Recherche appliquée

Privées de leurs ovaires et ligaturées des cornes utérines au cours d'une opération de vingt à trente minutes, 500 souris femelles entrent ensuite dans un protocole pouvant durer cinq mois. Elles reçoivent des molécules candidates par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intra-articulaire, intraveineuse ou orale, des prises de sang hebdomadaires effectuées sur animal éveillé, puis deux injections de marqueurs osseux dans les deux dernières semaines. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et le porteur attend, selon les molécules testées, des pertes de poids, des prostrations, des vocalisations anormales ou des nécroses au point d'injection. Toutes sont tuées et autopsiées, os, sang et liquide synovial prélevés pour doser les principes actifs.

Objectifs

Avec l’allongement de l’espérance de vie, l’ostéoporose et les fractures qui lui sont associées représentent un problème de santé publique important : autour de l’âge de 65 ans, on estime que 39% des femmes souffrent d’ostéoporose. En effet, la ménopause est une période clé pour la santé de la femme car elle s’accompagne de modifications physiologiques comprenant, notamment, une modification de la composition corporelle (baisse de la masse maigre et augmentation de la masse grasse) et un changement de la répartition des graisses corporelles conduisant notamment à un risque élevé pour la santé cardiovasculaire, métabolique , ostéo-articulaire et musculaire (perte de densité osseuse, fonte musculaire, …). A ce jour les traitements existants réduisent la perte osseuse mais présentent des effets secondaires importants qui peuvent altérer la qualité de vie des patients. Le présent projet a donc pour but d’évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques pouvant cibler la perte osseuse dans un contexte d’ostéoporose sans induire d’effets néfastes. L’objectif du projet est donc d’évaluer l'effet de nouvelles molécules thérapeutiques sur le processus de formation et de résorption de l’os dans un modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie chez la souris (modèle qui consiste à retirer les ovaires de l’animal, mimant l’ostéoporose post-ménopause rencontrée chez l’Homme, décrit et reconnu par la communauté scientifique), afin de proposer aux professionnels de la santé et aux patients des approches thérapeutiques plus appropriées. Ce modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie a pour principaux avantages (i) de mimer le développement d’une ostéoporose post-ménopause, avec une reproductibilité élevée pour analyser de manière robuste et efficace les mécanismes mis en jeu dans le développement de la pathologie et dans la réponse induite par les nouvelles molécules thérapeutiques testées (ii) d’accéder à de plus amples informations indispensables au développement de nouvelles approches thérapeutiques (iii) d’être prédictif en clinique de l’activité des nouvelles molécules thérapeutiques testées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra à court terme d’obtenir des informations sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité des nouvelles molécules thérapeutiques étudiées au niveau général et osseux (ii) l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques étudiées dans un contexte d’ostéoporose. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle des modifications physiologiques ayant lieu post-ménopause, d’établir des diagnostics robustes et de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie pré- et post-opératoire afin de réaliser l’ablation des ovaires et une ligature des cornes utérines. Cette opération dure 20 à 30 minutes par animal. Les traitements à tester seront appliqués plusieurs jours avant et/ou après l’induction du modèle et répétés tout au long de la durée de l’étude, 5 mois maximum après l’ablation des ovaires. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon le ou les nouvelles molécules thérapeutiques utilisées pour chaque étude. Les voies d'injections possibles sont : sous-cutanée, intra-péritonéale, intra-articulaire, intra-veineuse ou per os. Des injections sous-cutanées de produits permettant le suivi de la formation osseuse seront réalisées dans les 2 dernières semaines du protocole. Chaque animal recevra 2 injections à 1 semaine d’écart, chacune durant de 1 à 2 min. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire pourront également être réalisés, ces prélèvements auront lieu sur animal éveillé, dureront moins de 5 min par animal, et pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole. Un prélèvement terminal de liquide synovial pourra également être réalisé.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées au modèle et à l’induction et au développement de l’ostéoporose. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par l’acte chirurgical, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de l’incision réalisée pour l’ablation des ovaires. Des nuisances liées aux nouvelles molécules thérapeutiques à tester peuvent être rencontrés, tels qu’une perte de poids, un comportement anormal de l’animal (prostration, état défensif, hérissement des poils, vocalisation anormale, …), une toxicité durant l’administration (cri, agitation, difficultés respiratoires, diarrhées, inflammation/nécrose au site d’administration). Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique inhérente aux nouvelles molécules thérapeutiques à tester.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les os, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et synoviaux seront utilisés pour doser le principe actif et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les principes actifs et/ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière générale, les nouvelles molécules thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des molécules thérapeutiques testées, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies rhumatismale, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes et la complexité de la pathologie. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs à tester, 10 animaux par groupe et 10 conditions (groupes) au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le raffinement du nombre des animaux. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu à la baisse après analyse des premiers résultats avant chaque protocole et dans le cas où le traitement évalué est connu (e.g., traitement de référence), afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des traitements anti-douleur dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux, sera effectué ainsi qu’un suivi approfondi au minium 2 fois par semaine, avec prise de poids et observations des caractéristiques spécifiques au modèle, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de l’incision réalisée pour l’ovariectomie. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs point(s) limite(s) (repérés le plus précocement possible grâce au suivi clinique et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera mis-à-mort. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort (lors de l’administration du traitement expérimental, des prélèvements de sang et lors des prises de mesures).

Choix des espèces

La souris a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et des réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observées chez l'Homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent d’extrapoler assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent l’extrapolation des petits animaux aux humains (première dose de principe actif chez l’homme) connue sous le nom de dose équivalente humaine (HED)) dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux molécules thérapeutiques. Les souris femelles et adultes auront dépassé la majorité squelettique (âgés de plus de 8 semaines ). Autrement-dit leur squelette ne sera plus en phase de croissance.

Tester l'appétence et l'effet sur le poids d'un ingrédient alimentaire mis au point par un client industriel : 40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe soixante-trois jours seule en cage, subit dix-huit pesées, deux prises de sang à la queue et deux injections de solution saline. Le porteur reconnaît que l'isolement pèse sur une espèce sociale et précise que les souris gardent un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Il décrit l'étude in vivo comme une "étape règlementaire incontournable" pour constituer un dossier d'essais chez l'être humain, alors que le produit évalué est une formulation destinée à enrichir l'alimentation.

Objectifs

Le client a mis au point une nouvelle formulation destinée à enrichir l’alimentation standard. L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité de ce composé à des doses élevées, en mesurant son impact sur le poids corporel et la consommation alimentaire chez la souris. Une attention particulière sera portée à l’appétence du régime enrichi, afin de déterminer si la nouvelle formulation influence le comportement alimentaire des animaux exposés.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les sources alimentaires sont relativement variées et accessibles. Cependant, un enjeu majeur réside dans le fait que nombre de produits disponibles sont fortement transformés, ce qui entraîne une perte significative en nutriments. Notre client, acteur engagé dans le secteur agroalimentaire, adopte une approche novatrice en valorisant une source nutritionnelle plus durable et respectueuse de l’environnement. L’étude préclinique que nous menons s’inscrit dans la continuité de plusieurs recherches préliminaires réalisées in vitro. Elle a pour objectif de démontrer l’efficacité de cette nouvelle formulation. En cas de résultats favorables, une évaluation en conditions cliniques sera envisagée. À terme, cette approche pourrait permettre de développer une ressource nutritionnelle à la fois riche en nutriments, dotée de qualités texturales intéressantes, et capable d’améliorer sensiblement la qualité nutritionnelle des produits.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Hébergement individuel (63 jours) ; 2) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (18 mesures ; durée : env. 1 minute) ; 3) Prélèvements sanguin à la queue (2 prélèvements, durée du prélèvement : 2 minutes). 4) Administration d’une solution saline (2 administrations ; durée : 1 minute).

Impact sur les animaux

De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel ainsi que le placement en boîte de contention lors des prélèvements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. Enfin, l’administration d’une solution saline occasionnera également une douleur de faible intensité et de courte durée pour les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après mise à mort pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et la consommation en eau sur le comportement alimentaire. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris soumis à une alimentation standard. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La souris est l'un des modèles murins les plus classiquement utilisés et les mieux documentés dans le cadre d'études précliniques menées dans le secteur agroalimentaire. A la réception, les 40 animaux seront âgés de 8 semaines (17 semaines à l'issue de l'étude). Le stade de développement de ces animaux correspond à la population cible du composé développé.

Jusqu'à soixante minutes d'immobilisation par test de sensibilité tactile, chaque semaine : 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent des injections répétées de bortézomib, un anticancéreux qui provoque une neuropathie douloureuse, pour vérifier si un oméga-3 en limite les effets. Le porteur indique que l'induction de cette neuropathie constitue en elle-même une nuisance modérée qu'il juge "indispensable", et suit l'allodynie tactile et thermique, une douleur déclenchée par un stimulus normalement indolore. Le rat est retenu parce que l'équipe a déjà travaillé sur ce modèle et dispose des doses et des durées de traitement.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier l'effet d'un oméga-3 sur le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique et d'améliorer la compréhension de l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max). La mesure de la conduction se fera sur animal sous anesthésie permettant la pose des capteurs au niveau du nerf sciatique (3-5 min max) avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux (suivi quotidien du poids permettant un ajustement des doses ainsi que du bien-être de nos animaux). A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation des troubles du toucher et de la perception de la température au travers de tests comportementaux rapides et indolores. La mesure de la conduction nerveuse pourra être réalisée sur animal sous anesthésie gazeuse (capteurs cutanés) avant sa mise à mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score basée sur le comportement de l’animal a été créée pour évaluer son niveau de souffrance et repérer une dégradation trop importante de son état, pouvant conduire à sa mise à mort anticipée.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

Greffées sous la peau d'un fragment de tumeur humaine, 3 000 souris immunodéficientes subissent jusqu'à seize prélèvements sanguins et jusqu'à quatre administrations par jour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, pour prélever leurs organes et parce que les atteintes subies les rendent inutilisables ailleurs. Les quarante études prévues mesurent la diffusion et l'élimination de candidats médicaments dans le sang, les organes et la tumeur, à un stade précoce du développement. Le porteur écrit que ces travaux mobilisent un "nombre strictement minimal" d'animaux.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester de nouveaux traitements contre le cancer sur des souris afin de déterminer la façon dont ils se propagent (diffusion) puis sont éliminés (persistance) dans l’organisme (à travers le sang, les différents organes et la tumeur). En effet, dans le cadre du développement de médicaments, il est essentiel de réaliser ces analyses pour comprendre la façon dont ces nouveaux médicaments agissent et impactent l’organisme, afin d’adapter au mieux la posologie future. Ces analyses sont réalisées sur des animaux ayant développé un cancer, car la tumeur peut avoir un impact sur la diffusion des traitements dans le corps. Pour cela, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines implantés chez la souris. Ces modèles, appelés xénogreffes dérivées de patients (PDX), permettent de reproduire au mieux les caractéristiques des tumeurs humaines, comme leur morphologie, leurs mutations et leur comportement biologique. Grâce à cela, ils offrent un moyen fiable d’évaluer l’action de nouveaux médicaments avant qu’ils ne soient testés chez l’Homme. Notre collection de modèles PDX couvre la majorité des cancers solides (par exemple : sein, poumon, côlon, foie, rein, peau, pancréas, ovaire, vessie, cerveau ou prostate) et reflète la diversité des patients. Les 40 études prévues dans ce projet sont réalisées à un stade précoce du développement des médicaments. Elles consistent à traiter des animaux ayant développé un cancer avec le ou les traitements d’intérêt, et réaliser des prises de sangs à différents intervalles, puis des prélèvements d’organes et de tumeurs post-mortem. Le but de ces prélèvements est d’évaluer la présence du ou des traitements dans le corps de l’animal et d’étudier leurs effets sur les organes. Les résultats permettront de déterminer des conditions d’administrations idéales par rapport à la durée de vie du médicament dans l’organisme, pour observer un effet sur la tumeur, mais en impactant au minimum les autres organes. Par la suite, l’efficacité des traitements à cette posologie sera étudiée sur de plus grands effectifs pour obtenir des données robustes sur l’effet antitumoral.

Bénéfices attendus

Chaque année, dans le monde, près de 20 millions de personnes sont diagnostiquées atteintes d’un cancer (tous types confondus) dont plus de 400 000 en France, et on recense plus de 10 millions de décès (1/6) dont plus de 150 000 en France. Le nombre de personnes atteintes d’un cancer est en constante augmentation, mais les progrès en terme de développement de traitements depuis 25 ans ont permis d’observer une diminution de la mortalité. La recherche de nouvelles solutions thérapeutiques est essentielle pour espérer diminuer le taux de mortalité dû au cancer, ainsi que limiter les effets indésirables pour les cancers avec des taux de guérison les plus élevés. Les nouveaux médicaments sont innovants car ils peuvent être développés à partir de nouvelles molécules, de nouveaux procédés de fabrication ou encore provenir de l’élargissement de l’utilisation de médicaments déjà connus auparavant pour d’autres maladies et/ou qui peuvent montrer un intérêt dans d’autres situations médicales. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d’évaluer la propagation et la persistance de traitements dans l’organisme de souris ayant développé une tumeur, en réalisant des prélèvements biologiques (prises de sang, prélèvements d’organes) qui seront analysés en laboratoire. En fonction de la durée de vie, des effets directs (effet sur la tumeur) et indirects (effets secondaires) des médicaments dans l’organisme, les conditions optimales seront sélectionnés afin de tester leur effet antitumoral. A terme, ces travaux devraient permettre de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques aux patients pour lesquels les traitements actuels provoquent de nombreux effets secondaires. Ils participeront également à améliorer l’efficacité des traitements actuels ou identifier de nouveaux médicaments pour les patients pour lesquels les traitements sont inefficaces ou inexistants.

Procédures

Greffe : implantation d’un fragment ou de cellules tumoral(es) sous la peau. Le temps de chirurgie n’excèdera pas 10 minutes. Surveillance des animaux : observation quotidienne du comportement par déplacement et/ou ouverture des cages d’hébergement. Administration de médicament : préhension des animaux à une fréquence dépendant du schéma de traitement : 4 fois par jour ou moins. La durée de préhension n’excèdera pas 1 minute. Prélèvement de sang : préhension des animaux à une fréquence dépendant des besoins en prélèvements, 16 prélèvements seront effectués maximum par animal. La durée de préhension n’excèdera pas 2 minutes.

Impact sur les animaux

Stress dû à l’administration de molécules: nuisance transitoire (plusieurs minutes) de classe légère jusqu’à 4 fois par jour selon le schéma de traitement ; Douleurs post-opératoires: nuisance transitoire (plusieurs heures) de classe modérée; Risque d’infection: nuisance transitoire (plusieurs jours) de classe modérée; Perte de poids (cachexie, anorexie ou perte d’appétit): nuisance transitoire (plusieurs jours) de classe modérée; Diarrhée: nuisance transitoire (plusieurs jours) de classe modérée ; Contention en tube pour prélèvement sanguin : nuisance transitoire (plusieurs minutes) de classe légère.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour réaliser les analyses associées (biologiques, histologiques) et compte tenu des nuisances occasionnées.

Remplacement

Le développement de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests précliniques afin de valider leur absence de toxicité sur l’organisme et leur efficacité sur la croissance tumorale, avant une application chez l’Homme. Il existe des méthodes alternatives et préalables à la réalisation de tests sur les animaux (prédictions informatiques, in vitro …), permettant de tester rapidement un grand nombre de molécules, et de sélectionner celles qui semblent les plus efficaces. Cependant, ces méthodes réalisées en dehors du cadre d’un organisme vivant n’offrent pas la possibilité de lier les effets des traitements avec la complexité de l’organisme, par exemple elles ne prennent pas en compte l’effet de la circulation sanguine ou le rôle du foie dans la transformation et la distribution des médicaments. Cela limite la possibilité de prévoir comment un traitement agira réellement dans le corps d’un patient. C’est pourquoi, une fois les tests préliminaires terminés, et les molécules les plus prometteuses identifiées, il est nécessaire de poursuivre leur évaluation chez l’animal. Ces études sont réalisées sur un nombre strictement minimal d’animaux pour collecter les échantillons biologiques nécessaires à l’étude de la propagation et de la persistance des molécules testées.

Réduction

Ce projet utilise le nombre d’animaux strictement nécessaire pour étudier la propagation et la persistance de nouveaux médicaments dans l’organisme, via la collecte d’échantillons biologiques. Les traitements évalués ont été sélectionnés au préalable par des études in vitro et/ou in vivo pour leur potentiel thérapeutique. Les conditions expérimentales sont optimisées pour réduire au maximum le nombre d’animaux lorsque cela est possible (par exemple, regroupement d’études pour n’utiliser qu’un seul groupe contrôle, ou flexibilité sur les conditions de début de traitement des animaux). Les expériences sont réalisées sur des groupes de souris de taille minimale pour collecter les prélèvements nécessaires à l’analyse biologique des effets des médicaments testés, avant de valider l’efficacité tumorale de ces médicaments, et avant des essais cliniques chez l’Homme.

Raffinement

Pour prévenir l’hypothermie durant l’acte chirurgical, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Pour la prévention de la douleur et la souffrance lors de l’acte chirurgical et lors de prélèvements invasifs, les animaux recevront une anesthésie générale. Les produits d’anesthésie générale proposés sont suffisants pour obtenir un effet anti-douleur en plus de l’effet anesthésique profond pour le temps et le type d’intervention réalisée. Pour les soins, si une lésion ou une sécheresse sont observées au niveau de la sphère oculaire, une solution nettoyante et/ou protectrice sera appliquée. Si une lésion cutanée est observée, une solution antiseptique sera appliquée. En cas d’infection, des analyses bactériologiques et/ou virologiques pourront être effectuées pour instaurer une thérapie adéquate et l’animal pourra être isolé pour lui permettre de se rétablir sans la présence de ses congénères. Dans ce cas, divers matériaux seront ajoutés pour atténuer l’effet d’isolement et permettre la création d’un cocon. Après l’administration de molécules, l’animal sera observé pour détecter tout comportement inattendu. Aussi, un point de compression sera réalisé au site d’administration si nécessaire. Si ces points de raffinement ne sont pas suffisants, les mesures associées aux points limites de ce projet seront appliquées.

Choix des espèces

Nous utilisons des souches murines immunodéficientes qui sont classiquement utilisées pour des greffes de cellules tumorales humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, âgés entre 5 et 13 semaines pour augmenter nos chances de succès.

88 rats atteints d'une dystrophie musculaire génétique vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun recevant une injection sous la peau ou dans l'abdomen, ou un gavage, tous les jours pendant trois mois. À un mois, deux mois et trois mois, chaque animal passe un test d'agrippement de vingt minutes et un électrocardiogramme, avant un prélèvement sanguin sous anesthésie à la fin du traitement, tous étant ensuite tués pour des analyses histologiques et moléculaires. Le porteur signale que les rats dystrophiques réagissent au stress plus fortement que la normale et se figent plusieurs minutes, et qu'une griffe trop longue peut casser pendant le test d'agrippement. Le composé testé a déjà montré son efficacité sur une dystrophie légère chez la souris, et le porteur écrit espérer que son administration chez les patients réduira la fonte musculaire qui les handicape.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. La dystrophie de Duchenne est causée par des changements dans le gène DMD et touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la quantité réduite de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence complète de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. Jusqu'à présent, aucun traitement n'a été trouvé pour prévenir la maladie chez les personnes porteuses d'anomalies génétiques. L'objectif de notre étude est d'arrêter la progression de la maladie en utilisant de nouvelles substances qui empêchent la perte musculaire et améliorent la connexion entre les muscles et les nerfs qui déclenchent leur contraction. Il est attendu que ces substances contribueront à une amélioration de la contraction synchronisée des muscles et du cœur.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire évalue des thérapies novatrices que nous testons sur des modèles aussi pertinents que possible. Le composé innovant étudié ici, dont l'efficacité a été démontrée sur un modèle de dystrophie légère chez la souris, sera évalué dans nos modèles atteints de dystrophies sévères, similaires à celles identifiées chez les patients. Ces dystrophies ont des effets dévastateurs sur les muscles et le cœur. Le composé innovant cible plusieurs mécanismes originaux qui, combinés, devraient limiter la perte musculaire et améliorer la connexion entre les cellules. Cela favorisera la contraction harmonieuse des muscles utilisés pour marcher, respirer et faire circuler le sang. Dans l'ensemble, nous espérons que l'administration de ce traitement chez les patients permettra de réduire la fonte musculaire qui les handicape.

Procédures

Avant le début de la procédure, chaque animal sera soumis à deux tests légers : un test d'agrippement et un électrocardiogramme (ECG), chacun durant respectivement 20 et 10 minutes. [MODIFICATION] Ensuite, le traitement sera administré chaque jour par injection sous la peau, ou dans la zone de l’abdomen, ou par la bouche [FIN MODIFICATION]. L'administration dure 15 secondes. Un mois, deux mois et trois mois après le début du traitement, les animaux seront à nouveau soumis à un test d'agrippement et à un ECG. À la fin du traitement, soit trois mois après son démarrage, les animaux seront anesthésiés une ou deux fois par une injection sous la peau (20 secondes). Une fois endormis, les animaux se verront prélevés leur sang au moyen d'un geste de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Également, de possibles réactions de la peau consécutives aux injections multiples sur un même site.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Tout ce qui pouvait être testé sur l'efficacité des composés sans utiliser d'animaux a été réalisé avant le début de ce projet. Nous avons confirmé l'absence de toxicité des substances et de tous leurs métabolites chez les souris et les rats. Sur la base de ces résultats solides, notre objectif dans ce projet est de répondre à la question qui ne peut être abordée que chez l'animal vivant, avec tous ses organes en interaction constante : est-ce que l'action des substances innovantes testées permettra de ralentir efficacement la progression de la maladie musculaire ? Le cas échéant, par quels mécanismes moléculaires à l'intérieur des cellules ?

Réduction

Notre laboratoire a rassemblé une grande quantité de données à partir des modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons perfectionné la correction des données avant de les analyser statistiquement. En se basant sur le calcul de la puissance statistique, il est recommandé d'utiliser seulement 8 rats par groupe. Ce nombre a été confirmé par d'autres projets similaires déjà terminés, pour lesquels des conclusions biologiques ont été obtenues. Pour nos analyses, nous employons des méthodes statistiques adaptées selon que nous comparons 2 ou 3 groupes d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des pièces avec contrôle continu de la température et de l'humidité de l'air ambiant. Le cycle d'éclairage des pièces respecte une alternance jour/nuit fondée sur les besoins naturels des animaux. Nous avons choisi de les élever dans les plus grandes cages disponibles sur le marché, leur permettant de marcher et de se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est adapté à l'évaluation de leur capacité locomotrice. Dans les cages, les rats ont un accès libre à la nourriture et à l'eau fournies à volonté. Les rats sont des animaux sociaux. Aussi, nous les hébergeons avec des congénères dans la même cage. Leur environnement est par ailleurs enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons en bois à ronger, des balles, des tunnels et des carrés de coton compacté. Pour éviter toute réponse de stress, les animaux sont habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, de la manière la plus douce possible. Le suivi des animaux est assuré par un personnel compétent capable de reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur chez les animaux. Nous avons établi une grille d'évaluation de la douleur, avec des points limites définis et affichés dans les pièces d'hébergement. Les rats sont constamment évalués en observant chaque individu, même les week-ends et les jours fériés. En cas d'anomalie, des mesures correctives sont prises. En cas d'absence de bénéfice suite au traitement prescrit, nous pratiquons une euthanasie compassionnelle. Elle permet d'éviter toute souffrance à l'animal.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de l'humain, ce qui en fait un modèle apprécié pour la recherche. Grâce aux récents outils de modification du génome, le rat est devenu un choix privilégié pour l'étude des troubles musculosquelettiques. Nos modèles de rats reproduisent fidèlement les myopathies humaines et sont appréciés en recherche médicale. Pour ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 3 à 9 mois. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade.