) etc… devraient limiter le stress des animaux, les rendre moins craintifs et moins agressifs et favoriser leur bien-être général. Dès leur arrivée en zone d'expérimentation (2 semaines avant le début des traitements), les rats seront manipulés et contentionnés au moins 3 fois avant le début de la procédure, afin d’être familiarisés aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Le rat étant très sensible au stress, cette habituation est importante. ceci devrait réduire stress et angoisse. Avant chaque intervention, l’identification de l’animal doit être vérifiée et son état général observé avec attention. Les informations pertinentes pourront alors être notifiées sur une fiche d'évaluation. En effet, l'évaluation du comportement de l'animal et de ses signes cliniques doit etre réalisée de manière minutieuse afin de détecter tout changement ou signes d'inconfort de stress ou de douleur. Après chaque acte experimental, une surveillance minutieuse sera mise en place pour garantir que l’animal récupère pleinement. Une surveillance accrue sera établie durant les premières 48 heures afin de surveiller l’apparition eventuelle de signes d’hypersensibilité ou d’inflammation aigue. Afin de diminuer le recours à l'anesthésie et limiter la repetition des ponctions au meme site de prélevement, le sang sera prélevé alternativement à la veine submandibulaire et à la celle de la queue.

Choix des espèces

Le rat est une espèce animale qui développe une hyperbilirubinémie semblable au syndrome Crigler Najjar humain. Ce modèle animal naturel est le rat GUNN. Il est le modèle de référence pour cette maladie et le plus pertinent pour estimer les doses thérapeutiques de thérapie génique. Nous souhaitons traiter des animaux dont le foie est pleinement developpé. En effet, la croissance du foie pourrait entrainer une perte d'effacité à long terme de la thérapie génique. Pour cela nous allons utiliser des rats adultes ou jeunes adultes : basés sur nos études précédentes réalisées sur ce modèle, des animaux de plus de 6 semaine pourront être inclus.

363 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une colite est provoquée chimiquement par injection intra-rectale de DNBS, puis les animaux reçoivent par gavage la bactérie testée, avec pour effets attendus une perte de poids, des diarrhées et des saignements anaux suivis sur trois jours. Le projet, mené par une entreprise, vise à évaluer une bactérie vivante comme futur médicament contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur affirme que ces modèles d'inflammation induite sont les seuls à reproduire la maladie et qu'un modèle in vitro ne restitue pas la complexité du microbiote.

Objectifs

La maladie de Crohn (MC) touche plus de 2,3 millions de personnes dans le monde, avec une prévalence en constante augmentation, en particulier dans les pays nouvellement industrialisés. L'étiologie de la maladie est liée à de multiples facteurs, notamment des facteurs environnementaux, génétiques, immunitaire et un microbiome intestinal altéré. Les patients sont atteints d’anomalies du système immunitaire intestinal associées à un microbiote intestinal peu diversifié et à une perte de bactéries bénéfiques par rapport aux individus sains. La qualité de vie des patients atteints de MC est fortement altérée car ils souffrent de douleurs abdominales atroces, de diarrhées récurrentes, de douleurs articulaires, etc. Les traitements disponibles - à ce jour (par exemple, corticostéroïdes, molécules immunosuppressives et agents biologiques) ou en développement - ciblent les voies responsables de l'inflammation qui déclenche ces symptômes. Cependant, il existe un fort besoin médical de nouvelles thérapeutiques avec un mode d'action différent, car ces traitements ne guérissent pas la maladie et sont associés à de nombreux effets secondaires. Aujourd'hui, il n'y a pas de nouvelle solution pour guérir la maladie. L’objectif du projet est de proposer un nouveau schéma thérapeutique pour la gestion de maladies inflammatoires de l’intestin, pour ceci nous allons évaluer le potentiel thérapeutique, ainsi que de déterminer le profil toxicologique d’une bactérie vivante Christensenella minuta dans des modèles précliniques bien établie qui reprennent les principaux symptômes de l’inflammation au niveau du colon. Ce projet rentre dans le programme de recherche de l’entreprise qui s’inscrit dans sa lignée de développement de nouveau médicament à base de microbiote.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la détermination d’un nouveau traitement qui aura une activité bénéfique dans la gestion de l’inflammation, basée sur une bactérie vivante de l’intestin, ainsi qu’une amélioration de la composition bactérienne et de ce fait nous pourrons ainsi proposer un nouveau schéma thérapeutique pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin, telle que la maladie de Crohn.

Procédures

Les interventions auxquelles seront soumis les animaux sont : injection intra-réctale de DNBS pour l’induction de la colite sous anésthésie. La durée du geste est de moins d’une minute. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur certains animaux. La durée du geste de prélèvement est évaluée à moins d’une minute. L'administration orale par gavage des traitements sur tous les animaux du projet sera également réalisé. La durée du geste de gavage est évaluée à moins d’une minute. Les différentes interventions sont réalisées par une personne formée et les animaux sont suivis quotidiennement selon les critères mis en place au sein de l'établissement.

Impact sur les animaux

La colite chez les souris sera induite chimiquement par le Dinitrobenzène acide sulfonique (DNBS), afin de créer l’inflammation au niveau du côlon, cette procédure a pour effet une perte de poids des animaux qui sera surveillée attentivement au cours des 3 jours qui suivent l’induction. Une grille d’évaluation associée aux mesures à prendre a été mise en place et sera suivie tout au long de la procédure. De plus, il est important de prendre en considération que l’absence ou une perte de poids moindre chez nos animaux traités est un paramètre important marquant l’efficacité de notre traitement. Des effets sur le transit intestinal peuvent être observés, tel que des diarrhées ou des saignements au niveau de l’anus, qui seront suveillés et scorés sur les 3 jours post-induction (jour du sacrifice).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de réaliser des tests et analyses ex-vivo permettant de valider et compléter les données.

Remplacement

L’efficacité et de la tolérabilité d’un médicament en cours de développement doit fait l'objet d'études réglementaires d’évaluation avant toute mise sur le marché, celles-ci exigent l’utilisation de modèles précliniques, qui puissent répondre à des questions toxicologiques. L’ensemble des données générées par ces modèles animaux nous permettront de pouvoir envisager une application thérapeutique chez l’homme. Le recours à des modèles d’inflammation induite chez le rongeur est une étape nécessaire dans notre démarche. Il s’agit des seuls modèles mimant la physiopathologie et la symptomatologie de la colite observées chez les patients atteints de la maladie de Crohn. La réponse immunitaire exprimée suite à l’induction de l’inflammation chez ces modèles précliniques est égalament similaire à celle observée chez l’homme, ce qui nous permet d’évaluer l’impact de notre médicament non seulement d’un point de vue clinique mais également physiologique. Par ailleurs, afin de minimiser au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons réalisé au préalable des tests in vitro de criblage sur modèles cellulaires, qui ont permis d’identifier quelques bactéries pertinentes ayant des effets immunomodulateurs et anti-inflammatoires. Nous souhaitons donc tester ces bactéries sur ces modèles animaux et valider l’effet de C. minuta sur la colite induite et sur la modulation du microbiote intestinal, ce paramètre ne pouvant pas être obtenues par des modèles alternatifs ex vivo ou in vitro, car ils ne reconstituent pas de manière optimale la complexité et la diversité des interactions du microbiote intestinal.

Réduction

Le plus petit nombre d’animaux nécessaire par groupe a été défini tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, en se basant sur la variabilité interindividuelle et de la sensibilité des marqueurs biochimiques, dont les cytokines. Ce nombre tient aussi compte du fait que les expériences seront réalisées trois fois de manière indépendante afin de s’assurer de la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Afin de raffiner les procédures et de réduire tout stress, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal en garantissant un enrichissement de l’environnement et une habituation aux personnes travaillant avec les animaux . Après 7 jours d’acclimatation qui leur permet de s'adapter à leur environnement, ils seront hébergés entre 3 à 5 par cage pour le respect la cohésion sociale de l'espèce, et manipulés quotidiennement jusqu’au début des expériences. Cette période d’habituation permet de réduire leur niveau de stress lors des manipulations ultérieures. Les cages, transparentes, sont enrichies (tunnels de manipulation en carton, carrés de cellulose et bâtonnets) et sont rapprochées les unes des autres, afin que les animaux aient un contact visuel avec leurs congénères. Un suivi des points limites sera mis en place suivant une méthode de prise en charge adaptée au projet. Les expérimentations sont réalisées lorsque cela le nécessite, sous anesthésie générale avec l'utilisation d'analgésiques adaptés. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel formé et expérimenté, soucieux du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en toxicologie et immunologie ; disciplines au carrefour desquelles la thématique du laboratoire nous positionne. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines et de leur impact sur le microbiome intestinal. La disponibilité de modèles animaux d’induction de colite murins pertinents pour nos questions de recherche et le besoin ponctuel de travailler en environnement axénique (complétement stérile) , principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent de plus des facteurs important qui en fait l’espèce animale de choix. Les animaux seront utilisés à partir de 6-8 semaines (adultes), afin que le système immunitaire et le microbiote instestinal soient installés, ainsi nous pourrons évaluer l’impact de notre bactérie sur la structure, la composition de l’intestin, ainsi que la gestion de l’inflammation associée à la colite induite, et ce dans l'objectif de proposer aux patients une solution thérapeutique adaptée et efficace.