Recherche appliquée

Greffés d'un fragment de tumeur dans le cortex cérébral puis opérés une seconde fois pour la retirer, 300 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun peut recevoir une séance de radiothérapie à 10 Gy, jusqu'à cinq prélèvements sanguins et jusqu'à six IRM d'une heure sous anesthésie. Le porteur qualifie de modérées les douleurs opératoires tout en décrivant des convulsions possibles, une incapacité de boire ou manger, et une nécrose cérébrale que la dose de rayons pourrait induire. Il précise avoir choisi des rats adultes parce qu'ils supporteront mieux la chirurgie, les effets secondaires des composés testés et le développement de la tumeur.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Les gliomes de haut grade restent à ce jour un cancer pour lequel la prise en charge a peu évolué depuis 20 ans, avec une survie médiane après traitement à ce jour de 24 mois environ. Le développement de nouvelles thérapies est de ce fait critique afin d’améliorer la survie et la rémission des patients. L’objectif de ce projet est, dans un modèle de glioblastome orthotopique (dans l’organe dans lequel il se développe normalement, c’est-à-dire le cerveau dans ce cas) chez les rongeurs (rats) décrit dans la littérature, de reproduire la prise en charge clinique et d’y ajouter un traitement local de nouveau composé afin d’évaluer spécifiquement l’efficacité thérapeutique du composé d’intérêt dans le contexte de la présence de cellules cancéreuses résiduelles suite à une chirurgie de résection de glioblastome. En d’autres termes, les études couvertes par ce projet permettront, avant les essais cliniques chez l’homme, d’évaluer l’efficacité de composés destinés à traiter les tissus cancéreux résiduels de glioblastome chez l’homme. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, les modèles et site d’implantation choisis (dans l’organe dans lequel la tumeur se développe normalement, c’est-à-dire le cerveau) permettront de reproduire la prise en charge clinique actuelle chez l’homme et d’apprécier le bénéfice de nouvelle thérapies ajoutées en sus sur la survie des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La greffe tumorale intra cérébrale, ainsi que sa résection seront des procédures chirurgicales d’une trentaine de minutes environ et seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré-, per et post-opératoire. Les animaux vigiles pourront également recevoir un unique traitement de radiothérapie sous anesthésie dans un établissement spécialisé (trajet ne dépassant pas 40 min aller-retour et 15-30 min de traitement par animal). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Il sera réalisé un maximum de 5 prélèvements sanguins par animal, répartis sur la durée totale de l’étude. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. . Il sera réalisé un maximum de 6 IRM par animal.

Impact sur les animaux

Pour ces modèles, la greffe de la tumeur (implantation de fragment) et sa résection sont réalisées dans le cortex cérébral pariétal. Compte tenu de l’analgésie, les douleurs opératoires et post-opératoires seront de niveau modéré. L’évolution du volume tumoral, la résection et le traitement topique pourront entrainer des troubles tels que des troubles neurologiques (diminution de la mobilité, convulsions, incapacité de boire ou manger, apathie) ou une perte de poids qui constitueront un point limite. Les animaux recevront des traitements par radiothérapie ou voie orale. Ces actes entraineront un stress léger. La séance de radiotherapie à la dose 10Gy pourrait induire de la nécrose cérébrale et de l’ostéonécrose sur le site de radiation. Le jour du démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes (en poids et/ou du volume tumoral) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Lors des prélèvements sanguins, la contention ou l’anesthésie entraineront un stress léger. Lors des acquisitions IRM, l’anesthésie entrainera un stress léger.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament nécessitent d’étudier leurs interactions dans un contexte global et anatomique et cela ne peut pas être transposé dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s), à savoir le poids et le volume tumoral. Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques (ANOVA) soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 8 et 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires ne pourra pas excéder 20%. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La greffe et la résection du fragment de tumeur seront réalisées sous anesthésie générale et locale avec administration préalable d’un analgésique opiacé et d’un alpha 2 agoniste (type xylazine, médétomidine ou équivalent). En fin de chirurgie et les 2 jours suivant (total 72h), un anti-inflammatoire non stéroïdien (type meloxicam ou équivalent) ou un corticoïde sera administré. 4h, 6 à 8h et 24h après la chirurgie, les animaux recevront un analgésique opiacé. Un anesthésique local (type lidocaïne) sera également injecté en sous-cutané avant la chirurgie. La chirurgie de greffe sera réalisée stérilement avec un cadre de stéréotaxie. Les procédures seront réalisées sous maintien de la température corporelle et surveillance post-opératoire jusqu’au réveil puis toutes les 2h (6h au total). .Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les expérimentateurs sont formés pour effectuer ce type de chirurgie et évaluer spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites. Une grille de scoring est mise en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite. Une perte de poids de 15% ou prolongée (entre -10 et -15% sur 3 jours consécutifs) constituera un point limite. Les autres points limites concernent l’état général de l’animal. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasive permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.

Choix des espèces

Diverses souches de rats immunocompétents sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les modèles choisis ainsi que le site d’implantation auront un développement similaire à ce qui est observé chez l’homme. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter la greffe des fragments tumoraux. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.

Pour tester si une molécule administrée par la bouche peut renforcer l'enzymothérapie de la maladie de Pompe, 64 souris porteuses du déficit enzymatique vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des organes et du sang. Chacune est contenue deux fois par jour pendant cinq jours pour s'habituer à l'administration orale, reçoit la molécule quatre jours de suite à la micropipette, puis deux injections dans la veine de la queue à quarante-huit heures d'intervalle sous anesthésie gazeuse. Le porteur décrit un raffinement inhabituellement détaillé, excipient sucré présenté au bord de la gueule plutôt que gavage, crème anesthésiante avant l'injection, transfert par tunnel. Il fixe l'âge d'utilisation à six mois, avant que la faiblesse musculaire du modèle ne devienne visible vers huit ou neuf mois, ce qui limite à la fois ce que les animaux subissent du fait de leur maladie et ce que l'expérience peut en montrer.

Objectifs

La maladie de Pompe est une maladie génétique héréditaire liée à un déficit en une enzyme spécifique qui entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes, ce qui provoque des dommages cellulaires dans différents tissus, particulièrement dans le cœur, les muscles, le foie et le système nerveux. Chez le nourrisson atteint d’une forme grave, le muscle cardiaque est souvent touché ; c’est la cause principale de décès. Chez les patients atteints d’une forme tardive, le système respiratoire et la capacité de déplacement sont généralement les plus affectés par la maladie, nécessitant souvent le recours à un fauteuil roulant et à une assistance respiratoire et pouvant raccourcir l’espérance de vie. Un traitement de remplacement (substitution) de l’enzyme ou enzymothérapie de remplacement est disponible pour la maladie de Pompe, mais présente une efficacité limitée et une réaction immunitaire élevée surtout dans la forme infantile de la maladie. Les défenses de l’organisme neutralisent peu à peu cette molécule au fur et à mesure des administrations. En conséquence, cette approche ne parvient pas à corriger totalement l’accumulation de glycogène pathologique dans le tissu nerveux et les muscles squelettiques. Malgré les nouvelles générations d’enzyme de substitution, les problèmes de sélectivité et de réaction immunitaire persistent. Dans ce contexte, une première étude a été réalisée sur des souris pour identifier des molécules appelées chaperons pharmacologiques présentant une sélectivité élevée pour cettte enzyme déficiente.Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude précédente et permettra de mettre en avant un candidat médicament pour améliorer l’enzymothérapie, principal traitement actuel de la maladie de Pompe. En effet, la molécule chaperon d’intérêt a démontré sa capacité à améliorer l’activité mesurée dans les tissus de souris traitées par enzymothérapie avec cette molécule. En particulier, une augmentation significative de l’activité de l’enzyme spécifique mesurée dans le cœur, le quadriceps et le diaphragme encourage fortement à poursuivre les études pour confirmer l’efficacité de ce composé dans ces tissus mais aussi dans d’autres tissus affectés par les symptômes de la maladie de Pompe.

Bénéfices attendus

L’enzymothérapie se fait en injectant dans une veine (perfusion) une solution contenant l’enzyme de substitution. Cependant, la durée de vie de l’enzyme étant courte dans l’organisme, la perfusion, de doses importantes, doit être répétée toutes les deux semaines. Si le traitement est interrompu, la maladie progresse de nouveau. De plus, certains patients développent une réponse immunitaire c’est-à-dire qu’ils fabriquent des anticorps contre l’enzyme injectée comme si c’était un agresseur pour leur organisme. Les patients qui fabriquent beaucoup d’anticorps deviennent moins sensibles au traitement qui perd de son efficacité (environ 40% des patients). Différentes mutations sont présentes dans la maladie, et toutes ne génèrent pas une absence complète d’enzyme mais parfois la synthèse d’enzymes endogènes malconformées et non actives. Ces patients pourraient potentiellement se passer de perfusion de l’enzymothérapie si leur mutation répond à la molécule chaperon d’intérêt seule. Une évaluation in vitro sur 5 types différents de cellules musculaires de patients a été réalisée et 3 ont répondu à la la molécule d’intérêt. Dans ce contexte, notre étude a pour objectif d’améliorer la qualité de vie des patients atteints de la maladie de Pompe. Ce projet vise à confirmer les premiers résultats prometteurs montrant que la molécule chaperon d’intérêt est un candidat médicament d’intérêt pour le traitement de la maladie de Pompe par voie orale, en améliorant l’efficacité de l’enzymothérapie. La co-administration de cette molécule d’intérêt avec une enzymothérapie pourrait permettre une amélioration de son efficacité, une diminution des doses d’enzyme recombinante à administrer et un espacement des perfusions pour les patients atteints de la maladie de Pompe. Les bénéfices attendus sont une diminution du coût global du traitement, une amélioration de la tolérance au traitement et de la qualité de vie des patients, qui doivent être traités pendant toute leur vie.

Procédures

Lors de cette étude, les animaux seront soumis à des contentions (durée maximale par contention de 30 secondes) 2 fois/jour pendant 5 jours pour une période d’habituation à l’administration orale à la micropipette et 1 fois/jour pendant 4 jours pour l’administration de la substance d’intérêt par voie orale via la micropipette. Ces animaux seront également soumis à 2 injections en veine caudale (durée 20 secondes) à 48h d’intervalle. L’injection sera effectuée sous anesthésie gazeuse de manière à limiter le stress de l’animal.

Impact sur les animaux

Ces expériences étant réalisées sur seulement 5 jours, peu de nuisances ou d’effets indésirables sont attendus sur les animaux. Les premières expériences réalisées ont montré que les souris se portaient bien pendant toute la durée du traitement et ne montraient aucun effet indésirable ni signe de toxicité de ce type de traitement. Les effets indésirables prévus sont un léger stress lié à la contention pour l’administration par la micropipette et une petite douleur transitoire pour l’injection dans la veine de la queue. Ces souris ayant une faiblesse musculaire débutant à partir de 6 mois, elles pourraient présenter des petites difficultés à se mouvoir. Nous ne nous attendons donc pas à observer ces signes car selon la littérature ces problèmes de locomotion sont cliniquement apparents qu’à l’âge de 8-9 mois.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du projet afin d’analyser différents organes, ainsi que le sang. Les mesures de différents paramètres (enzyme, glycogène notamment) permettront d’évaluer la dose de la molécule d'intérêt la plus intéressante et la plus efficace afin de poursuivre le développement de cette nouvelle molécule en association ou non avec l'enzyme dans le traitement de la Maladie de Pompe.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des études préliminaires ont été menées in vitro sur des modèles cellulaires pertinents. Ces travaux ont permis d’identifier une molécule chaperon que nous allons étudier ici dans ce projet. Ces résultats encourageants constituent une base solide, mais ne permettent pas d’appréhender la complexité des interactions physiopathologiques impliquées dans la maladie de Pompe. En effet, cette pathologie implique des altérations multisystémiques, affectant notamment les muscles squelettiques et cardiaques. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique nécessite donc d’analyser la réponse globale de l’organisme, incluant des interactions inter-organes, des mécanismes de distribution, de pharmacocinétique et de pharmacodynamie, qui ne peuvent pas être reproduits de manière fiable à ce jour par des modèles in vitro ou in silico. À ce stade du développement, le recours à un modèle animal est indispensable pour évaluer l’impact physiologique global de l’ajout de la molécule chaperon à l’enzymothérapie, et pour valider la pertinence de cette approche avant d’envisager une éventuelle transposition clinique.

Réduction

Le nombre de souris a été évalué au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée et du modèle animal mais aussi des résultats d’études précédentes. Le nombre de souris par lot a été évalué pour permettre de (i) détecter des signaux d’efficacité non négligeable dans les groupes traités avec une probabilité satisfaisante; (ii) documenter une relation dose–effet entre une dose faible proche de l’exposition clinique et une dose forte ; (iii) et disposer d’un contrôle contemporain, tout en limitant au strict minimum le nombre de souris, grâce au recours aux données de contrôles historiques pour compléter l’interprétation. Une réduction supplémentaire des effectifs des groupes traités risquerait de rendre l’étude ininterprétable et pourrait conduire à devoir la répéter, ce qui irait à l’encontre du principe de réduction. De plus, l’évaluation du nombre d’individus par cohorte s’est basée sur le fait qu’il n’a pas été décrit de mort prématuré jusqu’à l’âge de 6 mois. Nous ne nous attendons donc pas à une perte d’animaux lors de cette procédure. Nous procéderons également à l’administration de la molécule chaperon par micropipette, geste technique non invasif sans risque de perte contrairement au gavage. Et nous ne nous attendons pas non plus à un risque lors de l’anesthésie car celle-ci sera légère et de courte durée.

Raffinement

Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 mois, soit avant l’apparition des signes cliniques manifestes observés à partir de 8-9 mois. À ce stade, bien que des altérations musculaires débutantes puissent être présentes au niveau histologique, les animaux ne présentent pas encore de signes de souffrance clinique tels que la faiblesse musculaire marquée ou la réduction significative de la mobilité. Ce choix d’âge permet de minimiser l’impact sur le bien-être animal, tout en garantissant une représentativité suffisante du modèle pour les études biologiques envisagées. Afin de limiter l’apparition de possibles conflits, un apport supplémentaire d’enrichissement (hutte, bâtonnet à ronger, tubes) sera mis à disposition dans les cages. -La préhension des souris sera réalisée par transfert à l’aide d’un tunnel pour réduire le stress. De plus, les souris seront habituées à la contention en étant manipulées lors de la pesée hebdomadaire puis 2 fois/jour la semaine précédant les 5 jours de traitement. - L’administration de la molécule chaperon sera réalisée non pas par gavage oral mais par micropipette avec un excipient sucré présentée au bord de la gueule de l’animal. L’excipient sucré seul sera proposé 10 fois la semaine précédent le traitement à la souris afin d’habituer la souris à accepter le traitement. - Afin de limiter la douleur et de réduire le stress lors des injections en intraveineuse dans la veine caudale : une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d’injection de la queue, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis. Suite à l’injection, une surveillance des animaux sera réalisée pour détecter toute réaction anormale pendant les 30 minutes qui suivent l’injection et seront de nouveau contrôlées dans leur cage d’hébergement en fin de matinée et dans l’après-midi. Les animaux seront pesés toutes les semaines et seront observés pour détecter tout signe de mal-être, souffrance, lésions ou de détérioration de l’état de santé général avec la mise en place de points limites précoces. Des moyens de prévention/correction de la douleur seront apportés en fonction de l’état de l’animal.

Choix des espèces

Nos études sont réalisées afin d’améliorer le traitement de la maladie de Pompe. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec le modèle animal existant de cette maladie. Ces souris offrent un modèle génotype-→-phénotype fidèle, mesurable et modulable, parfait pour créer, comparer et optimiser les traitements de la maladie de Pompe avant le passage en toxicologie réglementaire et en l’essai clinique. Les animaux utilisés seront âgés de 6 mois, comme ceux utilisés lors des études préliminaires. L’âge de 6 mois correspond à l’âge à partir duquel des injections sont possibles au vu des très faibles quantités administrées, mais également à l’âge où la faiblesse musculaire est quantifiable par des marqueurs biologiques. A partir de 6 mois, leur état commence à évoluer, avec une faiblesse musculaire plus marquée lors de tests de comportement et une atrophie musculaire (notamment des membres postérieurs) qui elle sera très marquée vers 8-9 mois avec une marche dandinante. L’utilisation des animaux à l’âge de 6 mois permet ainsi de prévenir toute apparition de signes importants de la maladie sans intervention et d’éviter tout signe d’inconfort potentiels chez les animaux avant traitement.

Infectées par un virus puis exposées quatre à sept jours durant aux piqûres de tiques posées sur elles, 3 708 souris subissent en plus un prélèvement sanguin quotidien pendant quinze jours. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à l'âge de quatre semaines, choisi parce que les jeunes souris développent une infection lente et progressive qui laisse le temps aux tiques de se gorger au pic de virémie. Le porteur qualifie les piqûres de tiques d'indolores et reconnaît dans le même dossier qu'il lui est difficile d'anticiper les symptômes, l'approche étant exploratoire. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, le porteur écartant toute réutilisation ou adoption au motif qu'elles auront été infectées.

Objectifs

Le virus Hazara est un virus originaire du Pakistan de la région de Hazara et a pour réservoir une espèce locale de campagnol. Le virus est alors transmis par piqure de tique Ixodes redikorzevi. Le virus Dugbe quant à lui est un virus que l’on retrouve chez les bovins d’Afrique centrale et qui peut parfois toucher l’Homme de manière peu symptomatique. L’étude de ces deux virus et plus spécifiquement de leur transmission par les tiques de différents genres, présentes notamment en France, permettrait alors d’obtenir une première réponse quant à la transmission potentielle du virus objet du projet par ces mêmes tiques. Nous utiliserons des souris de différentes origines : des lignées standard, présentant une sensibilité accrue aux infections virales, ou dont la sensibilité à cette famille de virus a été précédemment montrée. Le but est d’identifier une lignée plus apte à s’infecter pour obtenir un modèle d’infection stable. Les souris montrées comme étant sensibles permettront d’étudier la transmission du virus via les piqûres de tiques infectées. Si au cours de ces expériences de transmission naturelle, les souris sensibles à l’infection par injection intradermique de virus venaient à ne pas s’infecter, alors nous pourrions supposer que le risque que le virus étudié se transmette par des tiques présentes en Europe est minime sinon nul.

Bénéfices attendus

L’étude de ces deux virus et plus spécifiquement de leur transmission par les tiques de différents genres, présentes notamment en France, permettrait alors d’obtenir une première réponse quant à la transmission potentielle du virus étudié par ces mêmes tiques. Nous allons aussi étudier si ces virus sont capable de passer d’une génération à l’autre de la tique par transmission trans-ovarienne mais aussi sa résistance dans la tique lors des différents passages de stade.

Procédures

Le virus sera injecté une fois en début de procédure. La durée de l’injection est de quelques secondes. Des prélèvements sanguins seront réalisés tous les jours pendant 15 jours consécutifs. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement sanguin final sera réalisé juste avant la mise à mort (30 secondes). Les souris seront exposées à des piqûres de tiques pendant 4-5 j pour les larves et les nymphes et environ 7 jours pour les adultes. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Il est difficile d’anticiper des symptômes spécifiques. Le début de projet est exploratoire et nous permettra de mieux évaluer l’état des animaux en fonction des doses de virus. Nous nous intéresserons donc aux signes génériques. Parmi les signes génériques, une perte de poids, une dégradation de la posture, de l’aspect général (poil hérissé, yeux fermés, grimaces).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été infectés par un virus. De plus, les organes seront prélevés pour analyse.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent. Les modèles d’infection in vitro sont imparfaits, les tiques ne se gorgent pas bien et peu parviennent aux stades suivants. D’autre part, l’utilisation de membranes de gorgement n’est pas satisfaisante car elle ne mime que très partiellement la transmission naturelle. Les études réalisées in vitro ne permettent pas actuellement de rendre compte de la complexité des interactions dans le cadre de la transmission d’une maladie par un vecteur à un hôte sensible. Il est donc nécessaire de se rapprocher des conditions naturelles de transmission en utilisant un modèle animal adapté. La souris est un modèle intéressant car il a déjà été montré qu’elle est sensible à l’infection par plusieurs virus de la famille du virus étudié.

Réduction

Dans un premier temps, nous chercherons à déterminer la cinétique de virémie de l’infection des souris par les virus. Le travail séquentiel que nous proposons et qui vise dans un premier temps à n’utiliser que les doses de virus les plus faibles notamment dans la procédure devrait permettre de réduire le nombre d’animaux si les résultats obtenus sont suffisants avec les premières doses. Dans certaines expériences des variations assez fortes du succès d'infection seront mis en évidence (par exemple, une variation de 20% à 50% du succès d'infection. Dans d’autres, le manque possible de puissance lié à l'utilisation de variables binaires sur des effectifs assez faibles sera étayé par des quantifications tout à fait complémentaires. Les analyses de puissance sont menées avec un logiciel adapté.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et bi-quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Plusieurs points limites généraux ont été définis basés sur la littérature (perte de poids, fièvre, atteinte hépatique, signes neurologiques). Lorsque l‘un de ces points limites sera atteint, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement important ou bien si leur mobilité diminue. Les animaux seront mis à mort lorsque les points limites terminaux seront atteints. Les résultats obtenus en début de projet où plusieurs lignées de souris seront testées permettront de mieux définir les symptômes et de sélectionner la lignée de souris la mieux adaptée à l’infection des tiques par la suite. Nous établirons également des points limites pertinents pour la suite du projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour l’apparition de signes cliniques jusqu’à 15 jours post-infection, notamment quand le modèle sera mis au point et les symptômes analysés. L'approche est exploratoire, en l'absence de connaissances précises dans le domaine, donc les animaux seront observés très précisément. De la nourriture semi-liquide sera mise à disposition des souris avant et après l’infection (les animaux contrôles suivront le même traitement). Si des symptômes apparaissent, les souris seront observées de façon biquotidienne. En l’absence de récupération, les souris seront mises à mort et leurs organes seront récupérés pour des analyses virologiques, histologiques et moléculaires. L’état de santé des souris sera surveillé de façon quotidienne ce qui permettra de détecter précocement tout signe de souffrance et l'atteinte éventuelle des points limites. De la nourriture semi-liquide sera mise à disposition des souris en cas de prostration ou dès lorsqu’une gêne même légère à la motricité sera observée.

Choix des espèces

Nous souhaitons posséder un modèle simple d’infection de tiques sur des souris. Il est nécessaire qu’il s’agisse d’un modèle proche de la réalité de la transmission vectorielle. Les souris sont potentiellement des réservoirs du virus Hazara. Les souris immunodéficientes s’infectent et meurent de l’infection lorsque des doses élevées sont utilisées. Les jeunes souris s’infectent avec le virus Dugbe, mais la sensibilité décroit avec l’âge. Il pourra s’avérer nécessaire d’utiliser d’autres souris présentant l’avantage d’avoir une grande variabilité génétique et certaines lignées ont déjà montré une plus grande sensibilité aux arbovirus. Les souris seront des mâles et femelles âgés de 4 semaines car il a été montré que les jeunes souris développaient une infection lente et progressive, permettant ainsi de pouvoir poser les tiques pour qu’elles soient en phase de gorgement idéalement au cours du pic de virémie.

Dix semaines de régime gras, puis un infarctus provoqué par une chirurgie de trente minutes : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur. S'y ajoutent une échocardiographie et des injections répétées, toutes les quarante-huit heures pendant dix jours ou trois fois par semaine pendant deux semaines. L'objet est de comprendre comment une maladie du foie gras aggrave la réparation du cœur après un infarctus, sur des lignées modifiées pour porter l'atteinte hépatique. Parmi les nuisances attendues, le porteur ne mentionne que l'inconfort de la contention, le stress de l'anesthésie et des douleurs post-opératoires transitoires, sans un mot sur ce que représente l'infarctus lui-même pour l'animal.

Objectifs

La maladie du foie gras, qui touche plus de 127 millions d'Européens, est fortement liée à un risque accru de complications cardiovasculaires, notamment l'infarctus du myocarde. Les décès chez les patients atteints sont d'ailleurs plus souvent d'origine cardio-vasculaire qu'hépatique. Le remodelage cardiaque est un déterminant essentiel du résultat clinique après un infarctus du myocarde impliquant des réponses biologiques complexes, notamment un engagement du système immunitaire. Cependant, le rôle causal précis de l'atteinte hépatique sur la réparation cardiaque reste non établi. Le projet a donc pour but de caractériser les effets de différents types d'atteintes tissulaires qui caractérisent la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque aux niveaux cellulaires et moléculaires, avec un accent particulier sur la réponse inflammatoire. Une approche thérapeutique sera testée pour limiter les dommages cardiaques délétères observés. Les objectifs de ce projet sont : 1. Caractériser les effets de la maladie du foie gras sur le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde chez la souris. 2. Étudier l’impact sur la réponse immunitaire, par l’analyse dans le sang, la rate, la moelle osseuse et enfin dans le coeur. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’atteinte cardiaque exacerbée associée à l'atteinte hépatique. 4. Etudier la contribution directe d'un type de cellules inflammatoires délétères: les neutrophiles.

Bénéfices attendus

À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de communication cellulaire qui contrôlent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde, ainsi que le rôle de l’atteinte hépatique dans le contrôle de l’homéostasie du cœur défaillant. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du cœur infarci, prévenir ou freiner les atteintes cardiaques, et ainsi améliorer la survie des patients.

Procédures

Exposition diète riche en matières grasses - durée 10 semaines //chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection - durée 1 minute, soit chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie, soit 3 fois par semaine durant 2 semaines postérieures à la chirurgie.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires.

Devenir

À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.

Remplacement

Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable pour étudier le dialogue pathogénique complexe entre le cœur et le foie, un phénomène qui implique de multiples types cellulaires et ne pourrait pas être entièrement reproduit par de simples modèles cellulaires. Le choix de modèles animaux qui permettent de modifier spécifiquement le foie repose sur des données préalablement observées, garantissant que les modèles reproduisent fidèlement les atteintes hépatiques souhaitées. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'un infarctus du myocarde dans un contexte de maladie du foie gras.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de la relation entre la stéatose hépatique et les maladies cardiovasculaires, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1. génétique et mécanismes : Il permet de générer les lignées génétiquement modifiées nécessaires pour induire spécifiquement l'atteinte hépatique. Ceci est crucial pour décortiquer les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires du dialogue cœur-foie. 2. reproductibilité et rurveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques et vasculaires associées à la maladie du foie dans un délai de temps pertinent. 3. complexité biologique : Contrairement aux modèles in vitro, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions inter-organes (cœur et foie) impliquées dans le remodelage cardiaque post-infarctus. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 10 semaines minimum. Ce choix est fait pour s'assurer que le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. Utiliser des souris plus jeunes risquerait d'introduire un biais, car elles n'auraient pas systématiquement atteint la puberté, et les hormones sexuelles sont connues pour jouer un rôle dans le remodelage cardiaque post-infarctus.