Cancers

1 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, jusqu'à vingt injections directement dans la tumeur, des prélèvements de sang derrière l'œil et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le projet teste des ARN thérapeutiques contre le cancer colorectal, dont l'activité a déjà été observée sur cellules en culture. Le porteur écrit que le recours à l'animal devient "indispensable" pour juger l'effet dans un "organisme entier", avant une utilisation espérée chez l'humain.

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / MODIFICATION - Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 5 A 20 FOIS PAR ANIMAL / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point. LES INJECTION REPETEES INTRATUMORALES POURRAIENT ENGENDRER UN SURCROIT DE STRESS ET D'INCONFORT POUR LES ANIMAUX.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales cultivées au laboratoire nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles animaux est indispensable mieux comprendre leur effet dans un organisme entier, nottament concernant la toxicité. Cette étape est primordiale puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme. Afin d'évaluer l'effet de nos traitements sur les tumeurs, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie et mise à mort systématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude biologique des tumeurs au laboratoire, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.

Rendues immunodéprimées pour accepter des cellules tumorales humaines, 75 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal subit une implantation de cellules cancéreuses de la prostate dans l'abdomen, puis un traitement de la zone opérée par une torche à plasma froid. L'objectif est d'évaluer si ce procédé réduit le risque de récidive après ablation d'une tumeur. Le porteur décrit ce modèle comme "incontournable" et a porté l'effectif de 45 à 75 animaux.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

Rendues immunodéficientes pour accepter la greffe de cellules humaines sans rejet, 216 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules de myélome ou d'amylose, puis des prises de sang deux fois par semaine pendant trente jours et jusqu'à huit administrations de composés, la croissance tumorale pouvant les rendre léthargiques et leur faire perdre du poids. Les molécules testées visent, à terme, un traitement chez l'humain, mais l'étape présente reste la caractérisation de leur effet sur des tumeurs greffées. Le porteur justifie le recours à l'animal par la nécessité d'un "organisme entier" pour analyser tous les organes cibles.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) et l’amylose (AM) sont des pathologies associées à des anomalies des plasmocytes, cellules du système immunitaire produisant les anticorps. L'introduction de nouvelles approches thérapeutiques de chimiothérapies basées,entre autres, sur le blocage de complexes cellulaires qui assurent l’élimination des déchets protéiques dans les cellules a considérablement amélioré la survie des patients atteints. Cependant, ces traitements induisent souvent des effets indésirables graves ou des résistances aux traitements et les patients traités rechutent systématiquement Ces pathologies restent donc incurables et entrainent dans la majorité des cas le décès des patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de vaincre la résistance aux chimiothérapies et de réduire leur toxicité. Il a été montré qu’une toxine bactérienne capable d’inhiber la synthèse et l’expression de certaines protéines secrétées ou exprimées à la surface des cellules induisait un stress cellulaire associé à la production accrue de déchets protéiques qui, s’il est maintenu, évolue vers un suicide cellulaire. Cette inhibition permet à cette toxine de potentialiser l’efficacité thérapeutique des traitements du MM et permet de réduire efficacement la croissance tumorale dans un modèle animal murin immunodéficient. Ces résultats ont permis de démontrer l’intérêt thérapeutique de ce type d’inhibiteur dans le MM, et éventuellement pour l’AM car il bloquerait la production de la protéine responsable de la pathologie de l’amylose. Cependant la synthèse de cette toxine n’est pas compatible avec le développement de médicaments et ne peut donc pas être utilisée comme telle en tant que molécule thérapeutique. Le but de notre de projet est donc de caractériser de petites molécules possédant les propriétés inhibitrices de la toxine bactérienne mais facilement synthétisable, peu toxique et facilement administrable. Ces molécules seront sélectionnées par des tests in vitro sur leur capacité inhibitrice de la synthèse de protéines et plus particulièrement de la chaine légère anormale des immunoglobulines responsable de la pathologie de l’amylose et de leur capacité à induire la mort cellulaire sélective de cellules cancéreuses du MM tout en ne présentant pas ou peu d’effets secondaires délétères.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, le projet devrait aboutir à l’identification de médicaments permettant de traiter l’amylose et le myélome multiple chez l’homme qui sont aujourd’hui, dans la plupart des cas, incurables. Le projet consiste au développement de molécules thérapeutiques contre ces pathologies et l’obtention de résultats positifs dans le cadre du traitement chez la souris selon les critères définis devraient permettre de valider la stratégie de l’approche thérapeutique basée sur l’inhibition de la sécrétion et l’expression de protéine. Les molécules donnant les résultats les plus prometteurs seront alors testées lors d’essais cliniques chez l’homme permettant d’aboutir à un développement de médicaments pour traiter ces maladies.

Procédures

Prises de sang (quelques secondes) 2 fois par semaine pendant 30 jours. Injection de cellules humaines, 30 secondes pour une injection, une injection de cellules par animal. Effet indésirables liés à la croissance/ au développement de la masse tumorale. Administration de composés par injection ;10 secondes par administration ; maximum 8 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées avec des lignées humaines de myélome multiple ou d’amylose en sous cutané ou par voie intraveineuse. L’injection des cellules pourra occasionner une douleur de courte durée au niveau du site d’injection. La croissance de ces cellules sera suivie et les souris dont la croissance aura atteint un point limite seront mises à mort. Ainsi la croissance de ces cellules dans les limites imposées dans le projet ne devrait pas générer de douleur particulière mais les souris pourraient subir une gêne dû à la croissance des cellules et devenir léthargiques et subir une perte de poids. La croissance des cellules pourrait être associée à des pathologies particulières, telles que celles observées chez l’homme et pourraient générer inconfort, stress et douleur. Les souris seront donc suivies périodiquement et si des symptômes révélateurs de souffrance, d’inconfort ou de stress étaient observés, les animaux seront mis à mort afin de réduire la souffrance en accord avec les points limites définis. Les traitements, quant à eux, ne devraient pas induire de souffrance particulière car ils auront été sélectionnés sur des critères d’absence de toxicité et d’effets secondaires. Mais la manipulation fréquente et périodique des souris pour l’administration des traitements et du suivi pourrait aussi générer un stress plus ou moins important en fonction de la voie d’administration choisie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous devrons prélever en fin de procédures certains organes vitaux pour analyse (effets des traitements sur la croissance tumorale et sur les pathologies étudiées).

Remplacement

Il s’agit ici de tester différentes molécules de synthèses possédant les propriétés inhibitrices de la sécrétion et de l’expression de protéine similaire à la toxine bactérienne. Toutes les questions pouvant être apportées par l’utilisation de lignées cellulaires sur cette inhibition seront réalisées in vitro pour les caractériser et définir leurs propriétés biologiques. Cependant, le projet a pour objectif d’utiliser finalement ces molécules dans le traitement de pathologies chez l’homme et viseront donc à caractériser les effets thérapeutiques de ces molécules sur la prévention et le développement de ces pathologies. Il doit être réalisé dans un modèle expérimental physiologique de ces pathologies et doit donc être analysée et validée sur un organisme entier permettant d’analyser tous les organes cibles.

Réduction

Le nombre d’animaux que nous estimons nécessaire repose sur la forte expérience de nos conceptions d’études de ce type et validée par des biostatisticiens. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux strictement nécessaire pour atteindre l’objectif fixé. Les expériences passées ont montré que le nombre d’animaux par groupe utilisé ici (6) est le minimum requis pour obtenir des résultats pertinents et statistiquement significatifs. Un nombre inférieur d’animaux pourrait conduire à une expérience non interprétable du fait d’un manque de puissance des données générées. La répétition de l’expérience pourrait être nécessaire pour la robustesse des données établies. Par ailleurs, nous utiliserons des techniques expérimentales nous permettant d’analyser sur un seul individu de multiple facteurs caractérisant la pathologie pour obtenir le maximum d’information pour chaque animal utilisé. Les groupes expérimentaux de souris seront mélangés dans les cages afin de minimiser au maximum les conséquences de l’effet cage sur les résultats, permettant ainsi d’utiliser moins d’animaux et de réduire le nombre de répétition des expériences. Si possible, les molécules seront testées au sein d’une même expériences afin d’utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs molécules et donc réduire le nombre de souris.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront maintenues dans un environnement protégé sans pathogène opportuniste sous armoires ventilées et hébergées en groupe, avec une litière appropriée, des matériaux de nidification, et une nourriture adaptée. La nourriture sera irradiée, l’eau de boisson autoclavée et le matériel en contact avec l’animal sera autoclavé ou décontaminé. La durée et les doses des traitements sont calculées pour ne pas induire d’effet indésirable, tout en atteignant les objectifs scientifiques. Pendant la durée de l’expérience, les animaux restent dans leur environnement habituel. La plupart des gestes opératoires susceptibles d’être douloureux ou nécessitant un temps de plus d’une minute générateurs de stress seront effectués sous anesthésie. Des observations régulières des animaux seront effectuées tout au long des expériences pour détecter les animaux qui seront en éventuellement souffrance. Dès que le point limite sera atteint, les animaux concernés seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris présente le meilleur compromis éthique entre modèle mammifère, résultats le plus proches de l’humain tout en utilisant un nombre suffisant pour l’obtention de résultats fiables. Les métabolismes sont bien caractérisés et largement comparables à ceux de l’homme. En conséquence, les connaissances acquises seront vraisemblablement transférables à l’homme. D’autre part, la disponibilité de souris immunodéficientes nous permet d’envisager la greffe de cellules humaines sans rejet de celles-ci par le système immunitaire nous permettant d’analyser l’effet du traitement seul. Nous étudions des pathologies de l’adulte, des individus adultes de 6 à 8 semaines seront donc utilisés. Pour les xénogreffes des animaux immunodéficients, cet âge est requis car au-delà de 8 semaines une irradiation est nécessaire avant implantation des xénogreffes.