Cancers

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

1 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections quotidiennes de dérivés d'antidiabétiques et d'immunothérapies, puis des prélèvements de sang, pour évaluer l'effet de ces combinaisons sur le mélanome et les cancers du côlon et du pancréas. Le porteur indique surveiller les tumeurs qui saignent ou suintent et mettre à mort en l'absence d'amélioration. Il affirme que le passage par l'animal est une "étape cruciale" avant l'humain.

Objectifs

Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus dans le traitement du mélanome (cancer des mélanocytes qui sont les cellules de la peau responsables de la pigmentation), à l’aide de thérapies ciblées. Mais après une courte période de rémission, le mélanome acquiert, dans presque tous les cas, une résistance contre la drogue. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles molécules candidates pour la mise en place de thérapies spécifiques. Pour ce faire, nous avons fait synthétiser plusieurs dérivés d'anti-diabétiques (composés connus pour leurs propriétés anti- mélanome). Ces composés induisent la mort des cellules de mélanomes sans affecter la viabilité des cellules normales. De plus, certains de ces composés présentent des propriétés anti-invasives. Nos différentes molécules ont préalablement testé in vitro, seules les plus efficaces seront étudiées in vivo (dans un but de réduction du nombre d’animaux), afin de se placer dans un contexte plus physiologique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, des résultats encourageants ont été obtenus avec l’inhibiteur d’une molécule retrouvée dans 50 % de mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées récemment. Mais elles ne donnent une réponse positive que dans 10 à 30% des cas. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies spécifiques et de combiner ces nouvelles molécules avec les immunothérapies déjà utilisées chez les patients, afin de voir si nos molécules sont capables d’augmenter leurs effets. Les cellules cancéreuses seront injectées en sous cutané dans des souris (souche C57B6J ou BalbC) pour observer l’effet des composés sur la croissance de tumeurs primaires (mélanome, cancer du pancréas et du côlon), en combinaison ou non avec les immunothérapies. Nous étudierons aussi la formation et le développement de métastases et micro- métastases pulmonaires sur les souris. Et nous pourrons observer l’effet des différents composés en combinaison ou non avec les immunothérapies sur la croissance de tumeurs non primaires. Nos composés étants des dérivés d’antidiabétiques, il serait intéressant de comparer les effets du composé antitumoral le plus efficace sur la résistance à l’insuline et sur l’intolérance au glucose avec ceux de la metformine (médicament de référence).

Procédures

1 seule Injection sous cutanée ou intraveineuse (environ 30 sec). Injection intrapéritonéale quotidienne (environ 10 sec) pendant maximum 4 s de traitement. Anesthésie gazeuse au vetflurane tous les 4 jours (environ 15 min). Prélèvement d'une goutte de sang à la queue, 7 fois sur une durée de 2 heures après une seule incision au début de l’expérience. Le prélèvement prend environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les Injections faites sur les animaux,les sites sont surveillés quotidiennement. Il peut y avoir une inflammation des sites, dans ce cas on traitera à la vétédine quotidiennement et si il n'y a pas d'amélioration au bout de 3 jours, la souris sera mise à mort. Concernant, l'aspect et la taille des tumeurs: il arrive qu'une tumeur saigne ou suinte, dans ce cas traitement à la vétédine quotidien et sans amélioration au bout de 3 jours, l'animal est mis à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale

Remplacement

Après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs composés antidiabétiques ayant des effets anti-tumoraux en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces drogues sont plus efficaces sur modèles de mélanome et de cancers colique et pancréatique chez la souris . Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Nous avons choisi de faire des groupes de 10 souris et de faire 3 expériences indépendantes. Ceci nous permettra d’éviter de réaliser la 3ème expérience si, après 2 expérimentations, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, dans le but de réduire le nombre de souris. Dans notre laboratoire, nous réalisons depuis de nombreuses années des expériences de prise de tumeurs sur les souris. L’expérience nous a montré qu’il était plus pertinent de faire des groupes de souris moins importants et de faire des expériences indépendantes. Dans plusieurs de nos protocoles, seules 2 expériences ont été nécessaires pour avoir des résultats significatifs, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux. Pour la procédure 1, seules 2 expériences ont suffit pour avoir des résultats statistiquement significatifs. celà nous permet de rajouter une procédure pour mieux caractériser notre dérivé antidiabétique sans avoir besoin de rajouter des animaux dans notre PEA.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Les points limites que nous avons définis sont prédidifs et suffisamment précoses pour éviter toute souffrance ou mal-être des animaux. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux, qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal- être ou une souffrance

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établie ainsi qu’une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Par ailleurs, la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude de la réponse aux inhibiteurs d'immune checkpoint ce qui représente dans le cadre de notre projet et des molécules que nous voulons tester, un atout très important. Pour toutes les procédures, les souris seront utilisées au stade adulte (6 semaines). Elles seront commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine. La croissance tumorale est optimale pour les souris à cet âge là et ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

954 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de tumeur du péritoine puis des gavages et injections d'antibiotique et d'antiangiogénique, avant un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour tester un traitement du pseudomyxome évitant une chirurgie lourde. Une partie des tumeurs est regreffée à d'autres souris pour entretenir le modèle. Le porteur affirme que cette tumeur, faite de gélatine, ne peut être étudiée in vitro.

Objectifs

Le but de ce nouveau projet est de tester l’effet combiné d’anti-angiogéniques et d’antibiotiques sur l’évolution du pseudomyxome et de ce fait pouvoir déterminer un traitement pour les patients qui ne peuvent supporter une chirurgie lourde.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir déterminer un traitement non invasif qui inhiberait l'évolution du pseudomyxome afin de traiter les patients qui ne peuvent pas supporter une chirurgie lourde et donc le traitement de référence.

Procédures

Les souris sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3%), après une injection sous cutanée locale de Lidocaïne (1mg/kg), seront soumis à une greffe intrapéritonéale d'une tumeur de pseudomyxome(1 fois 5-10min). Puis les animaux vigiles recevront en intrapéritonéale ou par gavage 2 fois par semaine pour l'anti-angiogénique (ou le solvant), et du lundi au vendredi pour le sorafenib et l'antibiotique (ou le solvant) (30secondes à chaque administration). A la fin de l'expérience, 4souris par groupe seront anesthésiées par un mélange dekétamine (80 mg/kg) et de xylazine (16 mg/kg) après une injection en sous-cutanée de buprénorphine 30 minutes avant (0,1mg/kg) (1fois 30secondes) pour l'examen de microangiographie (20- 25minutes). Enfin, les autres souris auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse post-mortem.

Impact sur les animaux

Il n'y a pas d'effets indésirables attendus sur les animaux traités par les antiangiogéniques car ils ont déjà été utilisés dans d'autres projets et sont utilisés à des doses non toxiques. Concernant les antibiotiques, nous n'attendons pas d'effets indésirables non plus mais comme chez l'homme, le risque d'effets notamment sur le système digestif n'est pas à écarté. Nous utiliserons les mêmes doses qui sont utilisées chez l'homme, rapporté au poids de la souris. Cependant, la surveillance quotidienne des animaux et plus précisément des points comme leur poids, leur apparence, leur comportement 2 fois par semaine notifiés dans un cahier de suivi des animaux nous permettront de déterminer si les traitements ont un effet néfaste sur la santé des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la 1ère procédure, par dislocation cervicale sous anesthésie générale pour la deuxième procédure, dès que le poids aura atteint 33g. A la fin de la 1ère procédure, nous utiliserons le sang et la tumeur pour des analyses post-mortem; pour la 2ème procédure, une petite partie de la tumeur obtenue sera greffé à 3 autres souris pour maintenir le modèle.

Remplacement

Nous ne pouvons remplacer le modèle murin. En effet, cette tumeur est très peu cellulaire car essentiellement formée de gélatine, nous ne pouvons l’étudier in vitro. Il est nécessaire de reproduire la maladie par un modèle de greffe orthotopique par greffe de fragments de pseudomyxome en intrapéritonéal sur des souris nudes.

Réduction

En dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur les modèles de Pseudomyxomes (cancer rare du péritoine) et de la variabilité observée de ces derniers, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour tester une expérience. En cas de groupe contrôle régulier nous nous autorisons à diminuer le nombre à 5 en acceptant pour faire les analyses scientifiques de pooler deux groupes contrôles. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Vu qu'il y a un risque de mortalité lié à l'intervention permettant la greffe de pseudomyxome, les groupes seront composés de 12 souris. Aussi, nous allons utiliser un seul groupe de souris contrôle pour 2 à 3 groupes de traitement quand cela sera possible. Cela permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe Contrôle avec les groupes traités par les combinaisons.

Raffinement

Les souris auront une période d'acclimatation de 5 jours minimum. Les animaux seront observés quotidiennement. Afin d'effectuer la greffe intrapéritonéale de pseudomyxome, les animaux recevront une injection d'analgésie locale et seront sous anesthésie générale gazeuse. Avant l'intervention finale (ponction cardiaque) les animaux recevront une injection d'analgésie et seront ensuite sous anesthésie générale. Concernant l'examen de microangiographie, les animaux seront aussi sous anesthésie générale. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l'expérience dans les 24heures.

Choix des espèces

Nous utilisons l’espèce souris pour notre projet car nous avons besoin d’animaux immunodéficients (cas des souris NOD ou nude). En effet, dans ce cas les tumeurs greffées ont la possibilité de se développer sans risquer un rejet. Aussi, les essais pré-cliniques sur la souris dans le cas du pseudomyxome permettent d’obtenir des informations satisfaisantes pour l’Homme. Les souris seront utilisées à l’âge de 5-6 semaines pour ne pas interférer avec les processus de vieillissement.

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.

Objectifs

Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.

Bénéfices attendus

Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.

Procédures

Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.

Impact sur les animaux

Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.

Réduction

Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de lymphome leur est implantée sous la peau par chirurgie sous anesthésie, puis suivie par des séances d'imagerie IRM sous anesthésie, jusqu'à quatre par animal, pour démontrer l'intérêt de cette imagerie en oncologie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % entraîne la mise à mort de l'animal. Les souris sont tuées en fin de procédure pour congélation ou fixation des tumeurs.

Objectifs

Le projet présenté vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) en oncologie . L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée en clinique. Nous attendons de l'IRM qu'elle permette de raffiner les études précliniques et ainsi à terme d'optimiser la règle des 3R, mais également qu'elle permette de travailler avec des modèles tumoraux inaccessibles aux méthodes classiques. Le projet présenté rentre dans ce dernier cas de figure. Il porte sur le suivi par IRM d'un modèle de lymphome implanté en sous-cutané chez la souris immunocompétente. Ce modèle présente un intérêt fort pour comprendre les mécanismes d'apparition de résistances aux anticorps thérapeutiques, mais ne peut pas être étudié avec des méthodes conventionelles. En effet, après l'implantation sous cutanée du modèle tumoral, se développe à l'emplacement soit une masse tumorale, soit une masse inflammatoire, qui ne peuvent pas être discriminées par les méthodes d'observation et de mesure. L'IRM permettra de faire cette discrimination. Le projet prévoit d'utiliser 30 souris, 10 pour amplifier la modèle tumoral in vivo, 20 pour l'analyse IRM.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de caractériser un modèle de cancer du sang, le lymphome B, afin de développer un variant permettant de comprendre les mécanismes d’apparition de résistances à un anticorps thérapeutique. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive en oncologie préclinique, technique dont la précision permettra à terme d'optimiser les 3R dans ce contexte.

Procédures

-implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute, administration d’antalgiques au préalable ; traitement si douleur post opératoire 20 minutes maximum -anesthésie fixe durant l’IRM durée maximale 30 minutes de kétamine/Xylazine sur un total de 2/semaine durant 2 semaines soit 4 injectionx maximum.

Impact sur les animaux

- Perte de poids constatée : plus de 10% non améliorée par ajout de nourriture humide en maximum 24h ; une perte de plus de 20% qui serait liée à l'évolution de la croissance entrainera une mise à mort de l’animal - implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs sous cutanées, une 10aine de minute administration d’antalgiques au préalable ; - croissance de tumeurs sous-cutanée au niveau du flanc - anesthésie fixe durant l'IRM pour une durée maximale de de 30 minutes,4 séances maximum espacées de 3 jours au minimum

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de chaque procédure (soit pour congelation des tumeurs pour le stock soit pour fixation en formol).

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire que sur l’organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement au taux d’anomalies de croissance tumoral. Nous utiliserons 10 souris + 20 souris soit 30 souris totales, et ferons une étude statistique d’analyse de contingence et un test de Fischer pour comparer avec une situation normale.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final des tumeurs seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Pour les modèles implantés sous la peau par chirurgie, les animaux seront traités avec un antalgique avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie. La procédure d’imagerie IRM se fera sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 5 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des injections intraveineuses et des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, pour suivre la biodistribution de six molécules anticancéreuses modifiées. Les souris dont la tumeur dépasse 400 mm3 ou se nécrose sont mises à mort par dislocation cervicale. Le porteur présente l'étude comme préliminaire, destinée à sélectionner les meilleurs candidats, et revendique une réduction du nombre d'animaux grâce à l'imagerie de fluorescence.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections. Il est exprimé par les cellules immunitaires et épithéliales normales ainsi que de très nombreux cancers solides. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination empêchant les récidives. Malgré cela, aucun activateur de ce récepteur n'a jusqu’ici obtenu l'autorisation de mise sur le marché en raison d'effets toxiques, de manque d'efficacité ou d’homogénéité. Un nouvel activateur de ce récepteur a récemment été découvert, homogène, actif, spécifique et surtout très bien toléré. De nombreuses études sur souris ont permis d’objectiver l’efficacité de ce nouveau candidat médicament (non protégées, ni vectorisé), administré par voie locale (intratumorale). Afin de favoriser l'administration par voie veineuse, ce candidat médicament sera protégé (pour résister aux enzymes présentes dans le sang qui peuvent dégrader ces molécules), et vectorisé (afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et immunitaires d’intérêt). L’objectif de cette étude est donc d’observer les effets de ces protections et vectorisations sur la stabilisation et la localisation des candidat médicament au cours du temps. Il s’agit d’une expérience préliminaire destinée à raffiner le choix des meilleurs candidats (qui devront être confirmé par la suite par des études de biodistribution plus complètes et à visées statistiques). Pour cette étude préliminaire, six différentes molécules (portant différentes combinaisons de protection et de vectorisation), seront analysées. Ces molécules seront toutes marquées avec une molécule fluorescente. C’est cette fluorescence qui permettra de les localiser et de les quantifier au cours du temps, grâce à des méthodes innovantes d’imagerie en trois dimensions. Cela permettra d’obtenir une biodistribution corporelle de ces composés. Pour chacune des six molécules, cinq souris seront injectées par voie intraveineuse. Les souris seront analysées quand leurs tumeurs atteindront 100 à 200mm3. A cette taille-là, les tumeurs sont suffisamment bien vascularisées pour permettre une délivrance à la tumeur par voie sanguine.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de de définir les bases pour une nouvelle voie d’administration d'un candidat médicament, en ciblant plus spécifiquement certains types de tumeurs ainsi que des cellules immunitaires d’intérêt, ce qui diminue les doses nécessaires à son activité ainsi que les effets indésirables. Il s’agit d’une étude de recherche à la fois fondamentale et translationnelle, permettant de poser les bases d’une nouvelle voie d’administration d’un candidat médicament anticancéreux, en vue d’une étude clinique chez l’homme. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le meilleur model tumoral à utiliser pour les études de biodistribution. La seconde procédure permettra de cribler les molécules modifiées sur la base de leur cinétique et quantité de distribution à la tumeur et ainsi d'évaluer le/les meilleurs candidats pour une étude clinique en injection par voie intraveineuse.

Procédures

# Greffe tumorale: injections sous-cutannées de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Injections par voie intraveineuses (produit de contraste dans la procédure-1 et molécules fluorescentes dans la procédure-2), sous anesthésie gazeuse (3-5 minutes). # Analyses par imagerie échographiques (échodoppler et echographie de contraste) sous anesthesie gazeuse (temps d'analyses cumulés de 30-40 minutes environ). # Analyses par imagerie de fluorescence 3D (non invasive) sous anesthesie gazeuse (5 minutes environ - répétées aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h ).

Impact sur les animaux

Douleurs engendrées par l’injection de cellules tumorales, la pousse tumorale, les anesthésies répétées, stress engendré lors des analyses de volume tumoral et de poids de la souris. De façon plus détaillée: #Procédure-1: (1) les animaux seront greffées avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc sous anésthésie gazeuse. (2) Suivi de croissance tumorale trois fois par semaine avec manipulation des animaux pour mesurer la tumeur et peser les animaux. (3) Lorsque les tumeurs atteignent environ 100 à 200mm3, les souris sont anesthésiées pour deux analyses en imagerie échographique consécutives (non invasive). La seconde analyse nécessitera l'injection intraveineuse (dans la veine caudale) d'un agent de contraste (toujours sous anésthésie). Le temps cumulé de ces deux analyses est d'environ 30 à 40 minutes. (4) Les souris ayant des tumeurs au-delà de 400mm3 ou nécrosée seront mises à mort par dislocation cervicale. #Procédure-2: Les animaux seront greffés avec des cellules cancéreuses par injection sous-cutanée dans le flanc (du modèle déterminé en procédure-1). Les souris seront anesthésiées et injectées avec les molécules fluorescentes par voie intraveineuse (dans la veine caudale). Les souris seront alors analysées en imagerie de fluorescence (non invasive) sous anesthésie aux temps 5min, 15min, 30min, 1h , 2h, 4h, 6h et 24h (chaque analyse prenant environ 5 minutes). Après la dernière analyse à 24h, les animaux seront mis à mort et leurs organes récupérés post-mortem pour analyses.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort. Leurs organes et tumeurs seront prélevés post mortem pour analyse.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo des molecules modifiées (efficacité, stabilité, internalisation), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire dans les donditions d'injection par voie intraveineuse afin d’analyser la biodistribution dans les organes/tissus/tumeurs au cours du temps et de définir une approche qualitative et cinétique pour poser les bases d’une étude clinique.

Réduction

La procédure-1 permet de mettre au point le modèle et de le caractériser au mieux sur un nombre limité d’animaux (5 souris par modèle tumoral – 4 modèles). Ce nombre limité d’animaux est permis grâce à des méthodes non invasives d’imagerie échographiques de pointe permettant de répondre avec précision aux questions posées sur vascularisation des tumeurs et de perméabilité de celles-ci aux traitements injectés par voie intraveineuse. Seul le meilleur modèle sera utilisé par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (8 animaux greffées pour 5 animaux analysés par molécule – jusqu’à 12 molécules). Pour éviter la dispersion des résultats, seuls les animaux les plus homogènes en termes de taille de tumeur mais aussi en termes de vascularisation seront analysés. La cinétique de biodistribution par imagerie de fluorescence constitue en soit une réduction par rapport aux biodistribution classiques en point final à chaque temps. Cette méthode évite ainsi d’avoir à procéder à de très nombreuses mises à mort d’animaux aux différents temps d’intérêt pour obtenir les mêmes résultats. Le fait que nous ne cherchions pas de résultats statistiques mais tout en étant sur un pool de tumeurs homogène et bien caractérisé, nous permet d’avoir les résultats suffisamment robustes pour répondre à la question du criblage de ces molécules in-vivo sur ce nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux, en environnement enrichi avec eau et nourriture (classique et non fluorescente) à volonté, dans des conditions sanitaires permettant que leur phénotype ne soit pas dommageable. Le changement d’alimentation pour une nourriture non fluorescente est généralement très bien toléré par les animaux et n’engendre pas de diarrhées ou autres troubles digestifs. Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs (significatifs d'exclusion de l'expérience et de Mise à Mort), et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de batons à ronger. Les souris seront greffées avec tumeurs en injection sous-cutanée dans le flanc sous anesthésie gazeuse, selon les conditions publiées dans la littérature. La surveillance des animaux sera effectuée trois fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. La taille des tumeurs (de 100 à 200mm3 pour les études d’imagerie), permet une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal, avec moins de risque de nécrose. L’imagerie par fluorescence et par échographie sont des processus non invasif et non douloureux mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. L'animal est anesthésié sous isoflurane et est placé dans une cassette de contention. Pour l’imagerie échographique, la souris est fixée sur un plateau chauffant réglable afin de maintenir sa température interne, contrôlable par une sonde anale. De plus les pattes sont fixées à des électrodes permettant de contrôler en direct l’ECG. Pour l’imagerie de fluorescence, de l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir constante la température de l’animal. Les animaux sont réveillés sous une lumière chauffante et sous surveillance. Tous les animaux de l’expériences seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle physiologique complexe que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris immunodéprimées, appareillage adapté comme le FMT...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies ciblées chez cette espèce. Des souris de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement matures, ce qui est nécessaire dans notre étude de biodistribution (assimilation, barrière hématoencéphalique...) etc. Les quatre types de tumeurs greffées provenant de patients humains ou d'une souche murine différente, donc toutes non immuno-compatibles, l'utilsiation des souris immunodéficientes BALB/c Nude permettra l'absence de rejet de ces tumeurs. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée.

30 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et 2 500 réutilisées dans un autre projet. Le porteur leur greffe sous la peau des tumeurs dont il laisse le volume atteindre 1 000 à 2 000 mm³, teste des composés anticancéreux et mesure la tumeur au pied à coulisse, avec implantation chirurgicale de pompes et prélèvements sanguins répétés. Les souris incluses sont euthanasiées par dislocation cervicale ou au CO2, celles écartées à la randomisation pouvant être réutilisées. Il affirme que l'étape chez l'animal reste "indispensable" malgré les tests in silico et in vitro préalables.

Objectifs

En Europe comme aux Etats-Unis, le cancer est actuellement la seconde cause de mortalité après les maladies cardiovasculaires. En France, le cancer provoque environ 33% des décès chez les hommes et 23% chez les femmes. Il est donc primordial de s’intéresser à cette maladie et de trouver de nouvelles thérapies. Les cellules cancéreuses sont initialement des cellules normales qui ont acquis, au cours du temps, un certain nombre de mutations faisant qu’elles ne répondent plus aux différents mécanismes de régulation et prolifèrent indéfiniment engendrant la formation d’une tumeur maligne et/ou de métastases. Un enjeu majeur pour la recherche consiste à trouver de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, tout en limitant les effets secondaires sur l’organisme. L’objectif de ce projet consiste à tester de nouvelles thérapies, spécifiques des cellules cancéreuses, sur un modèle tumoral préalablement établi et parfaitement maitrisé chez la souris. Un moyen d’évaluer l’efficacité des molécules testées est de mesurer la régression tumorale en réponse au traitement de tumeurs greffées sous la peau, au moyen de mesures régulières de leur taille avec un pied à coulisse pendant une durée maximale de 4 mois. Ces études d’efficacité in vivo ont pour but premier de caractériser l’activité antitumorale des produits au sein d’un organisme vivant et complexe, l’objectif ultime étant le développement d’un candidat médicament pour le cancer. Les produits sélectionnés peuvent être évalués sur différents schémas de traitements (en modulant les doses, les voies d’administration, le nombre d’administration par jour, la récurrence ou une diffusion continue) afin d’escompter une régression partielle ou totale de la tumeur.

Bénéfices attendus

A travers l’investigation in vivo de potentiels candidats médicament, ce projet va permettre d’évaluer leur activité antitumorale, seuls ou en combinaison avec d’autres thérapies, et ainsi identifier des nouvelles stratégies dans la lutte contre le cancer. De plus, il rendra possible l’investigation de différentes modalités et schémas d’administration, de façon à trouver les conditions optimales pour maximiser l’efficacité contre les cellules tumorales et minimiser la toxicité pour les cellules saines, véritable enjeu pour le bien être des patients. Les produits sélectionnés peuvent être évalués sur différents schémas de traitements (en modulant les doses, les voies d’administration, le nombre d’administration par jour, la récurrence ou une diffusion continue ) afin d’escompter une régression partielle ou totale de la tumeur. A travers les deux procédures décrites, les objectifs du projet vont être plus précisément les suivants : - démontrer l’efficacité antitumorale in vivo de nos composés et ainsi soutenir l’intérêt thérapeutique de la cible en question, ce qui est primordial au développement d’un candidat médicament - rechercher les indications thérapeutiques et les combinaisons qui permettent au candidat d’exprimer au mieux son potentiel curatif - établir une relation PK/efficacité et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées - déterminer le profil d’exposition optimal pour avoir une activité antitumorale (via l’utilisation de pompes implantées en sous-cutanée chez la souris) - investiguer la persistance d’efficacité du traitement sur la réponse immunitaire grâce à la réimplantation en contra-latéral de la même lignée tumorale après observation d’une régression tumorale complète de la greffe initiale (« rechallenge ») - étudier la formation de métastases suite à une greffe en sous-cutanée, en intradermique ou intra-mammaire et leur sensibilité au traitement.

Procédures

- Ponction à la veine jugulaire (durée 5 minutes) : 1 prélèvement de sang au dernier jour de traitement (ou en cours de traitement), sous anesthésie gazeuse, à raison de 10% du volume total de sang en 1 fois (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs). Ex : 158µL pour une souris de 25g - Ponction cardiaque ou veine cave (durée 5 minutes): 1 prélèvement de sang en procédure terminale, sous anesthésie gazeuse et suivie par l’euthanasie de l’animal (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs). Ex : 500µL/souris « Microsampling » (durée environ 1 minute) : prélèvements de sang, en cinétique (Ex 1 : 6 temps/ prélèvements de 40µl sur une semaine), à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, en ne dépassant pas la limite totale cumulée de 15% du volume total de sang circulant sur 28 jours (pour les analyses de pharmacocinétique, pharmacodynamie ou biomarqueurs) -Eventuellement, prélèvement de la tumeur primaire (durée 15-20 minutes) (sous anesthésie gazeuse et analgésie pré et post opératoire) dans le cas de lignées métastatiques greffées en sous-cutanée, en intradermique ou en intramammaire pour évaluer l’efficacité anti-métastatique du composé -Dans le cadre de l’implantation d’une pompe (durée 15 minutes si implantation en SC , et 1 heure si cathéter en IV), les animaux seront sujets à une intervention chirurgicale. Les conditions adaptées d’anesthésie et analgésie seront appliquées de façon à réduire autant que possible la douleur.

Impact sur les animaux

Le but du projet étant d’étudier l’activité antitumorale de nos candidats médicament dans des modèles relevant de la pathologie, les souris reçoivent une greffe de cellules cancéreuses ou de fragments tumoraux sous la peau qui vont développer une tumeur de taille limitée à 1000 ou 2000 mm3 selon la procédure mise en œuvre. Concernant les traitements pharmacologiques, les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet). Cependant, selon la cible du candidat médicament, même à des doses tolérées dans l’absolu, il peut y avoir une toxicité allant de faible à modérée. En effet, même si les efforts pour identifier des thérapies ciblées sont nombreux, les cellules tumorales sont à l’origine des cellules normales du soi : il est donc très difficile de trouver des traitements qui affectent uniquement les cellules cancéreuses en épargnant complétement les tissus sains. L’administration des candidats traitements pourra être effectuée via une pompe implantée sous chirurgicalement sous la peau du dos. Enfin, ce projet peut nécessiter l’utilisation de souches de souris transgéniques ou mutantes leur conférant un statut immunodéprimé. Ce statut peut être considéré comme un phénotype dommageable mais non exprimé dans des conditions d’hébergement protégées de l’environnement extérieur strictes.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures décrites dans ce projet, les animaux inclus dans l’étude seront euthanasiés, soit par dislocation cervicale, soit par inhalation de CO2. Eventuellement, un prélèvement de sang via une ponction cardiaque, à la veine jugulaire ou à la veine abdominale (sous anesthésie gazeuse) pourra être effectué au préalable. Les animaux ne rentrant pas dans les critères d’inclusion le jour de la randomisation pourront être réutilisés dans un autre projet, dans la mesure du possible et à la suite d’une validation par SBEA et/ou vétérinaire de leur bon état général. Il se peut que quelques souris supplémentaires (non incluses dans la randomisation) soient traitées avec le composé à tester pour faire une caractérisation biochimique et/ou moléculaire des tumeurs en ex vivo.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse, son comportement dans un système complexe et plus relevant d’un point de vue physiologique, ses potentiels effets secondaires.

Réduction

Avant la mise en oeuvre de ce projet, des tests in vitro et in vivo sont systématiquement effectués afin de sélectionner les meilleurs composés à investiguer. des screenings biochimiques et cellulaires vont permettre d’identifier les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une puissance cellulaire satisfaisante. Des tests ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Elimination) sont ensuite effectués in vitro puis in vivo pour identifier et sélectionner les produits circulants avec une exposition suffisante dans l’organisme. Enfin, on s’assure qu’ils atteignent bien leur cible d’intérêt et induisent l’effet escompté via des études de pharmacodynamie. C’est seulement après ces étapes que l’on peut évaluer leur efficacité antitumorale. Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de définir au préalable les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Les doses de produits à administrer à l’animal sont également sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. La progression tumorale (volume tumoral) est mesurée via le pied à coulisse et permet un suivi dans le temps sur les mêmes animaux. Des prises de sang en « microsampling » (c’est-à-dire sur des petits volumes) peuvent aussi être effectuées au cours de l’étude afin d’analyser des biomarqueurs ou le profil d’exposition du composé (évitant aussi de faire des études de pharmacocinétique complémentaires) et ainsi optimiser les données d’activité antitumorale. Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires par groupe avant le début de l’expérimentation avec le support de l’équipe biostatistique. Ce nombre d’animaux nécessaires par groupe pour évaluer l’efficacité d’un candidat sera estimé par simulation avec un modèle statistique longitudinal.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les souris sont hébergées avec un enrichissement de milieu adapté de manière à favoriser leur instinct de nidification. il va également permettre de surveiller l’état général des animaux par observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci. La croissance tumorale, mesurée au moyen d’un pied à coulisse non invasif et indolore pour l’animal permet une caractérisation et un suivi de l’évolution de la tumeur dans le temps pour un même animal et ainsi une réduction de nombre d’animaux nécessaires à la conduite d’une étude. L’état général des souris est surveillé régulièrement et les volumes tumoraux sont mesurés au minimum 2 à 3 fois/semaine, pour l’objectif de l’étude et pour identifier les éventuels signes de souffrance et appliquer les points limites prédéfinis dès que nécessaire. Ces mesures sont effectuées sous anesthésie gazeuse en cas de pompe pré-implantée (procédure 2) pour éviter l’inconfort de l’animal lors de la contention. Au-delà de 1500 mm3, pour les tumeurs sous cutanées et 1000 mm3, pour les tumeurs intra-mammaires, une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite lié au volume tumoral. L’exérèse de la tumeur lorsqu’elle a lieu (procédure 1) et l’implantation de la pompe (procédure 2) sont effectuées selon les bonnes pratiques chirurgicales avec un protocole anesthésique et analgésique pré et post opératoire adapté, et une observation spécifique sur plusieurs jours jusqu’au rétablissement total. Le point limite de croissance tumorale est fixé à 1000mm3 afin de limiter la charge liée au dispositif cumulée à une tumeur. Au-delà de 600mm3, une surveillance spécifique avec une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures est mise en place afin d’anticiper plus efficacement l’atteinte du point limite. Les prélèvements de sang en « microsampling » sont privilégiés dès que possible (très petits volumes sanguins) et ne dépassent pas le volume maximal respectant le bien etre animal (maximum 15% du TBV (Total Volume Blood) sur 28 jours).

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche préclinique. Le choix du modèle est dicté par le type d’anti-cancéreux étudié (souris immunocompétentes et/ou immunodéprimées) et le choix de la souche par les études de prise tumorale qui permettent de déterminer, en amont, tous les paramètres in vivo (taux de prise, temps de doublement, caractère éventuellement cachectique de la tumeur sur la souche, etc…) et ainsi définir les conditions optimales de greffe. La souche est conservée pour l’ensemble des études in vivo pour une tumeur donnée (DMA/DMT, pharmacocinétique, pharmacodynamie, efficacité). En effet, des différences importantes en termes de tolérance et d’exposition plasmatique d’un produit en fonction de la souche murine peuvent exister, ce qui pourrait impacter le bien-être des animaux ainsi que l’interprétation des résultats. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Pour la procédure 2, compte tenu du volume de la pompe, les animaux sont utilisés le jour de la chirurgie à un poids > à 25 g.