Cancers

312 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent spontanément des polypes intestinaux pouvant évoluer en prolapsus rectal, et reçoivent des injections d'anticorps deux fois par semaine pendant six semaines, avant d'être tuées pour compter les tumeurs. Le porteur indique renoncer à toute analgésie au motif qu'elle "risquerait de modifier la réponse" au traitement et ne traiterait pas le prolapsus. Il décrit ce modèle comme "indispensable" car proche de la physiopathologie humaine.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche d’un traitement contre le cancer colorectal. Il existe aujourd’hui de nouvelles solutions thérapeutiques mais malheureusement dans le cas du cancer colorectal notamment, ces traitements ont des effets limités. Nous voudrions tester si une combinaison avec notre anticorps pourrait améliorer la réponse à ces nouveaux traitements. Nous utiliserons comme modèle une souris transgènique qui a la particularité de développer des tumeurs intestinales à un âge précoce, ce qui permet d’étudier l’effet du traitement sur un modèle proche de la physiopathologie humaine. L’objectif est donc de tester l’effet de notre anticorps en combinaison avec un autre anticorps sur le nombre et la taille des tumeurs qui se développent au niveau de l’intestin chez ces souris.

Bénéfices attendus

Nous attendons un effet synergique de la combinaison sur le développement des polypes et/ou la progression tumorale. Cela sera determiné par un comptage des polypes et/ou lésions tumorale après sacrifice des animaux. Ces résultats nous permettront d'avancer sur notre stratégie de combinaison de notre anticorps avec d'autres traitements afin d'améliorer les effets thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par injection péritonéale deux fois par semaine pendant 6 semaines.L’injection sera faite du côté droit de l’abdomen à l’aide de seringues 29G. La durée de l'injection est de 15 à 20 secondes par souris.

Impact sur les animaux

Le modèle APC∆14 induit le développement de polypes intestinaux pouvant induire des prolapsus rectaux chez les animaux à un stade tardif. Notre traitement anticorps n’a, quant à lui, pas d’effet indésirable attendu et le mode d’injection intra-péritonéale n’est pas connu pour induire des douleurs autres que légères.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin du traitement pour pouvoir prélever leurs intestins et procéder au comptage des polypes et/ou tumeurs qui se seront développés. Nous n’avons pas d’autre moyen que de les sacrifier pour répondre à l’objectif initial.

Remplacement

L’étude chez la souris APCΔ14 est indispensable car elle développe des polypes évoluant en tumeurs malignes intestinales de manière spontanée. Cela permet d’étudier l’effet du traitement dans un modèle physiologiquement plus relevant car immunocompétent et à un stade précoce du développement tumoral.

Réduction

Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles afin de réduire le plus possible le nombre d’animaux et d’utiliser au maximum les portées obtenues par les croisements. Le nombre d’animaux par groupe a été établi à 12. Ce nombre, qui a été défini de manière statistique, tient compte de la variabilité du modèle qui est minime et du fait que nos résultats préliminaires ont montré un effet du traitement seul.

Raffinement

L’angoisse des animaux sera réduite par l’apport d’un enrichissement sous forme de papier et coton qu’ils pourront utiliser pour se faire un nid, et par le fait qu’ils cohabiteront par groupe de 5. Le degré de souffrance est estimé comme léger car le traitement est sous forme d’injection intra-péritonéale et le traitement en lui-même n’a pour le moment jamais montré d’effet secondaire. L’analgésie ne peut être utilisée car elle risquerait de modifier la réponse à notre traitement, de plus elle ne permettrait pas de traiter le prolapsus qui est le risque majeur de ce modèle. En cas de signes de douleur, les souris seront euthanasiées par asphyxie au CO2

Choix des espèces

L’objectif est d’étudier l’effet de la combinaison de deux anticorps sur le développement tumoral. L’étude chez la souris APCΔ14 est indispensable car elle développe des polypes évoluant en tumeurs malignes intestinales de manière spontanée. Cela permet d’étudier l’effet du traitement dans un modèle physiologiquement plus relevant car immunocompétent et à un stade précoce du développement tumoral. Les animaux seront utilisés à deux stades. Le premier stade est à 5 semaines de vie lors de l’apparition des premiers polypes. Le deuxième stade est à 12 semaines de vie lorsque les polypes sont installés et commencent à se développer en tumeurs malignes. Ces deux stades sont importants pour étudier l’efficacité de notre combinaison sur l’initiation des polypes et/ou le développement tumoral.

482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du côlon humain sont greffées dans leur caecum par chirurgie, puis la tumeur est suivie chaque semaine par imagerie sous anesthésie jusqu'à trois mois, 266 souris recevant en plus douze injections d'inhibiteurs dans la queue. Le porteur décrit des atteintes digestives et un amaigrissement liés au développement tumoral, et vise à valider les canaux sodiques NaV comme cible thérapeutique. Il affirme que la complexité multicellulaire du cancer ne pouvant pas être étudiée in vitro, le recours aux souris est "indispensable".

Objectifs

Il a été montré l’expression aberrante des canaux sodiques dépendants du voltage NaV dans les cellules cancéreuses et leur implication dans la progression des cancers. Ces canaux sont anormalement exprimés dans les biopsies humaines de carcinomes, et dans des cellules cancéreuses non-excitables de différentes origines épithéliales. C’est le cas de NaV1.5 qui est anormalement exprimé dans le cancer du sein et dans le cancer sporadique du côlon, et dont le niveau d’expression semble associé à un mauvais pronostic chez les patients. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. Quant à NaVBeta4, son niveau d’expression est réduit dans les tissus cancéreux coliques en comparaison des tissus non-cancéreux appariés. L’inhibition de l’expression de NaVBeta4 dans les cellules cancéreuses coliques SW60 et HCT116 augmente l’invasivité cellulaire in vitro. L'hypothèse de notre client est que les canaux NaV1.5, qui peuvent être inhibés par des composés pharmacologiques existants ou en cours de développement, pourraient représenter des cibles pour des nouvelles thérapies anticancéreuses. Pour valider cette hypothèse, il est important d’utiliser un modèle orthotopique de cancer colique qui consistera à greffer au niveau du caecum de souris, des cellules cancéreuses coliques humaines (HCT-116 ou SW620) bioluminescentes. Les souris que nous utiliserons seront donc des souris immunodéficientes, à phénotype dommageable, qui seront hébergées en portoir ventilé dans des conditions n'entraînant pas l'expression du phénotype.

Bénéfices attendus

La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse. La présence de NaV1.5 à la membrane plasmique des cellules cancéreuses coliques a été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer sporadique, tandis qu’aucun marquage n’a pu être identifié au niveau du tissu colique non cancéreux. Son expression et sa fonctionnalité ont également été identifiées dans des lignées cellulaires de cancer du côlon, telles que SW620 et HCT116, et son activité stimule l’invasivité cancéreuse.

Procédures

482 souris auront des greffes de cellules tumorales au niveau du caecum (procédures 1, 2, 3, 4) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirurgie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 482 souris auront une imagerie de bioluminescence 1 fois par semaine à partir du 7ème jour post greffe sous anesthésie gazeuse Isoflurane 2% dans l’air avec injection vigile 4 minutes avant l’examen de 100µL de luciférine par voie intrapéritoléale pour le suivi de la prolifération tumorale. En parallèle une échographie sera réalisée 1 fois par semaine ou toutes les 2-3 semaines en fonction de la vitesse de prolifération des tumeurs. Ces 2 examens successifs ont chacun une durée inférieure à 10min et seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (2% dans l'air), sur support chauffé à 37°C. Par ailleurs, un monitoring cardio respiratoire est réalisé simultanément en cours d’échographie qui permet de s’assurer que l’animal supporte bien l’examen. Soit sur une durée de 3 mois (temps maximal de l’étude) chaque souris aura 11 séances d’imagerie de bioluminescence et 11 séances d’imagerie échographique au maximum. 266 souris vigiles (procédures 2, 3 et 4) recevront 3 fois/semaine pendant 4 semaines (= 12 injections par souris) 150-200μLd’inhibiteurs par voie intraveineuse au niveau de la queue.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus pour les animaux sont liés au développement d'une tumeur primaire au niveau du colon et éventuellement de métastases (problèmes digestifs, amaigrissement).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chque procédure.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres complexes, multicellulaires et multiorganes, ne pouvant pas être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, afin de développer de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, des études pharmacologiques sur animaux sont nécessaires. Les expérimentations pourront mettre en évidence un nouvel acteur du développement métastatique, les canaux NaV, qui pourraient servir de nouveau marqueur prédictif et éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer colique.

Réduction

La mise en oeuvre de l'imagerie permet un suivi longitudinal du même animal ce qui permet de réduire leur nombre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations.

Raffinement

Le suivi de la croissance tumorale primaire et secondaire (métastases) sera réalisé par imagerie de bioluminescence in vivo et d’échographie, approches non invasives et indolores pratiquées par ailleurs sur animal anesthésié. Des antalgiques seront utilisés lors de la chirurgie et 24h après. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé et en accord avec les directives européennes. des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel observera quotidiennement les animaux afin d'anticiper la souffrance animale.

Choix des espèces

Dans notre projet, les informations attendues ne peuvent pas être obtenues in vitro car à ce jour l'animal de laboratoire reste le seul recours permettant d'étudier le développement tumoral et l'efficacité thérapeutique en tenant compte de la complexité de la physiologie d'un organisme vivant. La souris est un animal chez qui il est possible d'obtenir le développement de tumeurs d'origine murine et humaine. La souris est ainsi une espèce animale classiquement utilisée, pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), de par la possibilité d’avoir accès à des animaux immunodéprimés permettant l’implantation de cellules cancéreuses humaines, ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo (bioluminescence, échographie). Modèle de cancer réalisable chez la jeune souris adulte (6 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, nous avons rencontré des difficultés pour implanter des cellules tumorales humaines avec un taux de prise de greffe moins important.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie locale, avec des prélèvements de sang, pour tester des molécules censées déclencher une mort des cellules cancéreuses reconnue par le système immunitaire. Le porteur décrit une croissance tumorale sous-cutanée dont il qualifie les nuisances de limitées. Il affirme que des tests in vitro existent mais n'évaluent pas la réponse immunitaire mémoire, juge l'animal vivant entier "indispensable", puis met à mort les souris pour prélever rate, ganglions et tumeur.

Objectifs

Le développement des tumeurs dépend fortement de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, particulièrement avec les cellules immunitaires présentes comme les lymphocytes cytotoxiques. Ces dernières reconnaissent spécifiquement la tumeur via la présentation d’antigènes, qui sont de petites protéines spécifiques à la tumeur. Après avoir été activatés, les lymphocytes cytotoxiques peuvent détecter et détruire la tumeur. Le profil antigénique de la tumeur est donc un point déterminant dans la réponse anti-cancéreuse. Cependant, la présentation antigénique n’est pas suffisante pour produire une réponse immunitaire efficace ; d’autres paramètres sont requis. Les lymphocytes cytoxiques sont activés les cellules dendritiques, or lors de cet échange, des signaux co-stimulateurs sont requis pour finaliser l'activation. Ce paramètre est décrit comme l’adjuvanticité, et l'absence de ces signaux se traduit par l’échappement de la tumeur au près système immunitaire. Dans un contexte tumoral, l’adjuvanticité est décrite, entre autre, par l’émission de motifs moléculaires associés au danger (DAMPs). Ces DAMPs sont des biomolécules sécrétées lors de mort des cellules cancéreuses et causent une réponse inflammatoire locale. La mort cellulaire immunogène (ICD) est définie par l'induction d'un stress aux cellules cancéreuses, et aboutit à la mort de celles-ci, accompagnée de la libération de nombreux DAMPs. Ces DAMPs sont reconnus par les cellules dendritiques et initient une cascade cellulaire aboutissant à l'activation de réponse immunitaire anti-cancéreuse . Plusieurs études ont décrit certaines chimiothérapies et radiothérapies comme inductrices de mort cellulaire immunogène, ce qui renforce leurs effets thérapeutiques. Jusqu'à présent, peu de molécules ont été caractérisées comme inductrices de l’ICD. Or ces agents pourraient être pertinemment utilisés en thérapie combinatoire en oncologie, avec des immunothérapies par exemple, afin de renforcer la réponse immunitaire anti-cancéreuse, et à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer la capacité de molécules à induire une vaccination contre 3 modèles tumoraux différents via une induction de la mort cellulaire immunologique. Cette mort cellulaire permet d’engendrer des populations de lymphocytes T spécifiques contre la tumeur. Ainsi les souris seraient vaccinées contre la tumeur étudiée, ce qui serait un bon modèle préclinique en vue de développer des stratégies identiques ou similaires dans l'espèce humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections durant toute la durée de l’expérience. Ces injections se feront après anesthésie locale sur l’un des deux flancs de l’animal, durée 5-10 minute. Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine pendant la période entre la 1ère et la 2nde injection de cellules), durée: 2-3 minutes.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sur le flanc des souris, en sous-cutanée. Nuisances limitées liées à la présence de cette tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (rate, ganglions drainants et tumeur) et d'étudier au mieux la réponse immunitaire mémoire mise en place.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests elternatifs in vitro. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire la capacité de nos molécules à induire la mort cellulaire, or il nous est impossible d’évaluer leur capacité à engendrer une population celulaire spécifique. L'utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier la réponse immunitaire mémoire, et une potentielle vaccination complète contre les tumeurs étudiées. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Les traitements et procédures seront faits après tirage au sort et en aveugle. Afin réduire le nombre d’animaux, seules deux concentrations par molécule seront testées afin d’observer une vaccination in vivo. Ces deux concentrations seront déterminées au préalable via des tests de toxicité in vitro. Les témoins seront regroupés pour éviter la multiplication des groupes témoins lors du test in vivo en faisant toutes ces procédures en parallèle pour chaque modèle tumoral. Les résultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal : - Les injections seront effectuées après anesthésie locale - Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse . - Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Des points limite ont été définis a priori et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeurs existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implatation chez la souris est indispensable pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines (travaux sur les cancers de l'adulte).

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une xénogreffe de tumeur dans le pancréas par chirurgie, parfois une seconde chirurgie d'exérèse, puis des injections de nanoparticules magnétiques, une exposition à des champs magnétiques et une irradiation, pour tester une destruction locale des tumeurs. Le porteur renvoie les retombées cliniques annoncées, sensibiliser des cancers résistants et abaisser les doses de chimiothérapie, au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que la validation in vitro déjà obtenue doit maintenant passer par la souris, sans détailler d'alternative.

Objectifs

Les objectifs de cette étude consistent à analyser l’effet anti-tumoral de nanothérapies par ablation mécanique ou hyperthermie magnétique locales, consistant en l’injection de nanoparticules magnétiques suivie d’une application de champ magnétique alternatif à basse fréquence [amplitude 1 à 380 mT / Fréquence 0 à 20 Hz] ou haute fréquence [amplitude 1-50 mT, fréquence 100 à 350 kHz] en association ou non avec des agents chimiothérapeutiques, pharmacologiques ou un traitement radiothérapeutique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur les nanothérapies pour des cancers incurables pour lesquels la clinique ne dispose pas ou peu de solutions thérapeutiques, tels que le cancer du pancréas. Ces stratégies nano-thérapeutiques pourront être associées aux traitements conventionnels (chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques) et devraient sensibiliser ces tumeurs très résistantes à ces traitements. Les stratégies nanothérapeutiques pourraient également permettre d’abaisser la dose des traitements conventionnels (chimiothérapie, radiothérapie), réduisant ainsi leurs effets indésirables.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à une procédure chirurgicale permettant de réaliser des xénogreffes orthotopiques (intra-pancréatiques principalement, durée 15 minutes). Une seconde procédure chirurgicale sera éventuellement envisagée, consistant à l’exérèse de la tumeur principale (durée 30 minutes), antérieurement aux traitements nanothérapeutiques an association ou non avec un traitement chimiothérapeutique, pharmacologique ou radiothérapeutique, afin de mimer les conditions retrouvées en clinique humaine proposant les traitements anti-cancéreux après chirurgie. Les autres interventions consisteront en : 1) l’injection de nanoparticules, d’agents chimiothérapeutiques ou pharmacologiques (durée :

Impact sur les animaux

De nombreuses études in vivo utilisant des nanoparticules d’oxyde de fer ont été menées et permettront l’utilisation de ces nanoparticules (concentration, mode d’injection…) sont induire de nuisances sur les animaux. Il existe aussi des données sur l’utilisation des champs magnétiques. Ceux-ci peuvent induire quelques effets indésirables (notamment les champs à haute fréquence). Nous prévoyons de limiter les expositions en s’appuyant sur les données de la littérature pour ne pas induire de nuisances ou limiter les effets indésirables : les temps et séquences d’exposition ainsi que les paramètres de champs seront scrupuleusement choisis pour obtenir le meilleur rapport bénéfice/risque. L’implantation de xénogreffes peut engendrer des effets indésirables sur les animaux, ainsi que la chirurgie d’exérèse de ces tumeurs. Les souris ayant subi ces procédures (xénogreffes, chirurgie d’exérèse) sont suivies quotidiennement, pesées au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance, pendant toute la durée de l’étude. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …§points limites) les animaux seraient placés en cage individuelle dans un milieu enrichi et suivis attentivement. Si leur état ne s’améliorait pas, les animaux seraient euthanasiés.

Devenir

Les animaux utlisés dans les procédures 1 à 7 et 10 sont gardés en vie pour réaliser les procédures suivantes. Les animaux utilisés dans les procédures 8 et 9 sont maintenus en vie jsuquà la fin de l'expériences consistant à analyser l'efficacité des traitements sur la croissances tumorales. Les souris seront quotidiennement observées afin d’évaluer le bien-être ou la douleur. Les points limites sont définis ci-dessous : #1 : Perte de poids de 20% par rapport au poids initial #2 : Nécrose ou ulcération des tumeurs cutanées macroscopiquement visible Tumeur cutanée atteignant 2 cm³ #3 : Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après la chirurgie En cas de dépassement des points limites, les animaux seront suivis attentivement pendant quelques jours et, si leur état ne s’améliorent pas, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue décrite au paragraphe 3.3.3.

Remplacement

Nous avons validé in vitro l’efficacité de stratégies de ciblage des cellules cancéreuses, du microenvironnement ou de la matrice extracellulaire à l’aide de nanoparticules vectorisées. Nous devons maintenant valider l’efficacité de ce ciblage in vivo, afin d’optimiser ces stratégies qui feront l’objet de tests précliniques, notamment pour le dépistage et la thérapie des tumeurs. Nous avons validé que ces nanoparticules constituent in vitro un agent anti-cancéreux efficace : ciblage efficace des cellules d’intérêt, induction de mortalité et arrêt de prolifération des cellules après application d’un champ magnétique... Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…) qui pourront faire l’objet de tests précliniques.

Réduction

Les études in vitro ont été menées précédemment de façon approfondie afin d’anticiper au maximum les futurs résultats in vivo, de privilégier les orientations scientifiques prometteuses, et limiter le nombre d’animaux qui seront utilisées pour valider les stratégies thérapeutiques proposées dans le projet. Nous devons maintenant valider que cette efficacité thérapeutique est réelle in vivo, sur des modèles murins de cancer. Cette validation permettra d’optimiser ces stratégies (améliorer la conception de nanoparticules magnétiques, les paramètres de champs magnétiques…). Le retour aux validations in vitro, à chaque étapes-clefs (validation d’une nouvelle association de traitements nanothérapie + nouvel agent chimiothérapeutique, par exemple), seront toujours privilégiées afin de limiter les études in vivo.

Raffinement

Des tests sur un faible nombre d’animaux seront toujours envisagés, autant de fois que nécessaire, afin de définir et d’optimiser les conditions (concentrations en agents thérapeutiques, en nanoparticules, temps et séquences d’exposition aux champs magnétiques…) afin de garantir l’obtention de résultats concluants dans les études pré-cliniques menées.

Choix des espèces

Des données dans la littérature montrent une bonne tolérance des souris au protocole envisagé et la biocompatibilité des nanoparticules utilisées a été validée dans cette espèce. D’autre part, nous avons antérieurement validé que les modèles cellulaires utilisés (lignées tumorales pancréatiques humaines et murines – i.e. MiaPaca2, BxPc3, Panc1, R211…- et lignées de CAFS ou Cancer-associated fibroblasts humains et murins) permettent de réaliser des xénogreffes chez la souris nude ou C57/BL6 dans de bonnes conditions, sans souffrance de l’animal. Jeunes adultes pour les souris xénogréffées : Ce choix se justifie par la réalisation plus facile de la chirurgie chez de jeunes adultes. Jeunes adultes ou adultes pour les souris transgéniques par la nécessité d’attendre le développement d’une tumeur.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs rénales, elles reçoivent un traitement par gavage quotidien et sont suivies par échographie puis IRM sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur annonce des bénéfices en termes de compréhension des mécanismes du cancer et de pistes thérapeutiques, formulés au conditionnel. Il affirme que les expériences in vitro ou in silico ne conviennent pas car "trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu" et que la souris est le seul mammifère où les gènes visés ont été mutés.

Objectifs

Les cancers du rein représentent environ 2% des tumeurs malignes chez l’être humain. Au cours des dernières décennies, l’incidence de ce cancer a progressivement augmenté. Le cancer du rein touche davantage les hommes que les femmes, il est diagnostiqué principalement entre 60 et 70 ans mais peut survenir à tout âge. Les facteurs de risque principaux sont le tabagisme et l’obésité. Le potentiel métastatique de ces cancers est important. La survie médiane à ce stade n’est que de treize mois, le défi thérapeutique est donc immense. Au cours des dix dernières années, il a été clairement établi que ces cancers sont associés à des anomalies génétiques spécifiques tant dans les formes sporadiques que dans les formes héréditaires. Actuellement, il n'existe pas modèle préclinique pour analyser correctement le developpement d'un cancer du rein. Un modèle préclinique efficace permettrait de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant au développement de cellules cancéreuses. Identification potentielle de nouveaux traitements. Identification potentielle de biomarqueurs.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume tumoral. Celui ci sera effectué́ par un technicien expérimenté́ et le plus petit volume possible sera administré aux souris. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché́, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Les tumeurs rénales seront surveillées en imagerie à intervalles réguliers (echographie une fois par mois puis une seule IRM en fin de procédure).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage. Nous serons particulièrement attentif aux fausses routes (point limite établi). La réalisation des suivis en imagerie se fera sous anesthesie générale. Nous serons particulièrement attentifs au stress induit par l'anesthésie (point limite établi).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur le cancer du rein, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points-limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul mammifère pour lequel les protéines PIK3CA, VHL et SDHA ont été mutéee. Souris âgées d'au moins 4 semaines car il est nécessaire que leur développement soit terminé.

32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.

Objectifs

L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.

Procédures

Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.

Impact sur les animaux

La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.

Réduction

Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.

Raffinement

Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.