Cancers

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié suit un régime riche en fibres, toutes reçoivent une injection de substance cancérigène sous la peau, et une partie est enfermée sous cloche sans eau ni nourriture pendant une à quatre heures pour mesurer le dihydrogène produit. Le porteur indique que les animaux peuvent développer des nécroses au point d'injection et une tumeur, et sont tués aux points limites pour prélèvement. Il affirme que le rôle du microbiote et l'immunosurveillance des cancers ne peuvent s'étudier qu'in vivo, sans alternative à ce jour.

Objectifs

Il a été montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de certains lymphocytes au niveau intestinal. Dans un modèle murin de mélanome, un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale. Au sein des tumeurs résiduelles, nous retrouvons ces lymphocytes avec des fonctions augmentées.Ceci suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. Afin de pleinement démontrer le rôle de la nutrition dans la prévention des cancers, nous proposons ici d’évaluer les capacités préventives des cancers d’un régime HFD, dans un modèle de cancer chimio-induit, qui se développe « naturellement » suite à l'exposition à un carcinogène. Cette démonstration au plus proche de la situation clinique des patients renforcera nos observations et sera rapidement transférable en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.

Bénéfices attendus

Le modèle de mélanome utilisé jusqu'à présent est très artificiel, car il consiste en l'injection directe de cellules cancéreuses. En conditions physiologiques, un cancer apparait progressivement, suite à une exposition à un carcinogène. Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet préventif du régime riche en fibres (High Fiber Diet – HFD) sur l'apparition de cancer, dans des conditions physiologiques normales, suite à une exposition à un carcinogène. L'ajout d'un anticorps bloquant les lymhocytes chez les animaux n'ayant pas développé de tumeur sera une preuve de concept de l'implication de l'immunosurveillance dans la prévention de l'apparition de tumeurs. La mesure de dihydrogène sera un argument supplémentaire pour expliquer cette immunosurveillance accrue suite au régime HFD.

Procédures

La moitié des animaux (92) suivra un régime High Fiber Diet (HFD) durant la totalité de la procédure, pendant que l'autre moitié aura un régime standard. Après 3 semaines de pré-conditionnement, chacune des 192 souris recevra une injection sous-cutanée de carcinogène, et leurs fécès seront prélevés une fois par mois. Durant les neufs mois suivant l'injection du cancérigène, maximum 20% des animaux (40) développeront une tumeur, puis de nouveau 20% (40) après l'injection de l'anticorps bloquant les lymphcytes. 24 animaux, n'ayant pas développé de tumeur, seront mis sous cloche pour mesurer le dihydrogène qu'ils produisent (2 séquences de 3 mesures d'1 à 4h par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances au bien-être animal apportées par ces expérimentations seront visibles par des caractères physiques (manque de toilettage, poil ébouriffé, écoulement nasal/oculaire posture prostrée), comportementaux, (mobilité réduite, vocalisations), ainsi que par la perte de poids. Les animaux pourront aussi déveloper des nécroses au site d'injection du carcinogène et seront manipulés pour les collectes de fécès. Dans la cloche pour la mesure de dihydrogène, les animaux n'auront pas d'accès à l'abreuvement et à l'alimentation pour la durée de la mesure.

Devenir

Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements.

Remplacement

Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu’in vivo. En effet les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l’hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n’existe donc pas d’alternative à ce jour.

Réduction

Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse à l'agent carcinogène d'une part (20% des animaux exposés développent une tumeur) et au régime HFD d'autre part, ainsi que des aléas dus au maintien des animaux durant toute la durée de la croissance tumorale, deux groupes de 96 souris seront constitués, afin de s'assurer 18 à 20 animauxdéveloppant une tumeur dans le groupe contrôle in fine. Ainsi malgré la variabilité, ce nombre d’animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique.

Raffinement

Afin d'assurer le bien être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire n'est associé à aucune contrainte. L'injection de l'agent carcinogène n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés la première semaine suivant l'injection du carcinogène, puis 1 fois par semaine au minimum jusqu'à J70. Au delà, et ce jusuqu'au jour 250, les animaux seront cliniquement suivi au minimum 3 fois par semaine. Les animaux seront sacrifiés dès lors que la tumeur nécrose ou atteind la taille définie comme point limite. En plus des points limites liés à la tumeur, les animaux seront suivis pour évaluer l’apparition de stress/douleur liés à l’expérience selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, perte de poids).

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d’étude. La manipulation de leur flore est acquis. De plus, les modèles tumoraux et d’immunothérapie, ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développer pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique scientifique l'ont été avec ces mêmes souris. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d’âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées, et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues hyperthyroïdiennes par leur eau de boisson pendant dix-huit semaines, elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau puis neuf injections de chimiothérapie, pour mesurer l'effet des hormones thyroïdiennes sur l'efficacité du traitement. Le porteur indique que la chimiothérapie peut provoquer des diarrhées et du sang dans les selles, les manipulations se faisant sur animal vigile. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que dans un "organisme complet" et juge l'animal "absolument nécessaire", les retombées pour les patients restant hypothétiques.

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des Hormones Thyroïdiennes (HT) sur la croissance de tumeurs chez la souris lorsqu’un traitement par chimiothérapie est mis en place. La chimiothérapie est l’un des traitements majeurs mis en place pour combattre le cancer. Elle vise à éliminer les cellules cancéreuses quel que soit l’endroit où elles se trouvent dans le corps. Nous savons par nos travaux antérieurs que les HT influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous souhaitons étudier maintenant si ce taux d’HT influe également sur l’efficacité de la chimiothérapie. Pour cela, nous utiliserons des souris hyperthyroïdiennes (avec un niveau d’HT plus élevé que la normale) auxquelles nous grefferont des cellules cancéreuses. Une fois que les tumeurs se seront développées, ces souris recevront une chimiothérapie. Nous pourrons alors étudier l’impact des HT sur le développement des tumeurs et estimer si les HT ont un impact sur l’efficacité de la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Des patients atteints de cancers colorectaux se retrouvent dans une situation d’hyperthyroïdie. Nous savons qu’il existe un lien entre les HT et le développent tumoral. SI cet effet est caractérisé et mieux compris, les traitements pourront être mieux adaptés pour les patients.

Procédures

Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 18 semaines. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure. Cette hyperthyroïdie induit des modifications physiologiques légères, en particulier une tendance à une légère hyperthermie. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes. La chimiothérapie peut provoquer des effets secondaires comme des diarrhées et du sang dans les selles. Les manipulations se feront sur animal vigile.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but est de mener des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes) afin d'évaluer l'impact des hormones thyroïdiennes lors d'une chimiothérapie.

Remplacement

Un travail en amont a été réalisé in vitro sur les cellules cancéreuses utilisées dans ce projet. A présent, il s'agit d'étudier l'impact des hormones thyroïdiennes et leur effet sur un traitement de chimiothérapie. Pour cela, ces cellules cancéreuses doivent être implantées dans un organisme afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles les tumeurs se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris, de par leur statut immunodéficient, seront hébergées en groupes sociaux dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux seront commandés chez un fournisseur et à leur arrivée au laboratoire, ils bénéficieront d’une période d’acclimatation pour leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Une habituation à la manipulation sera également réalisée après cette période d’acclimatation. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, taille des tumeurs) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Dans notre projet, l'étude de l'effet des hormones thyroïdiennes (HT) sur le développement de tumeurs cancéreuses et l’étude de l'impact de ces hormones lors d'un traitement de chimiothérapie ne peuvent se faire que dans des organismes complets. La culture sur cellules ne permet pas d'étudier la totalité des mécanismes ni d'évaluer l'efficacité d'un traitement et ses effets. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte.

231 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau, des prélèvements de sang dans la queue et des injections intraveineuses hebdomadaires, pour tester des anticorps modifiés censés dégrader leur cible à l'intérieur des cellules tumorales. La croissance de la tumeur peut provoquer une perte de mobilité et de poids, et les animaux sont tués pour prélever tumeurs et organes métastasés. Le porteur affirme que les tests sur cellules ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier" et conclut à la nécessité de recourir à la souris, les bénéfices pour les patients restant renvoyés au long terme.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier l’amélioration de l’efficacité des anticorps thérapeutiques, utilisés aujourd’hui dans le traitement de certains cancers, par des modifications. Actuellement, les traitements utilisant des anticorps permettent rarement la dégradation de leur cible. Le but ultime de cette étude est de rendre ces anticorps thérapeutiques (mAb) plus efficaces en les rendant capables de dégrader leur cible à l'intérieur des cellules. Pour ce faire, ces mAb sont modifiés leur permettant d'être internalisés dans la cellule. Ainsi, une fois la cible liée à l’anticorps modifié, le complexe est adressé vers l’intérieur de la cellule et une dégradation de la cible est attendue. Les premiers résultats des tests cellulaires de dégradation de la cible, avec des anticorps utilisés actuellement en clinique pour le traitement du cancer, se sont révélés encourageants avec une dégradation plus importante de la cible grâce aux mAb modifiés. Afin de pouvoir poursuivre le développement de ces nouveaux mAb, l’étude de l’efficacité sur l’animal est nécessaire. Des modèles murins présentant des greffes de cellules cancéreuses humaines seront utilisés afin d’évaluer l’amélioration du potentiel thérapeutique des anticorps modifiés.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de l’amélioration de l’efficacité des anticorps thérapeutiques, la technologie AMFA a pour but de rendre plus efficace les traitements en permettant la dégradation des cibles surexprimées dans le cadre de cancers et d’autres maladies telles que les maladies inflammatoires. Dans cette étude, une régression significative de la taille de la tumeur voire sa disparition est attendue pour les souris traitées avec le mAb-AMFA. Aussi, la survie des animaux traités avec le mAb-AMFA devrait être supérieure. A long terme, c’est un traitement moins contraignant et plus efficace qui pourra être proposé aux patients dans le cadre d’une immunothérapie anti-cancéreuse.

Procédures

Les animaux seront injectés, une seule fois, de cellules cancéreuses dans le tissu sous-cutané. L'intervention est estimée à 1 minute par animal. Les souris seront soumises à un prélèvement de sang dans la veine caudale avant le traitement et à 15 jours après le début du traitement. L'intervention est estimée à 3 minutes (contention + prélèvement). Les souris seront aussi injectées dans la veine caudale toutes les semaines soit 4 fois. La durée de l'intervention est estimée à 5 minutes (contention + pré-chauffage de la queue + injection) par animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de l’étude, il peut être attendu une perte de mobilité ainsi qu’une perte de poids chez les animaux xénogreffés, à cause de la croissance tumorale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de pouvoir récupérer les tumeurs et les organes présentant des métastases pour analyse.

Remplacement

Afin de limiter au maximum l’utilisation des animaux, des études aux résultats encourageants sur cellules cancéreuses ont préalablement été menées afin de tester l’efficacité du nouveau traitement proposé. Cependant, ces expérimentations ne prennent pas en considération la complexité de la physiologie d’un organisme entier. Pour confirmer le potentiel thérapeutique de cette approche et poursuivre le développement du traitement jusqu’à son application chez le patient, il est nécessaire de tester son efficacité chez l’animal dans le but de se rapprocher le plus possible de l’Homme.

Réduction

Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible tout en gardant des résultats exploitables, une recherche bibliographique a été réalisée afin de baser les tests statistiques de manière sérieuse pour chaque mAb. Ainsi, pour l’étude pilote, le nombre de souris correspond au nombre moyen d’animaux par groupe utilisés dans des études classiques. Concernant le nombre des animaux utilisés pour les mAb, il a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistiques et tout en tenant compte des effets de taille spécifiques à chaque mAb, d’après la recherche bibliographique. Aussi, la concentration des traitements administrés a été déterminée à la suite d’une recherche bibliographique pertinente pour chaque modèle afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

En plus des conditions réglementaires du bien-être animal, les animaux seront placés par 4 par cage afin de stimuler les contacts sociaux entre eux. Aussi, les animaux seront manipulés quotidiennement dès leur arrivée pour limiter le stress des animaux lors de l’expérimentation. Aucune douleur n’est attendue à la suite de l’injection des cellules tumorales. La croissance de la tumeur dans le cadre de notre étude sera contrôlée tous les cinq jours et limitée, afin de ne pas entrainer de douleur chez l’animal. Aussi, dans le but de limiter la souffrance animale et d’après une recherche bibliographique pertinente, seule concentration de chaque anticorps sera administrée à chaque animal. Les animaux seront quotidiennement surveillés selon une fiche de suivi clinique standard. Si des signes de douleur de l’animal sont perçus, les animaux seront sortis de l’étude. Pour faciliter la réhydratation des animaux après la greffe de la tumeur, de la nourriture gélifiée sera disponible ad libitum dans la cage.

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des BALB/c nude athymiques, des animaux immunodéprimés, pour éviter tout rejet de la greffe utilisant des cellules humaines. Ces modèles permettront d’apprécier l’efficacité unique des traitements appliqués. L’âge des souris utilisées dans cette étude est de 5 à 6 semaines, âge où les animaux sont sexuellement matures et adultes. C’est aussi à ces âges où l’on observe une meilleure prise de greffe ainsi qu’une forte homogénéité.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau, dans le pancréas ou dans le sang, provoquant tumeurs, ascite ou métastases pulmonaires, puis elles reçoivent des traitements, pour comparer la réponse selon la localisation de la tumeur. Le porteur décrit une possible altération de l'état général liée au cancer induit et aux effets des chimiothérapies. Il conclut que l'évaluation de traitements anticancéreux doit se faire sur un organisme vivant.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer l’efficacité antitumorale d’une association immunothérapie (anti-PD-1) et chimiothérapies utilisées en clinique dans des modèles de cancers du pancréas avec différentes localisations (sites d’injections différents) chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourront 1) évaluer l’efficacité des traitements selon la localisation et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement et de la localisation du cancer. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En France, en 2018, le cancer du pancréas était le 9e cancer le plus fréquent chez l’homme et le 7e cancer le plus fréquent chez la femme. Le pronostic de ce cancer, souvent diagnostiqué tardivement, reste sombre, expliquant que la mortalité ne baisse pas. A tel point que l’adénocarcinome pancréatique pourrait devenir la seconde cause de mortalité par cancer dans les années 2030-2040. L’un des critères d’agressivité de ce cancer est sa capacité à former des métastases dans d’autres organes, comme le foie ou le poumon. Actuellement, le traitement de ce cancer repose sur l’utilisation de chimiothérapies qui sont malheureusement peu efficaces, car souvent administrées tardivement, notamment lorsque le cancer a métastasé. L’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité anti-tumorale d’une association immunothérapie et chimiothérapies utilisées en clinique dans différents modèles de cancers du pancréas. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux traitements par chimiothérapie et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, jusqu’alors inefficace dans le cancer du pancréas.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules de cancer du pancréas murines : - 288 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection orthotopique de cellules de cancer du pancréas murines dans le pancréas : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Injection par voie intra-veineuse de cellules de cancer du pancréas murines : - 160 souris C57BL/6 et 144 souris BalbC/nude. - Traitements par voie intrapéritonéale : - 576 souris C57BL/6 et 432 souris BalbC/nude.

Impact sur les animaux

- Injection de cellules tumorales dans différentes localisations : - Sous-cutanée : masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. - Orthotopique : croissance d’une masse tumorale intra-abdominale monitorée par palpation abdominale. Possible dissémination de la maladie au niveau du péritoine avec apparition d’ascite. - Métastatique : croissance de métastases intra-pulmonaires, pas d’effet masse attendu. - Dans tous les cas : possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. -Éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux : les chimiothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherche clinique sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. -Concernant le modèle orthotopique, possible complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice : infection, lâchage de suture, douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Certains seront autopsiés (modèles orthotopique et intra-veineux).

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

- Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus une étape de faisabilité pour évaluer la pertinence des modèles sera réalisée en début de projet. Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés sur la localisation des tumeurs ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné à l’étape de faisabilité (partie I). Si aucun effet bénéfique des composés seuls ou en association sur la réponse anti-tumorale (croissance et infiltrats immunitaires) n’est observé, l’étude sera arrêtée à l’étape II. En choisissant de transposer uniquement le ou les modèles ayant le mieux répondu aux combinaisons de traitements en partie II, dans les souris Balb/nude, nous réduirons également le nombre de souris utilisées pour cette lignée. Enfin pour les modèles orthotopiques et intra-veineux les expériences visant à étudier la taille des tumeurs et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe. Elle sera entretenue pour la greffe orthotopique, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte et surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (Ketoprofen 4mg/kg) seront administrés en sous-cutanée en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongé pendant 48h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4mg/kg + bupivacaine 2mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidienne pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur à arrêt des traitements à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - absence de toilettage à arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité à si persistance au-delà de 24h, sacrifice de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures à sacrifice de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - palpation d’une masse abdominale localisée dans la zone du pancréas et entrainant une gêne ou une douleur ; - envahissement du péritoine de la souris conduisant à un une carcinose péritonéale ou la formation d’ascite et ainsi un gonflement de l’abdomen ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité ou de résultats, conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Des souris génétiquement modifiées seront également utilisées afin de montrer l’importance du système immunitaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées d'un cancer des voies biliaires, elles reçoivent des injections hebdomadaires de traitement pendant quatre semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, avec un développement tumoral pouvant entraîner nécrose et perte de poids. Le porteur met à mort les animaux après la dernière imagerie pour prélever la tumeur. Il affirme que la complexité du développement tumoral ne peut être étudiée sur cellules en culture et qu'il est "primordial" de tester l'anticorps sur des souris greffées de cellules humaines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de permettre une meilleure compréhension de la pathogenèse du cancer des voies biliaires et l’évaluation in vivo de l’efficacité d’un nouveau candidat médicament.

Bénéfices attendus

Réduction de la pousse tumorale avec le nouveau candidat medicament observée en imagerie l'aide de traceurs pertinents.

Procédures

Les souris recevront le traitement soit par injection au niveau de la paroi abdominale (éveillé, 4 injections, durée 20 secondes chacune) soit par voie intraveineuse (anesthésie , 4 injections, durée 1 minute) une fois par semaine pendant 4 semaines. Les souris seront soumises à séances d'imagerie (10 minutes chacune) à raison d'une par semaine pendant 4 semaines. Ces séances sont réalisées sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances susceptibles de survenir sont : - développement tumoral et apparition de nécrose tumorale - perte de poids de l'animal - hématome au niveau du site d'injection du radio-traceur qui disparait spontanément en 3 jours. - des nécroses au point d’injection du traitement au niveau de la paroi abdominale,

Devenir

A la fin de la procédure, c’est-à-dire après la dernière séance d’imagerie, les animaux seront mis à mort et la tumeur prélevée post mortem pour des études complémentaires (histologie, biochimie) qui viendront compléter les résultats obtenus in vivo.

Remplacement

Notre étude vise à montrer l'efficacité d'un anticorps dans le le carcinome hépatique. La complexité du développement tumoral (circulation sanguine, environnement tumoral) ne pouvant être étudié uniquement sur des cellules en culture, il est primordial de tester cet anticorps sur des modèles animaux greffés avec des cellules tumorales humaines.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe a été calculé afin d’inclure le minimum d’animaux pour pourvoir réaliser des tests statistiques sur les résultats obtenus. L’utilisation de l’imagerie lors d’études longitudinales permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux lors des études. De plus, le prélèvement post mortem de la tumeur pour des études complémentaires permet de compléter les informations obtenues dans l’étude sans augmenter le nombre d’animaux. Un test statistique sera utilisé pour analyser les effets d’un nouveau traitement par anticorps sur la croissance tumorale entre les différents groupes d'animaux.

Raffinement

L’environnement des animaux est enrichi (tunnel, carré de coton déchiquetable pour maintenir une activité locomotrice), les animaux sont placés à plusieurs par cage pour respecter les interactions sociales. Les souris greffées auront un suivi quotidien réalisé par du personnel préalablement formé et à l’aide d’une grille d’observation adaptée afin d’éviter toute souffrance liée au développement des tumeurs et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs lors des procédures. Les examens sont réalisées sous anesthésie gazeuse et lors des séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée avec un suivi en direct de la fréquence respiratoire et de la température corporelle afin de déceler tout signe précoce de mal-être (hypothermie par exemple). Un gel ophtalmique ainsi qu’une injection sous-cutanée de sérum physiologique à température corporelle seront administrés à l’animal juste avant le début de la séance d’imagerie.

Choix des espèces

En raison de l'absence d'une partie de son système immunitaire, les cellules tumorales injectées à cette souche particulière de souris vont pouvoir se développer et former une tumeur. Les animaux seront greffés à un âge allant de 6 à 8 semaines, âge optimal pour la prise tumorale .

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes, elles reçoivent en intraveineuse des cellules de cholangiocarcinome humain puis jusqu'à treize injections d'un anticorps, les métastases pulmonaires attendues induisant une détresse respiratoire et une dégradation de leur état. Le porteur indique mettre à mort les animaux pour prélever des organes à des fins d'analyse. Il affirme que son approche "nécessite" une validation sur "animal entier" avant toute transposition chez l'humain.

Objectifs

Le cancer du foie est la 3ème cause de mort par cancer dans le monde et le cholangiocarcinome (CCA) est le 2ème cancer primaire du foie le plus fréquent. Ce cancer des voies biliaires est une forme de cancer hautement métastatique, de mauvais pronostic et avec une incidence croissante. La résection chirurgicale est le seul traitement curatif bien que seuls 30 % des patients y sont éligibles et que les récidives après la chirurgie sont fréquentes. Cependant, la maladie étant asymptomatique en stade précoce, la grande majorité des patients atteints de CCA sont diagnostiqués à un stade avancé et/ou métastatique. Les poumons, le foie ainsi que les os sont les sites préférentiels métastatiques. Pour ces patients, les options thérapeutiques sont limitées aux chimiothérapies et soins palliatifs, des traitements insatisfaisants avec une efficacité limitée et de nombreux effets secondaires. Ainsi, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer l’état de santé de ces patients. Dans ce contexte, l’utilisation de modèles précliniques in vivo représente une approche cliniquement pertinente permettant de récapituler les métastases ainsi que d’évaluer le potentiel anti-métastatique de nouvelles thérapies. Dans notre laboratoire, nous avons développé un anticorps dirigé contre une protéine de la membrane des cellules. Il a été démontré que cette protéine est impliquée dans le développement du cancer, la croissance tumorale, ainsi que dans les processus d’invasion et de dissémination des cellules tumorales. Ainsi, cette protéine dans les CCA entraîne l’aggravation de la maladie par une progression tumorale rapide. Par conséquent, cette thérapie ciblée contre cette protéine apparait comme une solution pour le traitement du CCA, notamment pour les formes métastatiques. Afin d’évaluer l’effet de cet anticorps, l’utilisation de modèles animaux se révèle donc cliniquement pertinente et nécessaire.

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer l’efficacité de notre anticorps sur la dissémination des cellules tumorales, ainsi que sur la formation et le traitement de métastases dans les cas de CCA. Cette approche thérapeutique innovante pourrait permettre le développement clinique de notre anticorps afin de bénéficier aux patients sans options thérapeutiques satisfaisantes.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux recevront une injection intraveineuse de cellules cancéreuses humaines, réalisée sous anesthésie générale gazeuse. La moitié des animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anticorps avant l’injection des cellules cancéreuses, puis 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum, soit 13 injections maximum. L’autre moitié des animaux recevront d’abord une injection de cellules cancéreuses puis l’anticorps sera injecté en intrapéritonéal 2 fois par semaine pendant 5 semaines maximum, soit 10 injections maximum. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles. Les injections intraveineuses et intrapéritonéales prennent moins d’une minute à être réalisées.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont imputables aux cellules tumorales injectées qui vont former des métastases, notamment au niveau des poumons. Ces métastases vont de fait induire une détresse respiratoire et une dégradation de l’état de santé des animaux.

Devenir

Les animaux en expérimentation seront mis à mort afin de récupérer certains organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Notre approche thérapeutique nécessite une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’activité notre anticorps. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée à priori grâce à un logiciel d’analyse statistique. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort (gel ophtalmique évitant la sécheresse des yeux) sont appliquées lors de l’injection des cellules cancéreuses. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation approfondie est réalisée 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont des modèles reconnus dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines formant des métastases afin de tester rapidement la pertinence d’une approche thérapeutique. La souche utilisée permet une prise de greffe efficace des cellules humaines et le développement de métastases. Les animaux seront utilisés à un stade adulte de 8 à 10 semaines. Les adultes devraient mieux supporter les cellules tumorales métastatiques, notamment pulmonaires, de par leur développement plus avancé et leur plus grande capacité respiratoire.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules tumorales dans le pancréas durant jusqu'à une heure, un suivi par échographie sous anesthésie une à deux fois par semaine, puis un prélèvement de sang et de tumeur avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur fixe des points limites, une tumeur atteignant 2000 mm³ ou une perte de 20 % du poids déclenchant la mise à mort, sans que ces seuils soient forcément atteints. Le projet vise à mettre au point une technique de greffe présentée comme "plus prédictive" que la greffe sous la peau, et il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reconstitue la tumeur et son environnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe qui contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP) qui représente 90-95% des cancers du pancréas, se développe dans le compartiment exocrine et est très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les prévisions suggèrent que le nombre de cas d’ACP et de décès associés à ce cancer seront multipliés par 2 d’ici 2030. Cette augmentation est associée non seulement au vieillissement des populations, mais aussi à l’augmentation de la prévalence de l’obésité et du diabète dans le monde. Parmi les autres facteurs de risque pour ce cancer, on trouve le tabagisme, l’abus d’alcool et des prédispositions génétiques (

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre du cancer canalaire pancréatique sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme.

Procédures

-Puçage : un dispositif sous cutané est implanté à chaque animal quelques jours avant l’étude par trocart afin d’être identifié -Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera de 30 min à 1 heure et sera réalisée une seule fois sur chaque animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée etc). -Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite à la chirurgie (7 à 10 j), à raison de 1-2 mesures échographiques par semaine (8 semaines maximum). La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris. -Prélèvement de sang en fin d'étude, sur animal anesthésié et sans réveil consécutif, par ponction à la veine cave ou par ponction cardiaque. -Prélèvement terminal de tumeur : pour tous les animaux en fin d’étude, la tumeur sera prélevée sur les animaux préalablement profondément anesthésiés à l’Isoflurane et euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Tumeur pancréatique limitée à 2000 mm3 ; perte de poids limitée à 20% du poids maximal ; Signes cliniques rares : Abdomen gonflé ou apparition de métastases.

Devenir

Lorsque le volume tumoral est proche de 2000 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et/ou d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…).

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, permettant ainsi de se placer dans des conditions le plus proche possible de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

-Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie. -Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. -Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. -La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : odes espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie oune anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie oune asepsie maintenue pendant toute la chirurgie -L’analgésie péri-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. -Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 à 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 2000 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. -Une palpation de l’abdomen est faite 2 à 3 fois par semaine pour suivre la progression de la tumeur. Elle est faite le jour du suivi échographique pour corréler la palpation à la mesure du volume tumoral, puis entre chaque mesure échographique. Cette palpation permet aussi de détecter un gonflement de l’abdomen en cas d’apparition d’ascite.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur chaque flanc, des injections et des prélèvements sanguins répétés au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant une mise à mort pour analyser la tumeur, le sang et la rate. Le porteur indique que les tumeurs peuvent s'ulcérer et fixe ce point comme limite, et utilise des souris immunodéprimées pour qu'elles acceptent les cellules humaines. Le bénéfice attendu se réduit à une "preuve de concept" d'un système de globules blancs modifiés, et il affirme qu'on ne peut s'affranchir du modèle murin.

Objectifs

Les cancers représentent un problème de santé publique majeur causant environ 10 millions de décès par an. Les traitements disponibles présentent de nombreux effets secondaires et nécessitent souvent de multiples interventions, d’où la nécessité de nouvelles alternatives thérapeutiques plus efficaces, plus spécifiques, voir ciblées, et ce, sur le long terme. L'un des principaux problèmes expliquant la progression du cancer est l'incapacité du système immunitaire à éliminer les cellules tumorales, car l’environnement tumorale diminue les fonctions des cellules immunitaires. Récemment, des stratégies d'immunothérapie modulant le système immunitaire du patient pour augmenter son efficacité ont suscitées un fort intérêt. L’objectif du projet est d’améliorer le système immunitaire du patient, en modifiant un sous type de globules blancs, afin qu’il discrimine et détruise spécifiquement les cellules cancéreuses. Une protéine sera ajoutée à la surface des globules blancs pour détecter des marqueurs tumoraux et cette détection conduira à la sécrétion localement des molécules médicaments par le globule blanc modifié. L'objectif de ce système est donc d'apporter une solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers en : 1) éliminant les cellules tumorales, 2) favorisant les réponses immunitaires anti-tumorales, et enfin 3) prévenant les rechutes grâce à la persistance des globules blancs modifiés et à leur réactivation en cas de nouvelles poussées de la maladie.

Bénéfices attendus

L’observation d’une diminution de la croissance tumorale dans notre projet, nous permettra d’obtenir une preuve de concept de notre circuit synthétique comme solution thérapeutique durable et spécifique aux cancers.

Procédures

- Greffe sous anesthésie : Injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines sur chaque flanc (15 min/animaux). - Co injection de lymphocytes B et T par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie (2 min maximum en prenant en compte l'anesthésie et l'injection, le réveil est quasi immédiat) - Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital sous anesthésie locale, toutes les deux semaines en prenant soin d’alterner l’œil prélevé (moins d'1 minute). -Injection IP (moins d'1 minute en prenant en compte la contention et l'injection). Pendant 3 semaines 1 fois par semaine -Prélèvement sanguin au sinus rétro orbital, 1 fois sous anesthésie générale (moins d'1 minute). - Les animaux seront pesés une fois par semaine (environ 1 minute) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure. - Les tumeurs seront mesurées au pied à coulisse 2 fois par semaine (environ 2 minutes) pendant 30 ou 40 jours en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Suite à la greffe de cellules tumorales en sous cutanée, une tumeur va se développer et peut induire des distensions et ulcérations des tissus cutanées. Dans notre cas les durées d’expérimentation ne sont pas suffisamment longues pour permettre l’installation de distension des tissus, le point limite le plus critique est l’apparition d’ulcération des tissus cutanés qui peuvent apparaître chez certains animaux avant la fin de l’expérimentation. Le phénotype des animaux est non dommageable car ils sont élevés dans les conditions appropriées (conditions d’hébergement et d’expériences). Aucune douleur n’est attendue suite aux injections et prélèvements en ip et en iv sous anesthésie gazeuse et locale. De même, la pesée et la mesure des tumeurs ne devraient pas générer de douleur.

Devenir

A l'issue des procédure 1 à 3, les animaux seront mis à mort afin d'évaluer l'efficacité anti tumorale des cellules B modifiées en analysant la croissance tumorale ainsi que l’état d’activation du système immunitaire (cellules, cytokines, anticorps) dans le sang, la rate et la tumeur seront suivies.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro. Cependant, on ne peut pas s’affranchir du modèle murin. Après leur injection dans le sang, les cellules B modifiées, migrent efficacement et gagnent les organes périphériques secondaires où s’effectueront les étapes de maturation dépendantes de l’antigène : ganglions lymphatiques, rate... L’architecture et l’interaction avec d’autres composants cellulaires, au niveau du centre germinatif de ces organes, vont permettre leur prolifération et leur différenciation en cellules productrices d’anticorps et en cellules mémoires. C’est alors in vivo que nous pourrons observer d’une part la circulation et l’activation de nos cellules B modifiées et par la suite l’effet anti tumoral de ces cellules.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe a été défini après discussion avec des statisticiens, ainsi que sur la littérature scientifique pour estimer les effets attendus et a été réduit au minimum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. La greffe des différentes cellules tumorales sur une même souris a permis de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe (n=8) a été déterminé en prenant en compte le pourcentage de prise de greffe (80%).

Raffinement

Les manipulations des souris NSG immunodéficientes seront effectuées sous un poste de sécurité microbiologique de type II, ce qui leur permettent d’être dans un environnement complétement stérile garantissant ainsi un phénotype non dommageable. Tout au long des expériences, nous veillerons au bien-être des animaux, à réduire au maximum la souffrance et l'angoisse des souris grâce à la mise en place d’une grille de score clinique. Une période d’une semaine d’acclimatation sera mise en place avant le début du protocole et les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Si un animal venait à se retrouver seul, une maisonnette en carton sera mise en place dans la cage. La greffe des cellules tumorales ainsi que le suivi de la bioluminescence seront réalisées sous anesthésie isoflurane afin d’éviter toute méthode de contention prolongée. La Co-injection des cellules B reprogrammées et des lymphocytes T CD4+ par voie intraveineuse au sinus retro-orbitale sous anesthésie isoflurane avec au préalable une anesthésie locale. Les prélèvements sanguins au sinus rétro orbital seront effectués sous anesthésie locale. Un prélèvement de sang total sera réalisé à la fin de l’expérimentation, sous anesthésie profonde au sinus retro-orbital ou intra cardiaque.

Choix des espèces

La souris NSG (NOD SCID-/- gammaC-/-) (absence de lymphocytes B, T et NK) a été choisie pour son immunodéficience sévère permettant la xénogreffe de cellules humaines. D’après notre expérience les souris NSG âgées d’environ 6 semaines permettent une meilleure prise de greffe.