Cancers

250 lamas vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des anticorps par immunisations suivies de prélèvements sanguins. Le porteur indique que la plupart sont gardés vivants et réutilisés d'une étude à l'autre, une minorité étant tuée pour prélever la quasi-totalité du sang. Les effets décrits se limitent au stress de la contention, des injections et des prélèvements, répartis sur environ vingt-cinq études par an pendant cinq ans. Il affirme qu'il n'existe "aucune méthode substitutive" et que cette production animale est "indispensable" à la recherche.

Objectifs

Les lamas sont aujourd'hui des animaux très utilisés dans la recherche basée sur les anticorps, les biotechnologies... En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, le plus faible coût de production, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de lamas. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic…

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements.

Devenir

Dans certains cas (très rares chez le lama), les animaux inclus pourront être mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité de volume sanguin circulant. Dans le cas où le prélèvement terminal de la quasi-totalité du volume sanguin circulant n'est pas nécessaire (très souvent le cas), les animaux inclus pourront être gardés en vie et maintenus sur le site avec leurs congénères. Ils pourront ensuite être réutilisés dans d'autres études après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser.

Remplacement

La production d'anticorps polyclonaux nécessite une immunisation de l'animal et donc son utlisation. Il n'existe aucune méthode substitutive pour cette production qui est indispensable à l'avancement de la recherche, de la médecine, du développement de test de diagnostic...

Réduction

Le nombre d'animaux est choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Le lama permet d'obtenir des quantités de sérum suffisantes à l'atteinte des objectifs du projet, sans porter atteinte au bien-être animal. Ainsi, 1 ou 2 lamas seront immunisés par étude permettant ainsi d'obtenir une quantité suffisante de sérum. Le nombre de 2 lamas pour une étude sera choisi dans le cas de certaines études où il y a besoin de prendre en compte le facteur diversité/variation génétique qu'il peut y avoir entre 2 animaux. Un nombre de 25 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 250 lamas sur 5 ans. Sur ces 250 lamas, il y aura des possibilités de réutilisation de lamas d'une étude pour une autre étude, après validation du vétérinaire qui viendra examiner l'animal à réutiliser. Dès que le caractère naïf des lamas n'est pas demandé et n'est pas utile pour l'étude, des lamas issus d'études précédentes seront utilisés dans le respect de leur bien-être et si leur état de santé le permet. Ainsi, cela permettra de réduire le nombre de lamas différents utilisés.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : pâture extérieure, litière de paille, brosse à vache, objects à manipuler...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lama sera ici utilisé pour la production d’anticorps. En effet, les camélidés ont la particularité de disposer de 2 familles d’immunoglobulines G (anticorps) : les immunoglobulines G conventionnelles et les immunoglobulines G à domaine unique. Ces dernières sont composées uniquement de chaînes lourdes et présentent de multiples avantages par rapport aux anticorps conventionnels : architecture plus simple ; poids moléculaire inférieur ; petitesse qui permet de pénétrer les tissus plus rapidement et d'atteindre des cibles inaccessibles pour les anticorps conventionnels ; capacité d'atteindre plusieurs cibles simultanément ; meilleure stabilité. Ainsi, grâce à la simplicité de leur manipulation et fabrication, leur petite taille, leur grande affinité, leur spécificité aux antigènes et leurs propriétés thermostables, ces immunoglobulines sont largement utilisées en immunochimie notamment et sont des candidates idéales pour des applications thérapeutiques et diagnostiques. Ces nanoanticorps représentent une innovation majeure dans la sphère des biotechnologies. Les animaux sélectionnés seront de jeunes adultes (entre environ 9 mois et environ 6 ans) car c'est à ce stade qu'ils sont entièrement immunocompétents.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée sous la peau puis prélevée de façon répétée par biopsies sous anesthésie, jusqu'à un volume tumoral de 2 000 mm3 déclenchant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans d'autres études. Il reconnaît des risques d'hémorragie, de nécrose et de dissémination tumorale liés aux biopsies.

Objectifs

L’Organisation Mondiale de la Santé a établi en 2020 que le cancer était, selon les pays et leur développement socio-économique, la 1e ou la 2e cause de mortalité avant l’âge de 70 ans, avec 10 millions de décès par an dans le monde. En France, les cancers représentent la première cause de décès chez l’homme et la deuxième chez la femme. En 2040, il est estimé que 28.4 millions de cancers seront nouvellement diagnostiqués chaque année dans le monde, soit une augmentation de 47% par rapport à 2020 (19.3 millions de nouveaux cas). Cette augmentation est principalement liée au vieillissement des populations, mais aussi à d’autres facteurs de risque (tabagisme, habitudes alimentaires, expositions aux UV, sédentarité, pollution…). Actuellement les traitements conventionnels du cancer sont la chimiothérapie et la radiothérapie qui sont associés à des effets secondaires importants et pour lesquels les patients peuvent développer des résistances. Il est donc important de pouvoir développer de nouveaux traitements ciblant spécifiquement les cellules tumorales et limitant les effets secondaires associés. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, l’efficacité anti-tumorale des composés, issus de pré-sélections grâce à des tests in vitro, est évaluée in vivo chez des souris greffées avec des cellules tumorales. Les mécanismes d’action, pharmacocinétique ou biomarqueurs, sont évalués au cours de ces études à partir de prélèvements des tumeurs. Une des limites majeures actuelles à ces prélèvements de tumeur pour caractériser les effets des traitements est qu’ils ne peuvent être effectués qu’en procédure terminale pour l’animal. Pour pallier cela, il est souvent prévu d’inclure plusieurs cohortes d’animaux qui sont alors euthanasiées à différents temps de l’étude afin d’accéder à des analyses longitudinales d’efficacité du traitement. Ces études n’étant pas menées sur les mêmes animaux, elles peuvent être biaisées par des variabilités interindividuelles et rendre difficile l’interprétation ou imposer une augmentation du nombre d’animaux par groupe pour compenser ces variabilités. Ce projet a pour but de développer une technique de biopsie longitudinale de tumeur greffée chez la souris. Ce prélèvement régulier d’un très petit échantillon de tumeur permettra de caractériser au cours du temps et sur un même animal l’évolution de la tumeur par l’étude de paramètres histologiques, pharmacocinétiques, géniques et/ou protéiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de définir la technique la plus appropriée pour réaliser des prélèvements répétés de tumeur tout en ayant un impact minimal sur la morphologie et la croissance de la tumeur, l’évolution de la pathologie et le bien-être animal. La mise en place de biopsies longitudinales dans les études d’efficacité de traitements anti-tumoraux présente de nombreux intérêts : -Etant donné que le prélèvement est réalisé sur le même animal, nous pourrons ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études futures pour faire les analyses de biomarqueurs dans la tumeur. En effet, il ne sera plus nécessaire d’ajouter des cohortes d’animaux supplémentaires pour réaliser des prélèvements terminaux au cours du temps. -Chaque souris étant son propre contrôle, nous pouvons mieux caractériser le mécanisme d’action d’un traitement et ainsi mieux en définir l’efficacité puisque nous réduisons la variabilité interindividuelle associée aux prélèvements terminaux. -L’évolution de biomarqueurs spécifiques en réponse à un traitement peut être plus précisément définie puisque suivie sur le même animal. Ainsi les bénéfices associés à ces mises au point sont à la fois de réduction du nombre de souris utilisées et à la fois scientifiques (caractérisation des mécanismes d’action, diminution de la variabilité, suivi de biomarqueurs plus spécifiques)

Procédures

-Greffe de cellules tumorales : pour chaque animal, une injection unique sous la peau du flanc sur animal vigile. Ce geste est réalisé sans anesthésie car une contention maitrisée et un geste rapide (

Impact sur les animaux

Au cours de cette mise au point, nous serons vigilants sur les effets indésirables suivants qui peuvent survenir chez la souris : -Une perte de poids qui pourrait excéder 20% du poids initial. Le poids des animaux sera donc mesuré tout au long de l’étude (y compris avant et après biopsie) afin d’évaluer, entre autres, le rétablissement des animaux. Une biopsie ne pourra être envisagée que si la souris a récupéré son poids d’avant la biopsie précédente. Si une perte de poids d’au moins 20% du poids initial est observée, les animaux seront euthanasiés. -Il se peut que nous voyions apparaitre des nécroses soit au niveau de la tumeur, soit au niveau des points de prélèvements. Une surveillance particulière sera apportée, et les animaux présentant des tumeurs creusées, exsudatives ou des lésions/nécroses >8mm de diamètre seront euthanasiés. -Lors de la biopsie de la tumeur, l’incision faite dans la tumeur (par l’aiguille ou par le prélèvement chirurgical) pourrait entraîner une libération des cellules tumorales et provoquer une dissémination de la tumeur, entrainant la formation potentielle de métastases. Une palpation autour de la tumeur et de l'abdomen sera réalisée pour détecter l’apparition de ces métastases. La présence de métastase sera confirmée après euthanasie de la souris par une autopsie. -Enfin, un risque inhérent à toute biopsie est le risque d’induire une hémorragie. Les tumeurs étant vascularisées, il est possible d’endommager un vaisseau lors du prélèvement à l’aiguille. Aussi une vigilance particulière sera apportée au cours de l’étude et une surveillance accrue sera exercée au cours du prélèvement et pendant quelques heures suivant la biopsie.

Devenir

Lorsque la tumeur atteint un volume de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tumeur (que ce soit pour le groupe ayant eu des biopsies ou le groupe sans biopsie).

Remplacement

L’effet de traitements anti-cancéreux ciblant le système immunitaire ou spécifiquement les cellules cancéreuses ne peut être évalué qu’après un traitement aigu ou chronique de plusieurs semaines (selon le candidat médicament à tester) chez l’animal car il résulte de l’intégration de toutes les interactions métaboliques, hormonales, immunitaires et vasculaires impliquées dans le développement des cancers et de la pathologie. Une telle intégration n’existe pas pour des cellules ou organes isolés. Il n’y a donc pas à ce jour de méthodes in vitro substitutives.

Réduction

Ce projet a pour but de définir les conditions optimales de biopsie de tumeurs greffées en sous-cutanée. Il contribue ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés dans les futures études d’efficacité de traitement et de pharmacodynamie en permettant de réaliser des prélèvements répétés de tumeur sur le même animal. Ainsi la variabilité interindividuelle est réduite et la caractérisation des effets du candidat médicament est améliorée. Ces études seront réalisées sur des modèles déjà optimisés en termes de conditions de greffe. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est ainsi réduit. Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour définir les conditions optimales de biopsie et estimer la variabilité des paramètres mesurés. Cette étape permettra in fine d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les études d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. Les prélèvements répétés de tumeurs permettront d’évaluer des paramètres morphologiques (par des techniques d’histologie), des paramètres protéiques (par Western Blot ou par les techniques d’immunohistochimie), des paramètres géniques ou biochimiques.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale par pied à coulisse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Elle permet une mesure rapide et régulière au cours du temps chez la souris vigile. Les tumeurs sont mesurées plusieurs fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour surveiller l’atteinte éventuelle de points limites. En cas de volume tumoral supérieur à 1500 mm3, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel pour leur permettre d’exprimer leur instinct de nidification (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est dispersé dans la cage pour favoriser le fouissage. Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et du comité d’éthique, et les points limites, seront appliquées. Quelle que soit la méthode utilisée (prélèvement transcutané ou chirurgie), la procédure de biopsie est réalisée sur animal anesthésié et s’accompagne toujours au préalable de l’administration d’un analgésique afin de prévenir la douleur. A l’issue de la biopsie, l’animal est placé dans une enceinte chauffée pendant la phase de réveil, et surveillé pour s’assurer qu’il ne présente pas de signe de douleur. Nous nous assurerons du rétablissement de l’animal après chaque biopsie et tout au long de l’étude.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. Et la recherche en oncologie est réalisée dans sa grande majorité sur des modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire ou une injection de cellules tumorales dans la veine caudale, une chimiothérapie et jusqu'à six cycles de thérapies dites innovantes, avant une exsanguination terminale par ponction intracardiaque, pour étudier la réponse immunitaire au cancer du sein après traitement. Le porteur décrit une tumeur à croissance rapide pouvant provoquer nécrose, ulcérations cutanées et hémorragies douloureuses. Il juge une étape in vivo "nécessaire" pour se rapprocher de la clinique humaine.

Objectifs

L’objectif du projet est d'évaluer l'impact de la chimiothérapie conventionnelle sur la réponse antitumorale, particulièrement la réponse du système immunitaire sur des tumeurs mammaires murines implantées chez des souris, au niveau du site primaire et des métastases, afin de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la réponse du carcinome mammaire et de son environnement immunitaire après chimiothérapie dans un modèle syngénique murin immunocompétent comparé un modèle immunodéficient afin de définir : 1. L’efficacité de la chimiothérapie sur la tumeur initiale et le développement autonome des métastases incluant la caractérisation du programme de mort déclenchée dans les cellules tumorales sensibles et notamment la voie cGAS/STING 2. le remaniement du microenvironnement tumoral qu’il induit, particulièrement au niveau immunitaire (immunité innée et adaptative) locale (tumeur primaire) et systémique (métastases, ganglion de drainage, sang) 3. la nature des clones tumoraux qui résisteront au traitement 4. la réponse immunosuppressive locale qui a permis l’établissement des métastases 5. les stratégies thérapeutiques ciblant les acteurs de mort cellulaire et de réponse anti-tumorale immunitaire pouvant amplifier les effets de la chimiothérapie en diminuant les cellules lui échappant

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de participer au rétablissement d’une réponse immunitaire antitumorale locale et/ou systémique efficace grâce à la caractérisation et au ciblage des voies de signalisation participant à l’échappement tumoral entre la tumeur et son microenvironnement immunitaire. L’évasion immunitaire dont bénéficie la tumeur repose sur des processus intrinsèques à la tumeur ou sur sa capacité à corrompre l’environnement tissulaire dans lequel elle évolue et l’effet cytotoxique direct d’une chimiothérapie efficace modifie l’équilibre initial. A court et moyen terme, il va donc être important de déterminer le type de mort que les cellules tumorales vont déclencher sous l’effet de la chimiothérapie, et la nature des signaux d’alarme libérés dans l’espace tumoral ainsi que leur cinétique de sécrétion. Ces signaux de nature variée (incluant métabolites, cytokines, acides nucléiques, vésicules, organites...) influent sur les autres cellules tumorales ou immunitaires au niveau local ou systémique, contribuant à l’adaptation de la tumeur, du système immunitaire et finalement à la récidive de la maladie. Ceci va permettre de générer des données biologiques intégrant le caractère inflammatoire et/ou immunomodulateur de la mort cellulaire induite par le traitement anticancéreux au niveau de la tumeur primitive (ou sa maladie résiduelle quand une exérèse a été pratiquée) ou des métastases associées. A moyen et long terme, ceci permettra d’identifier les processus cytotoxiques qui seront capables de favoriser une réaction immunitaire antitumorale locale et systémique, en l’associant éventuellement avec les approches d’immunothérapie actuellement en cours de développement.

Procédures

Chaque animal de l’étude recevra : • une allogreffe tumorale au niveau 4e coussinet mammaire après incision cutanée et sous anesthésie générale (durée : 20 minutes) avec exérèse tumorale chirurgicale sous anesthésie générale 1é jours plus tard (durée : 20 minutes) o u une injection intraveineuse de cellules tumorale dans la veine caudale sans allogreffe associée (durée : 5 minutes) • 3 injections de chimiothérapie par voie intra-péritonéale sur animal vigile (durée : 2 minutes) • Administration d’une ou de plusieurs thérapies innovantes (jusqu’à 6 cycles par animal) par voie intra-péritonéale ou per os/gavage sur animal vigile ou sous anesthésie générale (durée : 2-5 minutes) • 5 séances de bioluminescence après anesthésie générale et injection intra-péritonéale de Luciférine (durée : 30 minutes) • Une exsanguination terminale par ponction intra-cardiaque sous anesthésie générale injectable juste avant la mise à mort (durée : 15 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle 4T1 est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et une extension métastatique précoce notamment au niveau du poumon dans les premiers stades puis au niveau de divers organes ensuite (foie, os, rate, cerveau). La croissance de la tumeur et des ses métastases peut provoquer des effets indésirables sur les animaux recevant cette lignée. Tout d’abord au niveau local d’implantion de la tumeur primaire (dans le coussinet mammaire de la 4e mamelle), l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. Ces nuisances au niveau du site local seront réduites par l’exérèse précoce (J12) de la tumeur et seront absentes dans le modèle métastatique par injection de cellules tumorales dans veine cave caudale. Au niveau des différents sites métastatiques, on peut observer des difficultés fonctionnelles de(s) différent(s) appareil(s). Notamment au niveau du poumon, une dyspnée peut être observée, due à la présence mécanique des métastases et/ou à la présence d’un hydrothorax ainsi qu’au niveau de la moelle osseuse avec des fractures spontanées par présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit ainsi qu’une hypothermie persistente. Des observations et examens cliniques seront réalisés très régulièrement afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques atteignant des points limites pour leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée.

Devenir

Dans le cas d’une allogreffe tumorale (Procédure 1), la tumeur sera analysée par une séance de Bioluminescence puis sera traitée par une séance de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant- avant l’exérèse de sa tumeur. Dans le cas d’une injection intraveineuse de cellules tumorales (Procédure 2), l’animal subira seulement une injection dans la veine caudale des cellules 4T1 sans chimiothérapie néo-adjuvante ni exérèse tumorale. Ensuite, dans tous les cas (Procédures 1 et 2), les animaux recevront 4 séances d’analyse par bioluminescence et 3 séances de chimiothérapie -avec ou sans traitement innovant-. A la suite de la dernière séance d’analyse par bioluminescence, l’animal sera laissé endormi pour une exsanguination précédent la mise à mort.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes d’échappement tumoral au système immunitaire, notamment dans la niche métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire riche en divers éléments micro-environnementaux comme notamment les acteurs locaux de l’immunité innée et acquise. Une étape in vivo est donc nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales et immunitaires dans la niche tumorale. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, la lignée 4T1-Luc2 sera étudiée in vitro dans sa réponse aux traitements et dans les caractéristiques de résistance à ce dernier. Les prélèvements obtenus par l’expérience in vivo seront analysés ex vivo afin d’en tirer des acteurs moléculaires pertinents qui seront validés, in vitro, sur cultures cellulaires ou organoïdes, puis ciblés par des molécules afin de retourner au modèle in vivo murin dans un dernier temps.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection et d’exérèse du modèle 4T1, issus de la bibliographie, sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non homogénéité entre lots de souris. L’expression par la lignée 4T1 de la luciférase facilite une quantification précise de la croissance tumorale et de l’extension métastatique, réduisant donc le nombre d’animaux pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. Elle permet aussi un suivi cinétique non invasif des masses et donc sans sacrifice à différents temps de lots d’animaux. Le personnel collaborera avec d’autres équipes, notamment dans le partage des animaux (les animaux disponibles devenus trop âgés pour la greffe ou de sexe masculin) et dans le partage des données notamment par la mise en commun des données et des expertises analytiques.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’hébergement possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (3-4 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possibles. Différents lieux accueilleront les animaux pour un distanciation maximale entre les lieux d’hébergement, de soins et de sacrifice. Enfin, la douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours (et tous les jours en fin d’expérimentation) afin de déterminer le plus précocément possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’analgésie (c.f. Annexe 5).

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - modèle 4T1 de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie pour les souris immunocompétentes Balb/c - concordance du modèle 4T1 murin avec les observations cliniques chez les patientes femmes atteints d'un carcinome mammaire et sur son évolution métastatique - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - l'organisme murin évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine -certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans l’échappement au traitement des cellules tumorales). Les animaux utilisés ont un âge qui varie entre 6-8 semaines à leur inclusion dans le protocole. En effet, la prise tumorale est dépendante de l'imprégnation hormonale : plus elle est précoce et prolongée, plus le taux de prise de greffe est important. Dans le cas des modèles 4T1, elle est estimée à proche de 100% dans ses conditions chez les souris immunocompétentes d'après la bibliographie existante. De plus, le temps de latence estimé avant prise tumorale est de 2-3 semaines et les métastases sont détectables à partir de 4-5 semaines : les souris auront atteint l'âge adulte, un âge où elles pourront supporter le développement de la tumeur.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la glande mammaire, par chirurgie sous anesthésie, puis des injections dans la tumeur, avec une croissance tumorale pouvant durer jusqu'à 75 jours, pour tester une thérapie reprogrammant les cellules cancéreuses. Le porteur décrit une possible perte de poids, une gêne au déplacement et une inflammation cutanée de la tumeur. Les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou pour analyse, les bénéfices pour les patients restant annoncés à moyen terme.

Objectifs

Ce projet vise à étudier l'efficacité antitumorale d'une thérapie innovante, combinée à des anticorps thérapeutiques, chez la souris. La thérapie d'intérêt reprogramme les cellules tumorales afin de les transformer en cellules immunitaires qui vont ainsi réveiller et armer le système immunitaire afin qu'il détruise les cellules tumorales non reprogrammées. Le projet proposé comportera 3 procédures qui serviront à tester l'efficacité antitumorale de la thérapie de reprogrammation en combinaison avec des anticorps thérapeutiques, sur des modèles tumoraux représentatifs d'indication oncologiques avec de forts besoins d'innovation thérapeutique. L’efficacité antitumorale sera étudiée sur le cancer colorectal, le mélanome, le fibrosarcome, le cancer de la vessie, cancer du sein. Les modèles tumoraux de cancer du sein seront implantés dans la glande mammaire des souris, les autres modèles seront implantés en sous-cutané au niveau du flanc des souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’homme.

Procédures

- Injection sous cutanée et orthotopique mammaire de cellules tumorales : quelques minutes -implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum - croissance de tumeurs sous cutanée sur le flanc, durée maximale 75 jours, durée moyenne 3 semaines -injection intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques, pour un maximum de 4 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes - injection intratumorale de composés thérapeutiques à une dose tolérée pour un maximum de 2 injections espacées de 7 jours ; quelques minutes

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqure et l'injection; durée quelques secondes -Suite d’une chirurgie sous-cutanée sous anesthésie et anti-douleurs : douleur au réveil 20 minutes maximum ; gène cutanée à la cicatrisation 48h maximum -croissance d’une tumeur sur le flanc ou dans la glande mammaire : gène cutanée, gène au déplacement ; durée maximum 50 et 75 jours respectivement. -injections intrapéritonéales ou intratumorales : douleur de la piqure ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h

Devenir

Les animaux seront mis à mort soit pour prélèvement et analyse post mortem, soit parce qu'ils ont atteint un point limite tels que définis pour chaque procédure

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo dans le cadre du projet européen (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), l’impact et l’efficacité de la thérapie étudiée en combinaison avec des traitements immuno-stimulants approuvés ne peut être pleinement évaluées que dans un système complet.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie), à savoir 10 souris par groupe thérapeutique, pour un total 8 groupes. Ces 8 groupes thérapeutiques seront testés sur 12 modèles tumoraux représentatifs de cancers à fort besoin thérapeutique. Les tests statistiques utilisés seront un t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral, pour la comparaison des volumes tumoraux. Et un test de Mantel-Cox pour la courbe d’espérance de vie. Dans notre expérience, les effectifs de 10 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests cités des différences significatives supérieures à 25% de gain d’inhibition de croissance tumorale ou de 20% d’espérance de vie. Ces gains sont au minimum de l’intérêt thérapeutique. Tous les modèles tumoraux utilisés auront été préalablement testés in vitro pour leur bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, les tumeurs et les organes lymphoïdes (rate et ganglions) seront analysées post-mortem sur 5 souris indépendantes. Les paramètres étudiés seront les cellules immunitaires présentes dans ces organes, l’analyse statistique se fera par comparaison de moyennes (t test non paramétrique de Mann-Whitney, non apparié, bilatéral). Notre expérience de l’immunophénotypage a montré que ce test permet de mettre en évidence une différence biologiquement significative des populations immunitaires.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Pour les modèles implantés dans la glande mammaire, connus pour développer des inflammations cutanées superficielles au niveau de la tumeur, les animaux seront stabulés sur une litière en cellulose moins agressive que la litière en copeaux. Des prélèvements en point final (tumeurs et organes) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. Les modèles tumoraux prévus dans ce projet sont utilisés fréquemment sur des souris de cet âge, avec un taux de prise supérieur à 99%.

30 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatre semaines, pour tester des inhibiteurs d'EZH2 contre le carcinome à cellules de Merkel. Le porteur indique qu'aucune analgésie ne sera administrée afin de ne pas interférer avec les traitements, et qu'une perte de poids, une tumeur de plus d'un centimètre cube ou une ulcération déclenchent la mise à mort par élongation cervicale. Il affirme que le recours au modèle murin est "obligatoire" pour développer ces tumeurs.

Objectifs

Le carcinome a cellules de Merkel (CCM) est un cancer cutané rare et agressif survenant principalement chez le sujet âge de plus de 65 ans et le patient immunodéprimé (hémopathies, greffe d’organe, infection par le VIH). Son incidence, estimée à 1/100 000 par an, est en constante augmentation. La survie a 5 ans est estimée à 40%. Dans 80% des cas, le génome du Polyomavirus à cellules de Merkel (MCPyV) est intégré dans celui des cellules tumorales induisant alors l’expression de deux oncoprotéines virales (antigène grand T ; LT et antigène petit t ; st). Dans ce contexte, une étude récente menée au sein du laboratoire a permis de mettre en évidence l’induction de l’expression d’EZH2 (Enhancer of zest homolog 2), une histone méthyltransférase, par les oncoprotéines virales. Cette enzyme est impliquée dans l’agressivité et la prolifération tumorale d’autres cancers. De plus, une forte expression d’EZH2 a pu être confirmée au sein d’une cohorte de 96 patients présentant un CCM avec un niveau d’expression plus important dans les tumeurs MCPyV positives. L’effet des inhibiteurs d’EZH2 à déjà été démontré sur d’autre tumeurs solides. Dans ce contexte la cytotoxicité de deux de ces drogues a pu être démontrée au sein de notre laboratoire, in vitro sur des lignées cellulaires humaines de CCM. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo, l'effet inhibiteur sur la croissance tumorale du GSK343 et du DZNeP dans un modèle murin de xénogreffe, maîtrisé dans le laboratoire, utilisant la lignée WaGa.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de valider dans un modèle pré-clinique l'utilisation d'inhibiteur d'EZH2 dans l'indication du carcinome à cellules de Merkel. Ces molécules pourraient potentiellement être utilisées chez l'Homme en complément de l'immunothérapie ciblant PDL1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules WaGa afin d'établir le modèle tumoral. Suite à leur inclusion, elles recevront quotidiennement par voie intrapéritonéale les deux molécules évaluées ou le véhicule pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Chez l’Homme, le carcinome à cellules de Merkel est décrit comme non douloureux, néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux limites (aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1cm3 ou apparition d’ulcération), conduira à leur mise à mort par élongation cervicale.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs impose la mise à mort de l'ensemble des souris.

Remplacement

Afin d’étudier l’impact du traitement sur la croissance tumorale, le test sur modèle murin est obligatoire

Réduction

Une seule dose de chaque traitement sera testée sur la base des résultats de cytotoxicité in vitro préalablement obtenus au laboratoire ainsi que des données de la littérature réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. De plus, un test de Wilcoxon a permis de déterminer le nombre d'animaux nécéssaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement social (5 souris de même sexe / cage) dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immunodéficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement, ainsi que l’aliment et l’eau de boisson seront stérilisés. Après les injections intra-péritonéales, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque, catalogue PLEXX). Aucun traitement d'analgésique ne sera administré afin d'éviter toute interférence avec les traitements testés.

Choix des espèces

Le seul modèle disponible de CCM étant des lignées humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est obligatoire afin de permettre le développement de tumeurs chez la souris. Les NOD/SCID sont un modèle de référence pour les xénogreffes de cellules humaines . 7 semaines incluant la semaine d’acclimatation d'une semaine. Stade physiologique : croissance

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses puis un gel associé à une chimiothérapie, avec un suivi tumoral par bioluminescence sous anesthésie jusqu'à douze séances, avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme observer rarement l'atteinte d'un point limite et décrit une maladie bien supportée, tout en surveillant la perte de poids qui déclenche une mise à mort sous 24 heures. Sur le remplacement, il indique que les essais in vitro ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme vivant" et conclut à l'impossibilité de se passer de la souris.

Objectifs

La carcinose péritonéale est une situation médicale où le péritoine, qui est l’enveloppe qui entoure les organes de l’abdomen, se trouve recouvert de nodules de tumeur cancéreuse. Cette situation est un processus métastatique qui va conduire au décès du patient. La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés à un gel associé à une chimiothérapie de contact pouvant être appliqué en postopératoire, qui aurait la capacité d’inhiber l’adhésion des cellules cancéreuses disséminées suite à de la résection de la tumeur primitive ou suite à n’importe quelle chirurgie abdominale. L’objectif de cette recherche est d’évaluer l’apport thérapeutique, soit pour une carcinose déjà présente, soit pour éviter (prophylaxie) qu’une carcinose ne se développe, de ce gel thermosensible qui va se gélifier à température de l’animal (il est liquide a température ambiante) et laisser diffuser sur quelques jours la chimiothérapie qui a été incluse avec celui-ci.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale et également l'utilisation de ce gel en prévention, donc avant l'apparition de la carcinose péritonéale.

Procédures

Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes) qui sera associée deux heure après à une injection en intrapéritonéale également de gel associé à une chimiothérapie (1 fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l'évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l'expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Les souris vont développer une carcinose péritonéale après une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses murines ovarienne ou colique. Nous avons une bonne expérience de nos modèles. Il est très rare d’observer une souris qui atteint un point limite. Les souris supportent très bien la maladie et la fin de l’expérience arrive avant que la maladie ne se développe de trop. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les points limites observés sont souvent corrélés ensemble avec une perte de poids de l’animal. Si cela devait se produire, l’animal serait mis à mort dans les 24h. Aussi, nous devons confirmer si ce gel pourrait induire une toxicité. Aussi, les doses de chimiothérapie ne seront pas toxiques non plus; la chimiothérapie étant au contact du gel.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus sains pour être analysés par le service d’anatomopathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (gel) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles, en nombre de nodules ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 3 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Lors du suivi de la croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane à 1%) et avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie (Buprénorphine - 0,1mg/kg) et seront ensuite sous anesthésie générale (isoflurane à 3%). Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. De plus, le suivi par bioluminescence nous permet d’arrêter l’expérience avant que la progression tumorale soit trop importante. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.

90 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du foie humain sont greffées sous leur peau, puis elles reçoivent jusqu'à vingt injections d'anticorps sur dix semaines, avant d'être tuées pour prélever les tumeurs. Le porteur décrit des ulcérations cutanées possibles aux sites de greffe et d'injection, et un anticorps pouvant endommager des tissus sains. Il indique avoir mené des essais in vitro préalables mais conclut à la nécessité d'une validation sur "animal entier".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester différents anticorps dirigés contre une protéine localisée sur la membrane des cellules qui a été clairement montré comme participant au développement de différents cancers, notamment le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier au monde. Depuis une dizaine d’année nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette protéine membranaire. Nous avons montré que cet anticorps conduit à une inhibition partielle de la croissance tumorale de cellules cancéreuses humaines transplantées dans des souris très immunodéficientes. Nous avons ainsi montré que l’anticorps ralentit la croissance de la tumeur. Récemment, nous avons développé un panel de différents anticorps reconnaissant cette protéine membranaire. Ainsi, afin d’explorer et d’exploiter pleinement le potentiel thérapeutique de ces anticorps, nous souhaitons tester leur efficacité dans un modèle de souris immunodéficientes afin de déterminer lequel présente l’effet le plus prononcé sur la croissance tumorale. Cette étude nous permettra ainsi de déterminer quelle forme d’anticorps est la plus optimale pour un développement clinique ultérieur.

Bénéfices attendus

Ce projet doit nous permettre d’évaluer le potentiel thérapeutique de nos anticorps pour le traitement du cancer du foie afin de profiter aux patients atteints de ce type de cancer pour lequel les options thérapeutiques sont actuellement très limitées, voire inexistantes.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Une injection unique, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines, réalisée sous anesthésie générale gazeuse, temps nécessaire environ 5 minutes par animal anesthésie comprise. -Une injection bi-hebdomadaire d’anticorps sur animaux vigiles pendant maximum 10 semaines, soit un maximum de 20 injections. Temps nécessaire pour chaque injection environ 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont très limités. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules. De même, les injections répétées d’anticorps peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Un de nos anticorps peut de se fixer à la protéine membranaire de la souris, ce qui pourrait éventuellement induire des dommages au tissus sains exprimant normalement cette protéine et entrainer une dégradation de l’état général des animaux.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tumeurs qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, les tailles d’effectifs ont été déterminée à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont des modèles reconnus dans la communauté scientifique pour la greffe sous cutanée de lignées cancéreuses humaines afin de tester rapidement la pertinence d’une approche thérapeutique. La souche immunodéficiente choisie possède néanmoins certaines cellules capables d’améliorer l’effet thérapeutique des anticorps. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin que ces cellules en question soient matures. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.