Recherche appliquée

1 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse ou dans la veine du foie, puis l'injection de radioéléments couplés à des vecteurs et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur cinq mois, pour évaluer de nouveaux médicaments radioactifs contre le cancer. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être étudiés in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable". Les bénéfices annoncés, un transfert en clinique, restent formulés comme une perspective.

Objectifs

L’objectif principal de notre plateforme est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Nous disposons de différents vecteurs (Anticorps, affitines, liposomes, etc…) et de plusieurs radioéléments (Astate 211, Iode 131, zirconium, Yttrium 90 Scandium 47, cuivre 64 etc…), certains connus qui servent de références et des nouveaux, produits. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon « toxique » pour cette cellule. Il faut accrocher le radioélément à un ligand et à un vecteur afin de former un radiopharmaceutique qui doit cibler et détruire la cellule tumorale tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. Nos études suivent le même protocole. Le système vecteur- ligand-radioélément est d’abord testé sur des cellules tumorales en culture. Quand l’efficacité est démontrée, les cellules tumorales sont greffées à des souris. Le système vecteur- ligand-radioélément est injecté aux animaux porteurs de tumeurs pour étudier la distribution dans un organisme vivant, la fixation du radioélément sur la tumeur et tous les organes. La radiothérapie sera appliquée sur 2 types de modèles de métastases expérimentales : injection intraveineuse dans la veine latérale de la queue qui engendre un envahissement disséminé et injection dans la veine porte hépatique qui permet un envahissement du foie. Ces 2 procédures reflètent les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de produire un radiopharmaceutique capable de détruire les cellules tumorales dans des modèles précliniques. En vue d'un futur transfert à la clinique.

Procédures

Greffe de cellules tumorale en intraportale (Procédure 2) : Cette procédure reflète les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements. Injection unique. Concerne 700 souris sur souris analgésiées et anesthésiées. La procédure chirurgicale en elle même dure 15 minutes par souris. Les souris sont ensuite suivies jusqu'à 150jours. Prélèvement sanguins 50µl de sang à J-7,15,30,45,60,90,120, 150 pour évaluer toxicité hématologique (procédure 3). Lors des prises de sang, une goutte de tétracaïne 1% collyre unidose est appliquée au niveau de l’œil puis les souris sont anesthésiées sous isoflurane, et le sang est prélevé au niveau du sinus rétro orbital à l’aide d’un capillaire. Les prélèvements en eux mêmes ne durent qu'une trentaine de secondes et concernent 1750 souris.

Impact sur les animaux

Les procédures de modèles de métastases (procédure 1 et 2) sont modérées si les animaux sont bien suivis. Ils seront suivi quotidiennement selon une grille de score et de points limites (en annexe) qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. En palier 1 (un critère de la liste en annexe): AINS : Méloxicam 2.5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 (2 critères associés de la liste en annexe) : morphinique faible : Buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané matin et soir (soit 50 µL à 0,03 mg/mL pour une souris de 25 g). En palier 3 : mise à mort. La procédure de thérapie (3) pourrait entraîner des effets indésirables. Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Enfin, la procédure d'imagerie (4) n'entraine pas d'effet indésirable

Devenir

Porocédure 1 : 1050 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie. Procédure 2 : 700 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie.

Remplacement

Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.

Réduction

Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism. Nous utiliserons des T-tests non paramétriques pour les analyses intergroupes, et un test Logrank pour l’analyse des courbes de survie.

Raffinement

L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois ou cinq en fonction des protocoles, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé.

Choix des espèces

Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie réduisant leur fonction rénale à 30 % pour reproduire une insuffisance rénale chronique, puis reçoivent deux composés dans leur nourriture cinq jours sur sept pendant six semaines, avant une mesure de pression artérielle sous anesthésie terminale et le prélèvement de nombreux organes. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" et que le remodelage des tissus ne peut être évalué que sur un animal entier, tout en menant en parallèle des tests sur cellules rénales. Les bénéfices annoncés, de nouveaux traitements, sont renvoyés au moyen terme et au conditionnel.

Objectifs

La mortalité due à l'insuffisance rénale chronique (IRC) et l'insuffisance rénale terminale devrait devenir la 5ème cause mondiale de décès d'ici 2040. L'IRC altère significativement la qualité de vie et la sociabilisation des patients et représente une charge économique importante puisque la thérapie de remplacement rénal (dialyse) coute environ 38 000 €/patient/an. Ainsi, pour des raisons médicales, sociales et économiques, les efforts visant à réduire le nombre de patients atteints d'IRC présentent un intérêt majeur. Le rat va être utilisé comme modèle d’IRC induite par réduction chirurgicale de la masse rénale car il récapitule fidèlement la maladie humaine avec une atteinte des différentes structures du rein. L'objectif principal du projet est de contribuer au futur traitement de l'IRC en validant l'efficacité de deux composés innovants.. Les deux composés, administrés dans un cadre préventif précoce, ont montré des effets très prometteurs chez l'animal. Le projet a pour but : 1) la validation des 2 composés dans ce modèle de rat avec une focalisation sur la fibrose rénale et la synergie avec les traitements existants dans un cadre curatif ; 2) fournir une vue détaillée des mécanismes d'action des composés ; 3) évaluer la valeur translationnelle des composés, c’est-à-dire les possibilités de transposition des résultats chez l'homme et application en clinique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement à moyen terme de nouveaux traitements afin de lutter contre la progression de l'insuffisance rénale chronique. De nombreux médicaments initialement prometteurs dirigés contre la progression de l'IRC ont échoué en clinique. Nous visons à valider l'efficacité de 2 composés dans le traitement de l'IRC en nous focalisant sur leurs possibilités de transposition en santé humaine. Ainsi, les deux composés seront testés chez le rat en parallèle avec les traitements déjà utilisés chez l'homme. L'étude des protéines modifiées dans le rein, combinée à une analyse bio-informatique poussée et à une validation in vitro sur des cellules rénales, nous permettront d’étudier les processus affectés par les composés pour : 1) valider que les mécanismes anticipés sont bien ciblés; 2) prédire les effets secondaires/hors cibles et ; 3) proposer de nouveaux composés qui pourraient être utiles dans le traitement de l’IRC.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour ne laisser que 30% de la fonction rénale pour mimer l'insuffisance rénale chronique humaine. Des injections sous cutanée deBuprenorphine sont effectuées pour prévenir la douleur lors de la chirurgie et pendant la période post-opératoire (pendant 24h à 48h). Un groupe contrôle suivra une chirurgie « simulée » (incision de l’abdomen et manipulation des reins sans ligature ni excision) . La durée de la chirurgie est de 35 minutes. Deux prélèvements d'urine auront lieu au cours du projet: 1 mL environ sera prélevé par massage abdominal au niveau de la vessie en moins de 2 minutes. La fonction rénale des animaux sera évaluée deux fois au cours du projet à l’aide d’un dispositif miniature placé en 10 minutes maximum. Ce dernier permet de mesurer à travers la peau l’élimination par le rein d’une substance fluorescente injectée en intraveineux sous anesthésie. Les dispositifs miniatures sont maintenus sur la peau des rats à l’aide d’un adhésif et d’une gaze et les mesures sont ensuite effectuées pendant 2h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement (pas de douleur et peu de stress). Cette technique évite la réalisation d’un prélèvement sanguin. Les traitements seront administrés 5 jours sur 7 pendant 6 semaines dans la nourriture des animaux (boulettes contenant les produits à tester). Les rats sont isolés en présence de la boulette de nourriture et remis dans leur cage une fois qu’ils l’ont mangée (évite les gavages). A la fin du protocole, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie générale gazeuse, cette partie de la procédure étant sans réveil. Un cathéter est implanté dans la carotide droite et relié à un capteur de pression. Après 5 à 10 minutes d’enregistrement, un prélèvement sanguin sera effectué, puis les rats anesthésiés seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Plusieurs étapes du projet sont susceptibles d’induire des nuisances pour les animaux : la chirurgie sous anesthésie gazeuse et la réduction de la fonction rénale. L’utilisation d’analgésiques lors de l'opération et pendant 48h post-opératoire permet de limiter la douleur. L'analgésie post-opératoire sera évaluée avec une grille de score. Trois à 5 jours après l’opération, une perte de poids de maximum 10 % peut être observée. Le poids doit revenir à la normale au bout d'une semaine post chirurgie. La perte de poids est due en partie à la laparotomie (incision des muscles abdominaux) qui peut causer une gêne pour l’alimentation, la nourriture étant sur le couvercle des cages. Afin de favoriser l’alimentation des rats, de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages. Les rats sont isolés pendant 24h (jusqu'à 48h) suite à la chirurgie, ce temps leur permet de retrouver une activité normale (exploration, mobilité) et permet de vérifier la bonne cicatrisation de leur plaie. L’isolement des animaux pouvant être une source de stress, ils seront ensuite hébergés en cages de 3 à 4 le plus tôt possible. Les prélèvements d’urines sont faits par massage abdominal au niveau de la vessie des animaux. Ce mode de prélèvement permet d’éviter d’isoler les rats dans des cages métaboliques pendant plusieurs jours (source de stress). Les nuisances induites se limitent alors à une contention de quelques secondes. Lors de l’étude de la fonction rénale, les rats sont anesthésiés avant d’être rasés et un dispositif miniature est fixé sur le dos, puis l’injection intraveineuse du traceur fluorescent est réalisée sous anesthésie également. La mesure se déroule pendant 2 h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement. Ainsi, ce protocole ne provoque pas de douleur et peu de stress. Les traitements seront administrés dans la nourriture ce qui permet d’éviter le stress et les possibles lésions de la trachée induites par la réalisation quotidienne de gavages. Les traitements ont déjà été administrés chez le rongeur et n’ont pas entrainé d’effet indésirable.

Devenir

A l’issue de la procédure, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%), cette partie de la procédure étant sans réveil. Après 5 à 10 minutes d’enregistrement de la pression artérielle, un prélèvement sanguin sera effectué, puis les rats anesthésiés seront euthanasiés par injection intraveineuse d’une dose létale de pentobarbital (Exagon ou Euthasol, 400 mg/kg, I.V.). L’euthanasie des animaux est nécessaire afin de permettre le prélèvement de leurs organes en vue de nombreuses analyses biochimiques, histologiques, génétiques et protéomiques, entre autres. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires. Seront notamment prélevés et étudiés : rein, cœur, plasma, artères (aorte thoracique, abdominale, …), intestins, urine et fèces, muscles (soléaire, gastrocnémien), tibias, cerveau, foie et tissus adipeux (épididymal, péri-aortique, sous-cutané).

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à cette étude pour induire une insuffisance rénale chronique et une fibrose des reins, permettant ainsi l’évaluation du potentiel thérapeutique des molécules d’intérêt. Le remodelage de la structure des tissus (rénal notamment) est un processus complexe qui ne peut être évalué que sur l’animal. Ses déterminants ne peuvent pas être fidèlement reproduits par des méthodes alternatives. L'interaction entre différents organes (rein, cœur, vaisseaux sanguins, muscles, cerveau …) est nécessaire afin de représenter la pathologie humaine affectant divers organes cibles à divers stades de l’insuffisance rénale chronique. Le projet prévoit par ailleurs des tests in vitro sur différents types de cellules rénales. Ces tests permettront d’évaluer les mécanismes d’action des composés testés. Les résultats obtenus dans le modèle animal seront ainsi approfondis et complétés. L’étude sur cellule ne permet cependant pas de reproduire et d’appréhender le processus complexe de fibrose des reins.

Réduction

Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé en teant compte de la diminution de la fibrose rénale (-35%) à atteindre, de la variabilité attendue des observations et des tests statistiques pour étudier l’efficacité des composés. Des animaux mâles et femelles seront inclus dans l’étude afin que nos résultats soient plus représentatifs. Ainsi, 12 animaux (6 femelles et 6 mâles) seront inclus dans les différents groupes et au total : 8 x 12 = 96 animaux seront nécessaires à la réalisation de l’étude. L’inclusion de groupes traités avec les thérapies existantes, les analyses approfondies de l'expression des protéines et les résultats très prometteurs dans d’autres modèles doivent permettre l’obtention de résultats positifs et transposables en clinique. L'étude des protéines apportera aussi une meilleure compréhension du modèle et des thérapies actuelles. Le test de 8 groupes en parallèle permet d’éviter de devoir répéter les groupes « contrôles » (animal sain et animal avec IRC non traitée) plusieurs fois. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires afin d’obtenir un maximum de résultats à partir d’un animal. Seront prélevés et étudiés : rein, cœur, plasma, artères (aorte thoracique, abdominale, …), intestins, urine et fèces, muscles (mollet), tibias, cerveau, foie et tissus adipeux (gras). Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant les logiciels GraphPad Prism v5.0 et SAS v9.4.

Raffinement

L’opération chirurgicale deréduction de la masse rénale est réalisée sous anesthésie gazeuse et en une seule étape, ce qui évite d’avoir à opérer 2 fois les animaux. Des injections d’analgésique sont effectuées afin de prévenir la douleur lors et la chirurgie et pendant la période post-opératoire ( évaluation de la douleur avec une grille de score). La plaie sera désinfectée et une pellicule d’Ercefilm y sera déposée (pansement pelliculaire transparent qui protège les plaies des contaminations et permet le contrôle visuel de la cicatrisation). Un protecteur oculaire (« Ocry-gel ») sera utilisé pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement (activité, cicatrisation) pendant la semaine post-opération et de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages afin de favoriser leur prise alimentaire. Les rats sont isolés pendant 24h (à 48h) suite à la chirurgie, jusqu’à retrouver une activité normale (exploration, mobilité et cicatrisation). Ils seront ensuite hébergés en cages de 3 à 4 le plus tôt possible. Les prélèvements d’urine sont faits par massage abdominal au niveau de la vessie des animaux (pas d’isolement stressant pour les rats). La mesure de la fonction rénale se déroule pendant 2 h sur les rats vigiles, libres de leur mouvement. Le protocole ne provoque pas de douleur et peu de stress. Cette technique de mesure récente permet d’avoir accès à une mesure très précise de la fonction rénale et évite un prélèvement sanguin. Avant les traitements, la mesure permettra de vérifier que les fonctions rénales des rats dans les différents groupes sont homogènes et qu’il n’y a pas de biais d’un groupe à l’autre. Les traitements seront administrés dans la nourriture (après entrainement d’une semaine) pour éviter le stress et les possibles lésions de la trachée occasionnées lors de gavages quotidiens. Cela limite aussi l’utilisation de solvants (type éthanol) nécessaires à la dissolution de certains composés testés, pouvant présenter une toxicité et confondre les résultats. Les traitements ont déjà été administrés chez le rongeur sans entrainer d’effet indésirable.

Choix des espèces

Le rat est un animal dont la fonction rénale et les pathologies associées sont très proches de celles de l’homme. Les genèse de l’IRC humaine est mieux reproduite chez le rat que chez la souris et seul des modèles complexes à utiliser (techniquement et éthiquement) tel que le chien ou le porc présentent une IRC plus proche de celle de l’homme. Le modèle de réduction de la masse rénale chez le rat est bien caractérisé et les outils immunologiques, biochimiques et moléculaires sont largement disponibles pour cette espèce, permettant une bonne exploitation des échantillons. Les rats sont réceptionnés à l'âge de 7 semaines (150-175g pour les femelles et 200-225g pour les mâles). La chirurgie sera effectuée après 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement soit à l’âge de 8 semaines. A cet âge les animaux ont récemment atteint leur maturité sexuelle (stade jeune adulte). La réduction de masse rénale à ce stade « jeune » permet d’obtenir une insuffisance rénale mimant bien la pathologie humaine. Les rats suivront ensuite des traitements entre leur 14ème et 20ème semaine de vie (stade adulte). Agés de 14 semaines après avoir suivi la chirurgie de réduction de masse rénale à 8 semaines, les rats présentent une pathologie bien installée tout en ayant encore une fonction rénale résiduelle assez importante (pathologie pas trop sévère permettant aux potentiels traitements d'agir).

800 souris et 1 520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des microhémorragies cérébrales leur sont provoquées par injection intracarotidienne de cyclodextrines ou par injection intracérébrale stéréotaxique de collagénase, suivies de tests comportementaux et d'imagerie IRM et TEP répartis sur douze mois. Le porteur indique des gênes possibles comme une perte d'appétit, une baisse de motivation ou une anxiété, et une mise à mort échelonnée pour examen du cerveau. Il affirme qu'un projet de neurosciences intégratives ne peut être mené avec des méthodes in vitro et nécessite un modèle animal.

Objectifs

Notre projet repose sur l'utilisation de 2 modèles pré-cliniques de microhémorragies cérébrales (MHC), chacun ayant leur intérêt et leur spécificité. En effet, le 1er modèle permet de développer des MHC disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se raprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives telles que l'angiopathie amyloide cérébrale. Ce modèle innovant repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, deviennent toxiques pour les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), et ainsi « érodent » les membranes cellulaires endothéliales et permettent ainsi d’obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris, mais, afin d’optimiser la résolution de nos analyses, nous souhaitons transposer ce modèle chez le rat. Nous pourrons ainsi améliorer la détection et l’évaluation des mécanismes impliqués dans la survenue de MHC. Le 2ème modèle a but pour d'induire une MHC unique au niveau cortical. Ce modèle a l'avantage de connaitre précisément la localisation de la microlésion et ainsi d'en étudier son impact direct sur le tissu environnant et son impact fonctionnel (cognitif et métabolique) de façon reproductible. Ce modèle repose sur l'injection stéréotaxique de collagénase et a été validé chez la souris. Ainsi, notre projet repose sur 3 axes essentiels: (i) Etudier la modulation des régulateurs hémostatiques dans le parenchyme de cerveaux de rats soumis à des microhémorragies disséminées. Les régulateurs de la coagulation et de la fibrinolyse seront examinés au niveau des microvaisseaux cérébraux pour évaluer l’altération de l’hémostase locale. De même, afin d’être au plus proche de la réalité clinique, nous souhaitons travailler sur des animaux des 2 sexes et plus âgés. (ii) Moduler pharmacologiquement les mécanismes impliqués lors de la survenue de MHC, notamment au niveau des régulateurs hémostatiques et de la neuroinflammation. (iii) Etudier les mécanismes physiopathologiques impliqués suite à l'induction d'une MHC unique et leur modulation pharmacologique dans une lignée de souris sauvages et dans une lignée transgénique portant un gène APP humain muté (souris APPJ20) et les corréler à l'évolution du déclin cognitif.

Bénéfices attendus

Ce projet a l'avantage de proposer 2 modèles différtents de MHC (unique et disséminées), ce qui permet d'étudier les différents aspects de ces micolésions. En effet, les conséquences cognitives et tissulaires à plus ou moins long terme ne sont pas les mêmes. De même, ces 2 profils sont retrouvés en clinique humaine et les médecins sont souvent impuissants quant à la prise en charge de ces microlésions. Grâce à ces 2 approches, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes d’action et les conséquences des microhémorragies cérébrales, à court terme et à long terme et envisager, des projets de recherche translationnels avec la clinique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet va subir une chirurgie qui sera différente en fonction du modèle de MHC utilisé (injection de CD en intracarotidien pour le modèle MHC disséminées, injection en intracérébral par stéréotaxie pour le modèle MHC unique). Ces chrirugies se feront sous anesthésie générale à l'isoflurane qui durera entre 10 et 30 minutes en fonction du modèle. Tous les animaux du modèle de MHC unique seront soumis à une IRM de controle à 24h. Puis, l'ensemble des animaux réalisera des tests comportementaux à différents temps post-induction afin d'évaluer l'impact de la survenue des MHC au niveau moteur et cognitif. Ces évaluations sont généralement étalées sur plusieurs semaines (2 à 8 semaines selon le test utilisé). Par la suite, pour chaque temps d'intérêt, certains animaux (5 par groupe et par temps) seront soumis à une IRM afin d'évaluer la charge microhémorragique cérébrale et/ou à une TEP FDG afin d'évaluer le métabolisme cérébral in vivo. En fonction de la séquence utilisée en IRM, la procédure peut durer entre 15 et 30 minutes et 30 minutes d'acquisition pour la TEP FDG.

Impact sur les animaux

L'induction des MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront au maximum 5 acquisitions réparties sur 12 mois (IRM et TEP-FDG) nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. Enfin, il se peut que l'animal subisse une douleur trainsitoire lors de l'injection intrapéritonéale de produit radioactif lors de la procédure d'évaluation du métabolisme cérébral (TEP-FDG). Cette douleur sera temporaire et sans conséquence car le volume et la quantité de rayonnement injectés restent faibles (équivalent à une radiographie classique). La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Devenir

L'esemble des animaux seront gardés en vie à l'issu des procédures d'induction de MHC unique ou disséminées (procédures modérées, 800 souris et 1520 rats). Ils seront également gardés en vie après la procédure IRM ou d'évaluations comportementales (procédures légères). Ils seront mis à mort à plusieurs temps post-induction (1,5-3-6-9 et 12 mois) pour examen histologique et immunohistochimique de leur cerveau (injection létale de pentobarbital (doléthal®, 182.2mg/kg) en IP, procédure sans réveil).

Remplacement

Il s'agit d'un projet portant sur l'impact des MHC avec des approches neuronales, vasculaires et comportementales . Un tel projet de neurosciences intégratives ne peut être mené avec des méthodes alternatives in vitro et nécessite l'utilisation d'un modèle animal.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 2320 animaux (1520 rats et 800 souris). Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les études comportementales et la réponse aux traitements présentent une certaine hétérogénéité qui nécessite d'avoir un nombre d'animaux suffisant par lot ainsi que plusieurs lots pour valider les résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie. Ainsi, des études statistiques seront réalisées à l'aide de tests paramétriques (Test t de Student) ou non paramétriques (Test de Mann-Whitney) selon la normalité de la distribution (déterminée via le test de Shapiro-wilk). Pour les évaluations longitudinales, nous utiliserons une ANOVA à deux facteurs (analyse des variances de façon bidirectionnelle). Pour l'ensemble de ces analyses, les différences seront significatives lorsque p≤0,05.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression , humidité de l'air), avec enrichissement.

Choix des espèces

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des rats Wistar sur fond génétique stable et/ou des souris C57bl6 homozygotes stables. Pour étudier l’impact des MHC dans un contexte neurodégénératif, nous avons aussi fait le choix de souris génétiquement modifiées (APPJ20) développant des lésions caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. Le choix de 2 espèces de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Pour l’évaluation d’agents pharmacologiques, nous utiliserons des rats et des souris âgés de 10 semaines, âge où les souris ont acquis une maturité cérébrale et dont nous avons déjà une expertise dans notre modèle. Pour les études autour des régulateurs hémostatiques chez le rat, nous utiliserons également des animaux plus âgés (autour de 12 mois de vie) où les mécanismes délétères liés à l’âge se mettent en place.

98 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses coliques leur sont transplantées, les animaux sont maintenus vingt-cinq jours puis tués pour prélever la tumeur, un régime riche en lipides étant testé pour son effet sur la tumorigenèse. Le porteur indique que du sang dans les fèces ou tout autre effet indésirable entraînera la mise à mort de l'animal, et précise que les souris sont maintenues sans traitement antalgique pour ne pas modifier la réponse inflammatoire. Il affirme que l'effet d'un régime alimentaire ne peut être caractérisé in vitro et que la proximité physiologique avec l'humain justifie le recours à la souris.

Objectifs

L’enzyme Elovl5 catalyse l’élongation des acides gras et son expression est augmentée dans les tissus coliques tumoraux comparés aux tissus sains chez l’Homme. De plus, nos résultats in vitro montrent que l’inhibition de cette voie métabolique réduit la prolifération des cellules cancéreuses du côlon. Notre projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme elovl5 dans le développement du cancer du côlon et à évaluer l’importance d’un régime riche en lipides dans ce contexte. En effet, un régime riche en lipides augmenterait la tumorigenèse colique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’importance de Elovl5 dans le développement de cancer colique dans un contexte nutritionnel riche en lipides. Nous attendons une effet protecteur de l’absence d’expression Elovl5 validant cette enzyme comme cible thérapeutique. L’utilisation des modèles CT-26 et MC-38 permet de comparer le comportement de deux lignées cancéreuses coliques murines avec des profils mutationnels différents.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée pour transplantation des cellules cancéreuses.

Impact sur les animaux

Les modèles utilisés de transplantation de cellules cancéreuses en sous-cutanée et de cancer colique induit par AOM et HFD peuvent induire des nuisances concernant le stress lié à la contention de l’animal au moment des différentes injections. Dans le modèle de cancer colique, du sang dans les fèces pourrait apparaître et occasionnerait la mise à mort de l’animal. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses, les souris seront maintenues 25 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elle seront ensuite mises à mort pour le prélèvement de la tumeur.

Remplacement

L'utilisation de ces modèles murins de cancer sont nécessaires pour évaluer la progression tumorale et métastatique dépendante d’acteurs cellulaires différents (système immunitaire notamment). L’effet d’un régime alimentaire ne peut être caractérisé dans un modèle in vitro. Par ailleurs, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 178 souris mâles sur un fonds génétique C57Bl6 seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée.Des souris mâles âgées d’au moins 6 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses. Les souris wt et Elovl5 ko seront mises sous régime spécifique également dès 6 semaines pour prise de poids rapide.

240 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein triple négatif leur sont injectées sous la peau, la tumeur est suivie au pied à coulisse et des composés sont administrés par voie orale ou intrapéritonéale plusieurs fois par semaine. Le porteur indique que la littérature ne prévoit pas d'effet secondaire notable de ces composés et que les animaux ne développant pas de tumeur seront tués huit semaines après la greffe. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution du composé et l'organisation d'une tumeur, et conclut à la nécessité d'un recours aux animaux.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent en France et représente la première cause de décès par cancer chez la femme. (Source : Santé publique France). Il existe plusieurs types de cancer du sein dont un appelé triple négatif. Peu de solutions efficaces sont disponibles pour le traitement du cancer du sein triple négatif, aussi le but de ce projet est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour se développer les cellules cancéreuses ont besoin de ressources importantes et notamment de protéines. Récemment, plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des protéines ont été identifiés, et vis-à-vis desquels les cellules cancéreuses sont dépendantes. L'inactivation de ces facteurs bloque les propriétés tumorales des cellules cancéreuses et induit leur mort. Les cellules saines ne sont pas affectées par l'inhibition de ces facteurs. Ceci a été montré in vitro pour plusieurs cancers dont la prostate, le colon ou le mélanome. Un travail préliminaire a été mené qui étend cette approche au cancer du sein de type triple négatif en utilisant une dizaine de modèles cellulaires, par des approches in vitro de culture de cellules en 2 dimensions et en 3 dimensions. En particulier in vitro deux approches ont été validées, l'une par inhibition de l'expression de ces facteurs par des outils génétiques, l'autre par inactivation de ces facteurs à l'aide de composés chimiques, qui sont des candidat médicaments en cours d'évaluation clinique dans d'autres pathologies. Il est maintenant nécessaire de vérifier si un effet anti-tumoral est obtenu lorsque les cellules sont organisées en tumeur. Le modèle de choix utilisé est la greffe de tumeurs sous-cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps, puis les tumeurs seront collectées et analysées par histologie afin de déterminer l'impact des composés sur la prolifération et la mort des cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anticancer en santé humaine. En effet, altérer la synthèse des protéines des cellules cancéreuses est une nouvelle approche thérapeutique anticancer qui semble très prometteuse selon les premiers essais cliniques. Afin d'évaluer le véritable potentiel thérapeutique de cette approche, la communauté scientifique fait face à deux enjeux : premièrement, déterminer les cancers qui bénéficieraient de cette nouvelle approche ; deuxièmement, identifier de nouveaux médicaments. Ainsi les bénéfices de ce projet seront précisément de : 1- Apporter des données in vivo pour finaliser une étude in vitro en cours sur le cancer du sein de sous-type triple négatif. 2- Démontrer que les composés utilisés n'ont pas d'effets secondaires notables chez la souris. 3- Disposer de résultats obtenus dans des modèles animaux qui seront nécessaires avant d'initier des études cliniques chez l'Homme.

Procédures

Des cellules humaines de cancer du sein seront injectées sous la peau des souris. Pour cela l’animal est maintenu environ 15 secondes sans stress. Une seule injection de 0,1 mL est réalisée par animal. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans les 2 à 3 semaines qui suivent. Le développement tumoral sera suivi par simples mesures au pied à coulisse (3x/semaines), sur animal vigile maintenu immobile environ 20 secondes. Les composés seront administrés soit par voie orale (2x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaines ; 10 secondes).

Impact sur les animaux

Implantation des tumeurs : Les cellules seront injectées sur animal vigile, pour cela l’animal est tenu en contention sans stress. Le volume d’injection est faible (0,1 mL). Une seule injection par animal, durée 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans un délai de 2 à 3 semaines, sans géner la mobilité des animaux. Suivi des greffes de tumeurs : Le développement tumoral sera suivi par mesures au pied à coulisse, sur animal vigile tenu en contention. Fréquence : 3x/semaine, 20 secondes. Traitements : Les souris seront traitées par voie orale (3x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaine ; 10 secondes). La littérature indique que ces composés n'induisent pas d'effet secondaire chez les souris. Un des objectifs du projet étant de confirmer ces données, les animaux bénéficieront d'une vigilance toute particulière dans la détection de signes de souffrance. Un des traitement sera administré dans l’eau de boisson. Celui-ci a un goût amer, donc pour que les souris s’hydratent correctement, 3% de sucre sont ajoutés dans l’eau de boisson.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux, ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. Les animaux ont subi une injection de cellules tumorales, ils ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

L'efficacité des composés a été validée in vitro, sur des cellules en culture, par plusieurs approches complémentaires. Néanmoins, l'efficacité d'un composé médicament dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de la tumeur et de son environnement. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution et l'élimination du composé dans un organisme, ni de reproduire à l'identique l'organisation d'une tumeur (par exemple la vascularisation ou la surveillance anti-tumorale). Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux pour valider l'efficacité in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour ces expériences. Une étude préliminaire de validation sera effectuée sur un petit nombre d'animaux (40 souris) avant d'engager l'étude principale. Les protocoles utilisés permettent d'effectuer l'ensemble des analyses sur une seule tumeur pour éviter de dupliquer les expériences et donc le nombre d'animaux. La procédure prévoit la collecte post-mortem de l'ensemble des tumeurs et des organes de plusieurs animaux afin qu'ils soient stockés et disponibles pour des analyses complémentaires qui pourraient être nécessaires (par exemple lors de l'expertise externe des résultats), et ce sans l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le nombre d'animaux a été fixé à 10 par groupe, en prenant en compte les éléments suivants : - Les contraintes statistiques. - Disposer d'un nombre minimum de 8 animaux par groupe, prenant en compte que la greffe ne prendra pas chez 10% des animaux et le risque qu'un animal meurt dans chaque groupe au cours de l'expérience. - La croissance de tumeur présente une variabilité de 30% - Observer un écart d'au moins 30% de baisse de croissance entre les moyennes des deux groupes

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 5 individus. Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. Sur la base de données disponibles, deux des trois composés seront administrés par voie orale. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris sera suivi par pesée des animaux et par une analyse histologique de plusieurs organes sur quelques animaux traités. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est le modèle de choix pour l'analyse de greffes de tumeurs humaines en oncologie. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles immunodéprimées de 6 à 8 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus, les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes d'animaux.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur provoque chez des souris immunodéficientes ou au système immunitaire humanisé une réaction du greffon contre l'hôte, puis administre des composés par injection ou par gavage, pour tester des traitements au fil de cinquante études précliniques en cinq ans. Il indique que la maladie provoque une atteinte de la peau, une perte de poids, une prostration et des difficultés à se déplacer. Il affirme qu'aucun environnement in vitro ne reproduit cette pathologie et juge le modèle murin "indispensable".

Objectifs

La réaction du greffon contre l’hôte ou GvHD (Graft versus Host Disease) est un syndrome qui se développe à la suite d’une transplantation chez un patient (eg : moelle osseuse, cellules souches, organes, tissus). Les cellules immunitaires présentes dans le greffon du donneur identifient le receveur comme étranger et essayent de l’éliminer. Cela peut se manifester par des dommages au niveau de la peau, des muqueuses, du foie, du système digestif ou des poumons. La GvHD est fréquente dans les cas de transplantation allogénique (le patient receveur et le donneur diffèrent sur le plan génétique) et est associée à une forte morbidité, ainsi qu'à une forte mortalité. Le traitement standard de la GvHD est constitué de glucocorticoïdes (prednisone). Ces traitements ont des effets immunosuppresseurs pouvant être accompagnés d’importants effets secondaires. Par exemple, ils augmentent les risques d’infections et de cancers. Pour ce projet, la GvHD sera induite chez des souris immunodéficientes ou ayant un système immunitaire humanisé afin de mettre à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier cette pathologie et de développer des traitements potentiels.

Bénéfices attendus

En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier cette pathologie et de conduire des tests précliniques davantage prédictifs des effets qu'auront les candidats médicaments sur son utilisateur final : l'Homme.

Procédures

Injection intraveineuse ou intrapéritonéale des cellules mononucléaires d'une durée de 10 à 15 secondes. Prélèvements sanguins: la fréquence et les volumes d'administration seront déterminés sur base du poids de la souris. A titre d’exemple, le volume maximum prélevé sera de 100 μL par semaine pour une souris de 25 gr. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. L’administration de composés de recherche : réalisée par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation) ou parentérale (veineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-musculaire). Les volumes à administrer seront préétablis par le vétérinaire d’établissement et le comité de bien-être. A titre d’exemple, pour une souris de 20 g, la limite d’administration sera de 400 μL per os; 200 μL par voie sous-cutanée; 200 μL par voie intrapéritonéale; 50 μL par voie intramusculaire et 200 μL par voie intraveineuse. La durée des administrations est de 10 à 15 secondes.

Impact sur les animaux

Une fois développée, la GvHD induit un syndrome inflammatoire potentiellement douloureux, se manifestant notamment par une atteinte de l'intégrité de la peau, une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. et des effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les souris auront subi deux procédures modérées, une réutilisation n'est donc pas envisagée.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe permettant de mimer les différents composants du système immunitaire impliqués dans cette pathologie. Le modèle murin constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes permettant de soigner la GvHD.

Réduction

Chaque étude préclinique visant a tester l'efficacité d'un candidat medicament doit comprendre un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif et au minimum deux doses des traitements à comparer) comprenant chacun de 5 à 10 animaux afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus des molécules à visées thérapeutiques. Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études précliniques.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. Les souris recevront une période d’acclimatation de 7 jours, minimum, avant l’entrée en projet, et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Cette dernière sera objectivée par un score clinique permettant de prendre en compte les effets de la GvHD sur la souris.

Choix des espèces

Nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire sur les souris NXG, NCG et NOG. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 6 et 8 semaines pour les animaux non humanisés et à partir de 16 semaines pour les animaux humanisés. Leur suivi pourra durer jusqu’à l’âge de 40 semaines pour permettre le développement de la pathologie.