Recherche appliquée

L'enjeu déclaré est la validation réglementaire de dispositifs d'assistance cardiaque mécanique avant leur pose chez des patients. 200 moutons, 100 bovins et 50 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour nécropsie et examen histopathologique du site d'implantation. Chaque animal subit une, parfois deux interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures, jusqu'à douze examens d'imagerie sur six mois, des jeûnes de douze à seize heures avant chaque anesthésie et des prélèvements sanguins pouvant aller jusqu'à un par jour. Le porteur qualifie l'expérimentation sur "organisme entier" d'"incontournable" et la présente comme une "obligation règlementaire", tout en précisant qu'aucune approche statistique n'a servi à fixer l'effectif.

Objectifs

Les dispositifs d'assistance cardiaque mécaniques permettent de suppléer aux défaillances cardiaque et/ou respiratoire en assurant le débit circulatoire nécessaire et l’oxygénation. Ces appareils peuvent temporairement ou de façon plus durable aider le coeur dans son rôle de pompe dans le cas des insuffisances cardiaques sévères par exemple. Ces dispositifs sont de différents types, il peut par exemple s'agir d'un dispositif externe d'Oxygénation par Membrane Extracorporelle (ECMO), d'une prothèse ventriculaire implantable, d'un ballonnet implantable au niveau de l'aorte, ou d'un coeur artificiel total. Les dispositifs d'assistance ventriculaire gauche sont particulièrement intéressants pour les patients en attente d'une greffe du cœur. En raison de la forte demande de cœurs par rapport au nombre de cœurs disponibles pour un don, un dispositif d'assistance ventriculaire gauche peut véritablement sauver des vies. Ils peuvent également servir en attendant que la fonction cardiaque se rétablisse (assistance à la réadaptation) ou en tant que traitement à long terme à l’intention des patients d’insuffisance cardiaque en phase terminale et qui ne sont pas candidats à une greffe. Tous les dispositifs d'assistance cardiaque implantables nécessitent un système d'alimentation et de transmission de l'energie pour pouvoir fonctionner. Ce projet de recherche a pour objectif le développement et l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité de nouveaux dispositifs et techniques d'assistance cardiaque mécanique pour le traitement de l'insuffisance cardiaque. Ce projet se déroulera dans 2 Etablissements Utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire , corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins de faible volume à des fins de biologie médicale sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. Les fréquences maximales des prélèvements pouvant être d’un prélèvement par jour sur une courte période de quelques jours à une semaine ou d’un prélèvement par semaine jusqu’à 6 mois. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Préalablement aux anesthésies générales, les animaux seront mis à jeun pour une durée de 12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins. - Le nombre maximal d’examens d’imagerie par animal pourra aller jusqu’à 12 sur une période de 6 mois. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif cardio-vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion vasculaire, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées, autorisés par la Direction Départementale de la Protection des Populations, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis et revêtements antidérapants, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV).Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système cardio-vasculaire du mouton, du bovin, et du porc reproduisent fidèlement la physiologie cardiaque humaine et le processus de cicatrisation du coeur et des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards chez l'Homme. - L'ovin est le modèle pertinent pour l'évaluation de la durabilité des dispositifs chez l'Homme. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs ainsi que pour évaluer les systèmes d'ancrage des dispositifs. - Le modèle veau est pertinent pour sa taille et son fort développement thoracique. - L'ovin, le bovin et le porcin possèdent des cavités thoracique et abdominales qui permettent d'implanter les dispositifs d'assistance ainsi que les systèmes de transfert d'énergie associés. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.

Dès qu'une souris atteint trois points sur la grille de score clinique, elle est mise à mort. 160 souris porteuses d'une mutation mitochondriale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements post-mortem. Elles reçoivent deux immunosuppresseurs dans leur nourriture à partir du sevrage, avec pesée, température rectale et notation clinique au moins trois fois par semaine, et passent trois séances de dix minutes sur rotarod à quarante jours, alors que le porteur situe le début des difficultés à se mouvoir vers quatre semaines. L'objectif déclaré est de vérifier si deux molécules déjà testées sur un autre modèle murin du syndrome de Leigh agissent aussi sur celui-ci, donc de généraliser un résultat publié à un second gène.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront mises à mort (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

Recevant successivement tous les traitements testés dans un dispositif en carré latin, sept vaches laitières en lactation sont réutilisées d'une période à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à trois prélèvements de contenu ruminal par sonde naso-œsophagienne, dix-huit prélèvements de fèces au rectum, dix-huit prélèvements d'urine obtenus par palpation sous la vulve et sept prises de sang, tous sur animal vigile. Le porteur reconnaît que la palpation répétée peut provoquer rougeur et sensibilité, et que la contention laisse les vaches inconfortables. L'essai mesure l'effet d'additifs alimentaires sur la production laitière, et chaque animal rejoint ensuite son aire d'élevage.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact d’additifs alimentaires sur les performances zootechniques de la vache laitière (quantité et qualité de lait produit) et de comprendre le mode d’action de ces additifs afin de fournir des recommandations d’utilisation sur le terrain (dose, type d’alimentation, statut physiologique de l’animal…). Afin de comprendre les modes d’actions, plusieurs leviers physiologiques seront étudiés : la modulation de l’écosystème ruminal, le métabolisme (digestibilité et bilan azoté) et le statut immunitaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - évaluer les effets des additifs sur les performances de production laitière en quantité et en qualité, - comprendre le mode d’action des additifs et leurs effets sur l’écosystème ruminal, - évaluer les effets des additifs sur la digestibilité, - évaluer l’effet des additifs sur le statut immunitaire. L’évaluation de l’effet des additifs permettra ainsi de définir les meilleures stratégies alimentaires et d’identifier les axes d’amélioration pour 1) améliorer les bien-être des animaux, 2) augmenter les gains économiques des éleveurs, 3) réduire l’empreinte environnementale et 4) réduire l’utilisation des antibiotiques et à terme développer des modèles digestifs in vitro pour réduire et remplacer complétement ou partiellement l’utilisation des animaux ex expérimentation animale.

Procédures

Le prélèvement de contenu ruminal : le prélèvement sera effectué au maximum 1 fois/mois/animal (3 prélèvements maximum). La durée de l’intervention est de 5 minutes. Le prélèvement sera réalisé par sonde une heure avant le repas du matin. Les prélèvements de fèces : 6 prélèvements/vache/période (18 prélèvements maximum). La durée de l’intervention est de 2 à 5 minutes. Les prélèvements d’urine: 6 prélèvements/vache/période (18 prélèvements maximum). La durée de l’intervention est de 5 à 10 minutes. Les prélèvements de sang : 2 prélèvements/vache/période (6 prélèvements maximum), et un dernier prélèvement à la fin de l’essai sera réalisé sur chaque vache (1 prélèvements au maximum/vache). Soit un total de 7 prélèvements durant l’essai. La durée de l’intervention est de 2 à 5 mn. Tous les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les risques de lésions de l’œsophage sont extrêmement faibles car nous utilisons du matériel médical (Sonde naso-œsophagienne en PVC silicone pour poulain, Alcyon) suffisamment souple pour ne pas léser un organe élastique tel que l’œsophage. La cavité buccale, le pharynx et l'œsophage possède un épithélium malpighien soit un épithélium pavimenteux pluristratifié résistant l’abrasion. Néanmoins, même si le risque est très faible, il faudra vérifier que les animaux mangent bien après le prélèvement. Un contrôle visuel de ration distribuée sera effectué pour chaque vache. Ensuite à la fin de la journée, la quantité restante sera pesée pour évaluer les quantités ingérées. Une chute brusque et prolongée de l’ingestion (15-20%) déclenchera l’intervention d’un vétérinaire. Même si toutes les précautions seront prises pour atténuer les effets indésirables sur les animaux, il se peut que les animaux soient dans un état d'inconfort lors de leurs contentions pour les prélèvements de liquide ruminal ou du sang. La zone de prélèvement sanguin est pressée pendant 1 à 2 mn pour éviter l’apparition des hématomes. Néanmoins un petit gonflement de la zone piquée peut apparaitre. Après les prélèvements, les vaches restent sous contrôle. Les prélèvements urinaires se feront par palpation de la zone sous la vulve et peuvent engendrer selon la durée, une rougeur et une sensibilité à la touche de la zone concernée. Les prélèvements fécaux se feront directement au rectum en utilisant des gants humidifiés. Même si le geste est rapide, il se peut que les animaux soient dans un état d’inconfort.

Devenir

L’animal est ensuite libéré et rejoint son aire d’élevage

Remplacement

Une méthode alternative in vitro permettra de remplacer la méthode traditionnelle dite in sacco qui consiste à placer des sachets contenant 5 g d’aliment chacun dans le rumen des vaches à travers les canules. La méthode in vitro donnera une indication sur la dégradabilité des matières premières composant la ration. Elle permet aussi d’étudier l’écosystème ruminal. La conservation du liquide ruminal par cryopréservation permettra de remplacer les vaches donneuses de liquide ruminal. Pour cette procédure, nous ne pouvons remplacer complètement l’animal, mais on substitue une partie du protocole in vivo en in vitro.

Réduction

Les essais seront menés en un design expérimental en carré-latin. Ainsi, toutes les vaches recevront les différents traitements successivement. D’après des études statistiques, un minimum de 6 vaches (2 vaches par groupe et par période) et une (témoin) sont nécessaires à l’obtention de résultats interprétables. Cet effectif est en accord avec les études récentes portant sur les performances zootechniques des vaches ayant reçu un additif alimentaire à base de levure

Raffinement

Les prélèvements d’échantillons de fèces et d’urine se feront au même moment pour réduire au maximum la manipulation et la contention des animaux. Les animaux seront surveillés en permanence pour contrôler leur comportement et chaque risque de souffrance ou détresse. Les prélèvements fécaux directement au rectum et d’urine à des heures bien précises viennent remplacer l’utilisation des cages métaboliques considérées comme la méthode de référence pour mesurer la digestibilité et les bilans azotés. Au lieu de suivre l’ingestion journalière qui nécessite parfois une manipulation des animaux, des échantillons de rations distribuées et des échantillons fécaux seront analysés pour leurs compositions chimiques. Ensuite, des marqueurs type cendres insolubles dans l’acide seront utilisés pour estimer la digestibilité. Pour les prélèvements urinaires, par rapport à la méthode utilisée qui consiste à stimuler la zone sous la vulve par palpation, des gants humidifiés seront utilisés. La palpation ne sera pas en continue avec des petits temps de repos (Palpation-repos-palpation-repos…) jusqu’à la miction. En ce qui concerne le prélèvement de liquide ruminal, un système de lève tête sera utilisé pour bien positionner la tête de l’animal et faciliter l’entrée de la sonde à travers l’œsophage. Cette technique permettra de réduire le temps de manipulation. Des critères physiologiques comme la production laitière, l’état de la mamelle, l’ingestion, le poids et la note d’état corporel serviront comme critères de prise de décision. Des critères d’évaluation allant de 0 à 3 pour chaque critère seront établis avec 0 (état normal) et 3 (changement très important par rapport à la normale). Dans le cas d’un changement important, le recours à l’avis d’un vétérinaire sera pris en compte. Les prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié et habitué aux gestes, à l’aide d’un cornadis adapté à la contention de bovins adultes et auquel les vaches sont habituées.

Choix des espèces

En ruminant, la vache est le modèle animal le plus utilisé pour comprendre le mode d’actions de produits et leurs effets sur les paramètres zootechnique, l’immunité et l’environnement. Pour répondre aux objectifs du projet, l’utilisation de l’animal est obligatoire. La mise en place de protocoles in vitro nécessite l’utilisation d’inoculum (contenu ruminal par exemple) provenant de l’animal dans le but d’alimenter les systèmes in vitro. Pour ces raisons, l’utilisation de bovins adultes est obligatoire. Dans ce projet, les animaux seront tous des animaux adultes en phase de lactation

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intraveineuses d'un vecteur lentiviral porteur d'ARN, à trois semaines d'intervalle, et sept prélèvements sanguins destinés à doser les cytokines. Le projet mesure la réaction inflammatoire au vecteur avant son usage chez l'humain, pour le compte d'une société qui a repoussé le démarrage de deux ans, le temps d'une restructuration et de ses levées de fonds. Le porteur énumère les méthodes disponibles sans animaux, cellules immunitaires en culture, organes sur puce, organoïdes, biobanques de tissus humains et simulation, avant de conclure qu'aucune ne permet d'évaluer une cascade inflammatoire dans un organisme entier.

Objectifs

L’étude de la réponse inflammatoire dans un modèle de souris est essentielle pour évaluer la sécurité, l’efficacité et la faisabilité de l’utilisation d’un produit à visée thérapeutique. Elle contribue à orienter son développement, optimiser les protocoles d’administration, et à garantir la sécurité de ce type de thérapie. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer la réponse inflammatoire pouvant survenir après l’injection d’un vecteur non intégratif pouvant délivrer de l’ARN chez l’animal. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. L’injection intra veineuse sera testée, avec un rappel d’injection 3 semaines plus tard. Les analyses consisteront en un dosage de la sécrétion de cytokines dans le sang. MODIFICATION: ce projet démarre 2 années plus tard que prévu, en raison d'une restructuration de la société, priorisation des projets et finalisation des levées de fonds; d'où la demande de prolongation de la durée sur 4 ans au total. Par ailleurs, nous souhaitons rajouter un prélèvement sanguin avant l'injection des vecteurs, afin d'obtenir le niveau basal d'expression des cytokines.

Bénéfices attendus

Cette étude de la réponse inflammatoire chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en évaluant la réaction du système immunitaire; - d’identifier les caractéristiques du produit pouvant provoquer une réponse inflammatoire; - de prédire les réponses immunitaires humaines possibles.

Procédures

Les animaux recevront 2 injections par voie intraveineuse (durée 2-3 minutes). On réalisera 6 - MODIFICATION: 7 - prélèvements sanguins (durée 2-3 minutes)

Impact sur les animaux

Dans le cadre d’une étude de la réponse inflammatoire, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. L’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN par voie intraveineuse peut entrainer un stress ou une douleur chez l'animal, Par ailleurs, ces souris subiront des prélèvements sanguins pouvant également induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales. Etant donné que ces souris seront injectées avec un vecteur lentiviral, on ne pourra pas les ré-utiliser. Les animaux seront ainsi euthanasiés en fin de procédure expérimentale, pour ne pas les maintenir en vie inutilement.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal pour une étude de de la réponse inflammatoire peut se faire selon l'utilisation : - de modèles in vitro, avec des cellules du système immunitaires; - d’organes sur puce qui permettent de créer des modèles miniatures d’organes ou tissus humains; - de modèles bio-informatiques et de simulation; - de biobanques de tissus humains; - des organoïdes, version miniature et simplifiée d'un organe fabriqué in vitro et qui présente une anatomie et une fonction proches de la physiologie. La fonctionnalité du vecteur de transfert prévu pour cette étude est ainsi validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont. Cependant, aucun de ces outils ne pourra générer l’ensemble des données attendues sur la réponse inflammatoire induite par l’injection d’un vecteur viral dans un modèle d’organisme physiologique entier. La réponse inflammatoire étant la somme d’une cascade de réponses physiologiques, elle est impossible à évaluer de façon exhaustive sans le modèle animal et doit donc s’étudier in vivo.

Réduction

La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe (sauf pour le groupe controle où un effectif de 4 souris sera suffisant), cet effectif constituant un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux, en comparant les animaux ayant eu un vecteur non-intégratif, un vecteur intégratif ou le véhicule. Des études similaires antérieures ont notamment permis de réduire le nombre d’animaux tout en garantissant des données interprétables et statistiquement utilisables. Le nombre de contrôles peut ainsi être limité à 4 souris. Par ailleurs, 4 femelles et 4 males permettront d’évaluer la réponse inflammatoire potentielle après injection des vecteurs lentiviraux. Nous ne nous attendons notamment pas à un dimorphisme sexuel dans cette réponse.

Raffinement

Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors des prélèvements sanguins, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray d'un antiseptique seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans ce type d’étude pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 14 semaines, - MODIFICATION: entre 9 et 14 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.

Jusqu'à 72 heures de perfusion continue par cathéter vasculaire, neuf prélèvements sanguins et deux heures d'anesthésie chirurgicale pour poser le dispositif : 706 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par une pyélonéphrite ou une péritonite, provoquée par administration ou par chirurgie, avec perte de poids attendue, prostration possible et isolement jusqu'à 72 heures. Tous sont tués pour compter les bactéries dans leur rein ou leur rate, le projet servant à caler des schémas posologiques de combinaisons d'antibiotiques avant l'essai clinique. Le porteur a retenu une lignée non consanguine parce que sa variabilité génétique reflète mieux, selon lui, la diversité des réponses humaines aux antibiotiques.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des résistances apparaissent. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des posologies sont donc nécessaires afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. Ce projet consiste à évaluer de nouvelles posologies chez des rats infectés soit par une pyélonéphrite, soit par une peritonite après perfusion continue de combinaisons d'antibiotiques permettant de reproduire des concentrations humaines chez l'animal.

Bénéfices attendus

Cette étude in vivo permettra d’évaluer de nouveaux schémas posologiques de ces combinaisons d’antibiotiques qui serviront de base solide pour décider quelles associations et quels schémas posologiques méritent d’être testés en essais cliniques chez l’humain. Cela représente une étape indispensable pour réduire les risques et optimiser la sécurité des patients lors des phases suivantes. À long terme, ce projet pourrait jouer un rôle clé dans la lutte contre les infections graves causées par des bactéries multi-résistantes. En proposant des stratégies thérapeutiques innovantes et validées, nous pourrons améliorer durablement la prise en charge clinique des patients, réduire la morbidité et la mortalité liées à ces infections, et répondre ainsi à un enjeu majeur de santé publique mondiale.

Procédures

Tous les animaux auront une anesthésie. Pour une partie des animaux, l'anesthésie durera 15 minutes pendant lesquelles l'infection sera provoquée par administration. Pour une autre, l'anesthésie durera 30 minutes au cours desquelles l'infection sera provoquée lors d'une chirurgie. Pour le reste des animaux, l'anesthésie durera environ 2 heures au cours desquelles l'infection sera provoquée et des cathéthers vasculaires seront placés lors d'une chirurgie. Les cathéters permettront la perfusion d'antibiotique et les prélèvements sanguins répétés. Sur ces animaux un tiers aura une perfusion de 24 heures au cours desquelles 3 prélèvements sanguins seront faits. Un tiers aura une perfusion de 48 heures au cours de laquelle 6 prélèvements sanguins seront faits. Un tiers aura une perfusion de 72 heures au cours de laquelle 9 prélèvements de sang seront faits.

Impact sur les animaux

Chirurgie : inconfort transitoire au réveil - une perte de poids attendue due à l'infection. Une prostration ou une perte de mobilité à 24 heures post-infection peut survenir. Isolement de l'animal pendant 72 heures maximum, Implantation de cathéters à demeure : gêne légère pendant la durée de la perfusion intraveineuse et pendant les prélèvements.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et détermination de la concentration bactérienne dans le rein ou la rate.

Remplacement

Dans ce projet, nous commencerons par tester différentes combinaisons de traitements in vitro afin de sélectionner celles qui sont les plus efficaces, comparées aux traitements classiques utilisés seuls ou en association. Cependant, avant d’envisager leur utilisation chez l’humain, il est essentiel de valider ces nouvelles approches chez des animaux infectés, pour vérifier qu’elles fonctionnent bien dans un organisme vivant. À notre connaissance, aucun autre modèle in vitro ou sur ordinateur ne permet aujourd’hui de mener ce type d’étude, qui apporte des informations sur les variations individuelles dans la manière dont les médicaments agissent et sont éliminés.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pouvoir observer une différence claire dans la quantité de bactéries entre les groupes traités et non traités.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 10 jours. Les procédures d'infection et les technqiues chirurgicales seront réalisées sous des conditions aseptiques et thermorégulées sous anesthésie générale et sous converture antalgique. Des points limites gradés et bien identifiés ont été établies afin d'obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations, ce qui permettra d'agir sans délai. Le système de perfusion utilisé au cours de cette procédure est un système commercial, validé, sécurisé et robuste, il permet une perfusion continue et de réaliser des prélèvements sanguins sans toucher l'animal ce qui réduit le stress.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé pour l'étude des médicaments. Nous avons choisi une lignée non consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique dans les concentrations d'antibiotiques et la réponse aux antibiotiques observée dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable de des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

Pour vérifier qu'une bactérie intestinale, Bacteroides fragilis, affaiblit la réponse immunitaire contre le cancer, puis l'éliminer par des virus qui l'infectent, 2 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever peau, tube digestif, foie et organes immunitaires. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses ou immunitaires dans la veine de la queue sur animal éveillé, une irradiation détruisant leur système immunitaire, puis jusqu'à cinq gavages de bactéries ou de bactériophages sur 28 jours. Aucun analgésique n'est prévu, le porteur indiquant avoir fixé des critères assez précoces pour tuer l'animal avant que la douleur ne justifie un traitement.

Objectifs

Ce projet repose sur des données publiées ayant montré que la composition du microbiote digestif des patients ayant reçu une greffe de moelle pour le traitement d’un cancer du sang était associée à une augmentation du risque de rechute chez les patients dont le tube digestif était colonisé par une bactérie commensale, c’est-à-dire naturellement présente dans notre organisme, appelée Bacteroides Fragilis. Les objectifs de ce projet sont : (1) de confirmer que cette bactérie diminue la réponse immunitaire anti cancéreuse dans des modèles de souris porteuses de tumeur ou ayant reçu une greffe de moelle pour le traitement d’un cancer du sang, (2) et de montrer qu’il est possible d’utiliser un traitement sûr et spécifique pour éliminer la bactérie du microbiote digestif en administrant par voie orale un cocktail de virus, les bactériophages, qui infectent uniquement les bactéries mais qui sont sans effet sur les mammifères. Actuellement, ce type d’approche est déjà utilisé chez l’humain pour le traitement d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques, en utilisant des bactériophages capables de détruire les bactéries pathogènes, provoquant des maladies pour l’humain, et leur sécurité a déjà été établie.

Bénéfices attendus

Ce projet démontrera le lien entre certaines bactéries intestinales et la diminution de l’immunité anticancéreuse, ainsi que la preuve de concept qu’une thérapie par les bactériophages peut restaurer cette immunité et réduire les rechutes après une greffe de moelle osseuse ou traitement anticancéreux. En montrant pour la première fois que des bactériophages permettent de moduler très spécifiquement le microbiote pour renforcer la réponse antitumorale, il fournira le rationnel nécessaire au lancement d’essais cliniques chez l’humain. Cette approche répond à un besoin non couvert, les antibiotiques ou autres traitements anti-infectieux n’agissant pas à l’échelle d’une seule espèce microbienne et pouvant altérer l’immunité. Le bénéfice direct sera la mise en place des premiers essais cliniques utilisant des bactériophages ciblés pour réduire le risque de rechute après la greffe de cellules, conformément au brevet européen déposé sur cette indication.

Procédures

Le projet consiste à déterminer s’il existe des mécanismes d’interactions entre certaines espèces de bactéries commensales et la réponse immunitaire anti-tumorale afin de cibler et diminuer les risques de rechutes dans les cancers du sang. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules (cancéreuses ou immunitaires) par voie intraveineuse (veine de la queue, durée d’environ 2 min comprenant la contention sur souris éveillée). Pour l’un des modèles, une injection sous cutanée (zone dorsale, durée moins d’une minute sur souris éveillée) de cellules cancéreuses sera réalisée. En amont des injections par voie intraveineuse, et en fonction du modèle expérimental, les souris subiront une irradiation permettant l’élimination du système immunitaire et donc cela permettra la prise de greffe des cellules à l’origine de toutes les cellules du sang (hématopoïétique). Une fois les modèles expérimentaux de cancer établis, les souris recevront par gavage oral sans anesthésie des solutions de bactéries commensales et/ou de virus dirigé contre ces bactéries (de un à cinq fois maximum sur 28 jours selon la procédure d’une durée d’environ 3min). De plus les fèces de ces souris seront récupérés afin d’étudier les micro-organismes présents. L’ensemble des procédures aura une durée d’environ 28 jours, à la suite desquelles les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Trois procédures sont susceptibles d’être associées à des effets indésirables chez la souris : - l’injection de tumeur, par voie intraveineuse ou sous cutanée, en induisant une croissance tumorale, peut être source d’inconfort ou de douleur chez la souris. - l'apparition de la maladie de l'hôte contre le greffon peut entrainer une douleur chez la souris - enfin, la procédure de gavage utilisée pour la colonisation microbienne du tube digestif peut s’accompagner d’un stress temporaire pour l’animal. Dans de rares cas, une lésion du tube digestif pourrait être observée.

Devenir

Euthanasie des animaux pour permettre la récupération des différents organes associés au système immunitaire et les organes cibles de la maladie (peau, tube digestif et foie) et leur analyse en post-mortem

Remplacement

L’objectif du projet est de déterminer les mécanismes d’interactions entre certaines espèces de Bactéroïdes et la réponse immunitaire antitumorale afin de pouvoir les moduler et ainsi diminuer les risques de rechute. Les modèles cellules ne peuvent mimer l’ensemble des phénomènes mis en jeu dans un organisme vivant entier.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. Pendant les expérimentations, les animaux seront évalués tous les jours selon une grille d’évaluation comprenant différents aspects cliniques. Cette surveillance étroite permettra de détecter rapidement toute anomalie et de prendre les mesures nécessaires pour assurer le confort et la santé des animaux. Aucune utilisation d’analgésique n’est prévue car nous avons défini des critères suffisamment précoces qui conduiront à l'euthanasie de l'animal avant que la douleur ressentie ne nécessite une prise en charge avec un anti-douleur. Par ailleurs, dès qu’un affaiblissement d’une souris est observé, de la nourriture sera ajoutée dans la cage pour faciliter sa prise alimentaire. En cas de souffrance, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

L’espèce animal choisie dans ce projet est la souris. Ces dernières ont une génétique et une physiologie (organes, tissus) très comparables avec l’Homme, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Et, le comportement de ce mammifère est bien connu, de ce fait, l’évaluation du bien-être ainsi que de la douleur liée à l’expérimentation peuvent être effectuées aisément (perte et aspect du poils, posture, comportement et isolement) permettant une prise en charge adaptée et rapide. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux de 8 à 10 semaines au début de la procédure. Ce stade de développement correspond à des jeunes adultes chez l’humain.

3 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, une irradiation de dix minutes en état vigile, puis trois injections de médicament, avec pour nuisances attendues la perte d'appétit, la perte de poids et la prostration liées à la tumeur. L'objectif déclaré est d'augmenter l'efficacité de la radiothérapie en déclenchant le "cannibalisme cellulaire", un mécanisme déjà criblé in vitro sur tous les modèles tumoraux retenus. Le porteur affirme malgré ce criblage qu'il est "maintenant indispensable" de tester ces molécules sur l'animal, seul un organisme "vivant, entier" permettant selon lui d'étudier l'immunité antitumorale.

Objectifs

L'objectif du projet est de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie en favorisant le déclenchement de la destruction des cellules tumorales par des cellules immunitaire.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce projet nous permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la radiothérapie à un inducteur du cannibalisme cellulaire. Il nous permettra d’identifier les processus et acteurs impliqués dans la régression tumorale.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (durée 1 minute). Il auront ensuite une irradiation vigile, durée 10 minutes. Enfin, ils recevront 3 injections de médicament, sous anesthésie locale, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux après greffe de tumeur : perte d'appétit, perte de poids et prostration des animaux. Des nuisances transitoires légères sont attendues (stress et douleur), liées au rasage du flanc droit de la souris, et aux injections.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour caractériser et définir la réponse immunitaire associée à la régression tumorale induite par les traitements.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier l’immunité anti tumorale dans sa globalité avec toutes les interactions nécessaires (système immunitaire, voies hormonales, médiateurs physiologiques). Cet environnement est impossible à reproduire dans toute sa complexité et sa régulation in vitro ou ex vivo (un de nos objectifs étant de comprendre les mécanismes immunitaires mis en place contre les cellules entotiques). Etant donné que la détection du cannibalisme cellulaire et de la sénescence dans des cancers du sein semble prédire in vitro la réponse clinique des patients aux traitements neo-adjuvants (article actuellement soumis et en évaluation à Nature) il est maintenant indispensable de tester l'effet anti-tumoral de ces modulateurs in vivo sur des modèles murins .

Réduction

Tous les modèles des tumeurs solides qui seront utilisés dans ce projet sont déjà criblés et validés in vitro pour leur grand potentiel d’induire le cannibalisme cellulaire en réponse à la radiothérapie et en combinaison avec les molécules radio-sensibilisantes. Les nombres d'animaux par lots ont été déterminés par calcul de puissance. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés pour les comparaisons entre groupe témoin et les groupes traités (analyses des résultats).

Raffinement

Les animaux seront pesés une fois par semaine et examinés quotidiennement pour observer leur comportement.Les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. En cas de douleur, les animaux recevront un antalgique. En cas de perte d'appétit ou d'amaigrissement, les animaux auront un aliment adapté, appétent, plus riche et plus préhensile. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les lignées de souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs murines ou à partir de cellules humaines, et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Ces modèles font partie des modèles les plus utilisés dans la recherche en cancérologie Nous allons utiliser des animaux à maturité sexuelle. Age 8-12 semaines. Nous étudions le système immunitaire adulte. Nous savons que les animaux trop jeunes n’ont pas atteint une maturité immunologique; de plus les animaux trop vieux ont un système immunitaire moins performant.

Exposées à un son intense à 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, les souris convulsent immédiatement après chaque exposition, jusqu'à trois crises par jour. Opérées du crâne pendant deux à trois heures, certaines passent ensuite 31 jours en sessions d'imagerie tête fixée, une à deux heures par jour. 382 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour identifier les circuits cérébraux qui transforment une perception sonore en décharge épileptique. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant qu'après de telles interventions elles ne peuvent être ni réutilisées, ni placées, ni adoptées.

Objectifs

Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Procédures

Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.

Remplacement

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Réduction

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Raffinement

L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.

Choix des espèces

Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).