Cancers

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).

Impact sur les animaux

Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.

3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.

Objectifs

Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.

Bénéfices attendus

Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).

Procédures

Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)

Impact sur les animaux

Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.

Remplacement

La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.

Réduction

En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p

Raffinement

Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.

Choix des espèces

Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.

16 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit trois anesthésies profondes de deux heures et six prélèvements de sang sous anesthésie légère, pour évaluer la tolérance et la pharmacocinétique d'anticorps polyclonaux avant des études de toxicité réglementaires. Tous sont tués en fin de protocole pour un prélèvement de plusieurs organes. Le porteur revendique le macaque comme "l'espèce la plus représentative de l'homme" et affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la pharmacocinétique d'un "organisme entier".

Objectifs

Notre société développe des anticorps polyclonaux glyco-humanisés. Deux d’entre eux sont en développement clinique de phase 2 et 3 en transplantation et dans la COVID-19. La bonne tolérance des anticorps polyclonaux glyco-humanisés chez l’homme a été démontrée et publiée. Deux autres anticorps polyclonaux glyco-humanisés dans le domaine de la cancérologie ont démontré leur efficacité dans des modèles murins précliniques. Des études de toxicité réglementaire GLP sont requises chez le primate non humain par les recommandations ICH (EMA/CHMP/ICH/646107/2008). En préalable à ces études et dans un souci de réduction du nombre d’animaux à inclure, il est nécessaire de valider l’innocuité d’une dose équivalente à la dose thérapeutique visée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués afin d’effectuer un bilan cardiaque/musculaire, hépatique/pancréatique, inflammatoire. Les animaux seront observés quotidiennement et soumis à une grille d’observation comportementale, afin d’obtenir un bilan cognitif primaire. Les prélèvements sanguins seront aussi utilisés pour déterminer la pharmacocinétique du produit, conformément aux recommandations ICH. Cette étude préliminaire permettra de valider la bonne tolérance de la dose présumée, de mettre au jour d’éventuels points d’alerte qui permettront de prévoir une surveillance accrue et plus exhaustive de ces paramètres, et de limiter l’étude de toxicité réglementaire à un simple groupe à cette dose.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider la tolérabilité d’une dose thérapeutique

Procédures

3 anesthésies profondes par animal (2h) avec prélèvements (2 anesthésies lors de l’administration du produit thérapeutique et la 3ème pour l’euthanasie), et 6 prélèvements sanguins sous anesthésie légère (15 min)

Impact sur les animaux

Les anesthésies profondes de 2h ainsi que les prélèvements de sang multiples sous anesthésie légère peuvent occasioner de l'inconfort, de la confusion et du stress pour les animaux au moment du réveil, pour autant elles permettent de diminuer ces effets d'inconfort, de confusion et de stress pendant les procédures, les rendant ainsi le moins traumatisantes possible pour les animaux par rapport à ces même procédures qui seraient effectuées sur animaux vigiles.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort, sous procédure complète d'anesthésie, en fin de protocole de gravité modérée pour prélèvement multi-organes post-mortem.

Remplacement

Cette autorisation de projet a pour objectif de valider la dose thérapeutique ciblée pour les anticorps polyclonaux XON, de manière à optimiser l’étude de toxicité réglementaire nécessaire à la constitution du dossier de demande d’autorisation d’essai clinique. Les études pré-cliniques réalisées montrent que le macaque est l’espèce la plus représentative de l’homme pour l’évaluation de la toxicologie de XON car la cross-réactivité cellulaire (TCR) est comparable. Ce genre d’étude nécessite l’évaluation au niveau des différents systèmes et appareils d’un organisme entier. A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la pharmacocinétique de nouveaux composés thérapeutiques permettant de remplacer l’utilisation d’animaux.

Réduction

Pour chaque dose, le nombre d’animaux est réduit à son minimum soit 2 par dose, en raison de la variabilité interindividuelle, plus 1 animal par contrôle. De plus, chaque étude est divisée en 2 parties. Dans la partie 1 seule l’équivalent de la dose thérapeutique ciblée chez l’homme sera administrée. La dose forte ne sera pas admninistrée si une des précédentes doses à provoquer des effets indésirables graves

Raffinement

-De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale. Un traitement analgésique leur sera donné si nécessaire en fonction de la procédure. -Les anesthésies et traitements analgésiques donnés aux animaux sont adaptés selon les procédures. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des expérimentations et consiste en un examen clinique de l’animal selon une grille de signes notables, signes sévères et un arbre décisionnel. -Si des effets indésirables apparaissent dès la première injection, la seconde injection ne sera pas réalisée. -Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur mode de vie en communauté, puis, au cours du protocole expérimental les individus sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. -Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement du milieu par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Le primate non humain, et plus particulièrement ici le macaque, représente une espèce animale de choix comme modèle animal pré-clinique, car proche de l’homme de par son anatomie et physiologie, son métabolisme, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. Seuls les PNH ont montré une cross-réactivité suffisante dans des expériences in vitro, en comparaison avec d’autres espèces (rongeurs, lagomorphes,…), et par rapport aux cibles humaines, cibles des anticorps thérapeutiques XON. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 8Kg) dont le système immunitaire est mature.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du pancréas sous anesthésie, puis des gavages et des injections dans le ventre deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester une association de chimiothérapie et d'un inhibiteur de réparation de l'ADN. La tumeur est laissée croître jusqu'à un volume de 1 500 mm³, seuil déclenchant la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable dû au traitement" et conclut qu'aucune méthode alternative ne remplace ces expériences de preuve de concept in vivo.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de therapies sont proposées, seulement la gemcitabine et deux combinaisons de chimiothérapie (FOLFIRINOX et Gemcitabine/Nabpaclitaxel) sont disponibles. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie (présence d’un microenvironnement très dense) ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de surive des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement, dont des inhibiteurs de la réparation de l’ADN suite à des cassures induites par la chimiotherapie. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti tumorale de l’association du FOLFIRINOX, à un inhibiteur de réparation de l’ADN dans des modèles de co-culture cellules tumorales pancréatique et cellules du micro environement. L’efficacité de cette association est étudiée in vitro lors de test de viabilité et confirmé in vivo sur différents modèles de souris avec ou sans système immunitaire. Les mécanismes impliquées dans cette réponse anti-tumorale sont étudiées au niveau de la mort cellulaire, du dialogue (protéines) entre les différents types cellulaires et des cellules immunitaires. Ce projet, qui est important pour le devenir des patients atteints de cancer du pancréas, est réalisé en collaboration avec les services cliniques de l’ICM notamment la chirurgie et l’anatomopathologie

Bénéfices attendus

Nous avons déjà démontré in vitro l’efficacité de l’association du FOLFIRINOX avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN (ATR) dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Il s’agit maintenant de démontrer cette synergie dans 2 modèles de souris nudes xénogreffées chacun avec une tumeur de cancer pancréatique issues de tumeur de patient (PDX : Patient-Derived Tumor Xenografts) et 2 modèles de souris immuno compétentes greffées avec une tumeur murine pancréatique, ces derniers modèles permettront de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie générale courte pour la procédure chirurgicale de greffe de PDX (15 minutes maximum / souris). Les traitements à raison de deux fois par semaine sur 4 semaines seront des injections intrapéritonéales ( 5 secondes/ injection/souris, contention comprise) et des gavages (10 secondes/gavage/souris, contention comprise). Les prélévements seront uniquement des prélèvement terminaux sur animaux eutanashiés.

Impact sur les animaux

De nombreuses études ayant déjà été élaborés dans notre institut et dans d'autres, nous maitrisons les doses administrées aux animaux et de ce fait n'attendons aucun effet indésirable dû au traitement. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.

Devenir

Les animaux en sortie de procédure 1 seront directement intégrées dans la procédure 2. A l'issue de celle ci les niamaux seront euthanasié et les tumeurs seront récupéré pour des tests d'immunohistochimie, immunophénotypage et western blot.

Remplacement

Ces associations de drogues ont montré une efficacité in vitro. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Des modèles précliniques sur souris immunodéprimées et compétentes sont impératifs pour valider l’efficacité de nos traitements, ceci afin d’envisager la translation vers la recherche clinique.

Réduction

D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux. L’analyse statistique sera réalisée avec une Unité de Biométrie. L’étude de l’effet des traitements sur la croissance tumorale permettra de faire deux types d’analyse. 1 : Modélisation de la croissance tumorale et comparaison entre les groupes en utilisant un modèle linéaire mixte. 2 : Analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre une taille de tumeur de 1500 mm3. Le point limite est donc une taille de tumeur de 1500 mm3. Les courbes de survie seront ensuite estimées par la méthode de KaplanMeier et comparées par le test du logrank. Pour confirmer le nombre de souris nécessaire, nous avons calculé la puissance statistique en utilisant le logiciel STATA 13. La puissance a été vérifiée en se fondant sur des hypothèses posées à partir de résultats in vivo et selon une des méthodes proposées par Frison et Pocock (1992) qui considère des résultats de mesures continues répétées. Sous les hypothèses alpha:0,05, delta:1,5 (à J17:moyenne du groupe contrôle attendu ~17 et moyenne du groupe traite attendu ~15,5), écart type : 1,6, la prise en compte de 8 mesures répétées, une corrélation de 0,5 entre ces mesures, et une taille d'échantillon égale a 10 pour chaque groupe, la puissance statistique estimée est de 80%.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée dans des conditions

Choix des espèces

Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés , et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymic nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétente gréffées avec une tumeur murine. Age 5 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe, et suffisamment âgées pour permettre une récupération dans les meilleures conditions après la greffe.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intraveineuses de traceurs radioactifs sous anesthésie, suivies d'imagerie et d'un prélèvement sanguin terminal, pour tester des peptides de ciblage du cancer de la prostate. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grâce à l'imagerie non invasive. Il indique recourir à des cultures cellulaires tant que possible et réserver la souris aux expériences in vivo.

Objectifs

Les tumeurs peuvent co-exprimer différents récepteurs, cibles de nouvelles stratégies de détection et traitements tumoral. Des peptides à deux parties distinctes peuvent se lier à ces différents récepteurs et présenter des avantages (meilleure affinité, rester plus longtemps sur la tumeur, augmenter les chances de visualiser le tissu malade indépendamment du stade de la maladie) par rapport à des peptides simples. Ainsi ce projet vise à étudier les propriétés de ciblage tumoral de ces nouveaux peptides, marqués par de la radioactivité, pour leur utilisation en imagerie et thérapie nucléaires.

Bénéfices attendus

Un peptide à deux parties, ciblant à la fois le récepteur de la gastrine (GRPR) et le récepteur membranaire spécifique de la prostate (PSMA) pourrait permettre de détecter puis de traiter une très large gamme de profils d'expression du cancer de la prostate (y compris les tumeurs PSMA négatives ou GRPR négatives) quel que soit le stade de développement de la maladie.

Procédures

Les animaux du projet seront soumis à différents actes, en premier lieu acte 1 des greffes de cellules tumorales au niveau sous cutanée réalisées sous anesthésie qui vont permettre une croissance tumorale pendant 7 à 8 semaines au cours desquelles tous les animaux recevront sous anesthésie des injections intraveineuses de radiotraceurs qui permettront un suivi des tumeurs par imagerie non invasive TEP/TDM et enfin suite à la dernière imagerie un prélèvement sanguin sous anesthésie sera réalisé suivi d'une euthanasie par une méthode réglementaire. L'acte 2 s'étalera au maximum sur 3 semaines. L'acte 3 aura lieu environ entre 7 et 8 semaines après l'acte 1 de greffe tumorale soit lorsque les souris auront entre 12 et 14 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir d'effets indésirables attendus sur les animaux. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour des prélèvements post mortem.

Remplacement

Des cellules de cancer de la prostate en culture seront utilisées tant que les expériences le permettent et le modèle de souris de xénogreffe tumorale pour les expériences nécessaires in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux, 160 au total, sera limité au maximum par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Le nombre d'animaux a également été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive pour suivre des modèles in vivo uniques parfaitement décris dans la littérature (modèle de greffe sous-cutanée de cancer de la prostate).

Raffinement

Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maison de type igloo en plastique) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Pour chaque procédure, des points limites ont été fixés et des méthodes prévues (anesthésie) pour éviter toute souffrance ou douleur aux animaux, qui resteront sous surveillance tout au long du projet.

Choix des espèces

Des souris immunodéprimées sont utilisées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.

3 328 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes puis leur greffe, pour chaque patient, ses cellules immunitaires et sa tumeur, afin de constituer des cohortes dites "avatars" servant à tester des traitements. Il indique que l'injection de cellules humaines provoque invariablement une réaction contre les cellules de la souris, avec perte de poids, de poils et de mobilité sur un à deux mois, les animaux étant mis à mort à un stade avancé pour récupérer les tumeurs. Sur la réduction, il se contente d'écrire que le nombre d'animaux "sera à évaluer au cours des expériences", justification sommaire pour un effectif de plus de trois mille souris.

Objectifs

Il est proposé d’utiliser un modèle de souris immunodéficiente afin de constituer, pour chaque patient atteint d’une tumeur, une cohorte de souris doublement humanisée/greffée (système immunitaire et tumeur) qui sera utilisée pour évaluer l’activité de thérapies, dans un délai compatible avec les contraintes cliniques, typiquement 1 mois. Les souris présentent des mutations entrainant une déficience en cellules immunitaires murines. Ces souris ont montré être des bons modèles de greffe de cellules tumorales humaines ainsi qu’un bon réservoir pour une reconstitution de système immunitaire humain. La mise en place d’une cohorte de souris porteuse de tumeur dérivée de patient (PDX) est un projet ambitieux à forte valeur ajoutée pour la recherche sur les cancers permettant d’évaluer l’activité des traitements les ciblant. Ces souris sont greffées avec des fragments de tumeur fraiche et la tumeur peut se développer dans l’environnement murin en absence de système immunitaire pouvant le reconnaitre comme étranger. Cependant, des obstacles sont présents pour optimiser l’établissement de cette cohorte : taux de prise de greffe des PDX très faible et/ou variable, temps avant apparition de la PDX (plusieurs semaines, voire mois), instabilité génétique amplifiée au cours des passages successifs des PDX dans une souris à l’autre et absence d’un système immunitaire autologue. Afin de palier à ces obstacles, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) du patient ainsi que des fragments tumoraux, du même patient seront greffés, dans les souris sans passer par l’étape d’établissement d’une tumeur macroscopique de type PDX classique. La détection précoce de ces cellules, par les techniques d’imagerie, permettrait d’évaluer l’efficacité des traitements afin de comprendre notamment les mécanismes de résistance mais aussi d’évaluer le traitement le plus efficace parmi le choix possible actuellement et dans un futur proche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer la pertinence et la corrélation clinique des réponses aux traitements chez le patient au regard de de la réponse observable dans la cohorte avatar aux patients. En cas, de corrélation positive, cela permettre d’obtenir une preuve de concept de la pertinence d’une méthodologie comme outil de diagnostic afin de proposer aux cliniciens le traitement le plus adéquat pour chaque patient, dans des contraintes temporelles acceptables pour les cliniciens et les patients.

Procédures

Injection de thérapie deux à trois fois par semaine sur animaux vigiles ou endormis, chaque injection demande une contention de 15 à 30 secondes ; Echographie une à deux fois par semaine sur animaux endormis, le temps d'acquisition par échographie (et donc de l'anesthésie) est compris entre 10 et 20 min par souris ; Prélèvement de sang une fois au cours de la procédure sur animaux endormis, le prélévement dure entre 15 et 30 secondes (l'anesthésie environ 3 minutes). La durée pendant laquelle les animaux subiront ces interventions sera de 5 semaines à 2 mois.

Impact sur les animaux

L’injection de PBMC humain dans une souris immunodéficiente entraine, invariablement, une réaction des cellules immunitaires humaines injectées contre les cellules murines reconnues comme étant étrangères. Cette réaction entraine une perte de poids des animaux, une perte de poil et une perte de mobilité des animaux dans un délai pouvant aller d’un mois à deux mois. A un stade avancé de la maladie, les animaux doivent être sacrifiés. Aucun autre effet indésirable n’est attendu notamment par l’injection des traitements.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort car les tumeurs doivent être récupérées

Remplacement

Les méthodes actuelles permettant d’évaluer l’efficacité de thérapie personnalisé sont inefficaces, actuellement, par absence de biomarqueur fiable, permettant de choisir le traitement le plus adapté à chaque patient.

Réduction

Le nombre de souris par groupe de traitement est évalué, en fonction de la variabilité des modèles animaux. Ce nombre sera à évaluer au cours des expériences en fonction de cette variabilité.

Raffinement

Le raffinement de l’étude est : surveiller les animaux pour l’apparition de la réaction immunitaire des cellules immunitaires humaines injectées vis-à-vis des cellules murines de l’hôte qui sera monitoré deux fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont les seules modèles animaux correctement validés ayant montrés une prise de greffe de tumeurs humaines et de système immunitaire humain. Les animaux seront des adultes à partir de 6 semaines, stade qui a montré de bons résultats pour prise de greffe tumorale et immunitaire.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes et leur greffe des cellules tumorales marquées par fluorescence, par injection sous-cutanée ou intraveineuse, pour suivre la croissance des tumeurs et leur capacité à métastaser. Il indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements, que la peau peut s'ulcérer en provoquant une douleur modérée et que des métastases au foie ou aux poumons peuvent dégrader l'état des animaux, tous mis à mort en fin de procédure. Il affirme que ces cellules doivent être implantées dans un "organisme entier" et que le modèle souris est "nécessaire".

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences de suivi de pousse tumorale chez la souris immunodéficiente à partir de cellules cancéreuses modifiées pour qu'elles expriment plus ou moins une protéine au niveau de leur noyau. La quantité présente de cette protéine dans les cellules jouerait un rôle dans le comportement des cellules cancéreuses. Ces cellules cancéreuses seront également marquées par fluorescence en fonction de la quantité de la protéine exprimée. Ainsi cette fluorescence nous permettra de visualiser les différents types de cellules cancéreuse et d'observer leur évolution dans les tumeurs. Nous nous intéresserons à la corrélation entre le type de cellules retrouvées dans les tumeurs, la vitesse de croissance des tumeurs et l'agressivité des cellules cancéreuses à travers leur capacité à métastaser.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l'impact du niveau d’expression de TRa1 sur la croissance des tumeurs. Nous pourrons étudier si ce niveau d'expression module la capacité de croissance, de migration ou de mort cellulaire ainsi que l’agressivité du développement tumoral. A terme, une meilleure compréhension des mécanismes du développement des cancers permettra de mieux adapter les traitements et/ou d'envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris du projet seront greffées avec des cellules tumorales marquées par fluorescence, soit par injection ou implantation sous-cutanée soit par injection intra-veineuse. Ces greffes se dérouleront sous anesthésie, l'opération ne durant que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées. Ces animaux, par leur système immunitaire défaillant, sont hébergés dans une pièce dédiée avec toutes les barrières sanitaires permettant de garantir leur bon état de santé pendant toute la durée de leur vie. Les souris subiront chacune une unique injection ou implantation de cellules tumorales. Les souris seront donc amenées à développer des tumeurs. Ces tumeurs pourraient éventuellement les gêner dans leurs déplacements. Si la peau venait à s’ulcérer au niveau d’une tumeur, cela provoquerait une douleur modérée à l’animal. Des métastases pourraient également apparaître, notamment sur le foie ou dans les poumons. L’état des souris pourraient alors se dégrader : amaigrissement, difficultés à respirer, troubles moteurs… Il y a 3 types possible d’injection dans ce projet ; une injection sous-cutanée au niveau du flanc, une injection intra-veineuse à la veine de la queue et une implantation sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux, des souris, seront mis à mort en fin de procédure. En effet, ils développeront des tumeurs sur le flanc et potentiellement des métastases. De plus, des analyses doivent être menées sur plusieurs de leurs tissus afin d'étudier la distribution des différents types cellulaires dans les tumeurs et d'analyses les organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité de plusieurs types de cellules cancéreuses à former des tumeurs et à métastaser. Pour cela, ces cellules doivent être implantées dans un organisme entier afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles elles se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est de 90 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet. Nous mesurerons pour chaque animal engagé le nombre de tumeurs primaires et métastases ainsi que leur taille.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin d'identifier au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. De plus, les procédures se feront sous anesthésie générale. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant toute la durée de l'anesthésie. Une couverture analgésique est mise en place afin de prendre en charge toute douleur potentielle qu'impliquerait l'implantation des cellules tumorales. Un développement tumoral est attendu, un suivi de poids et de taille des tumeurs sera réalisé 3 fois par semaine. Des points limite qui auront pour effet l'arrêt de la procédure ont été déterminés.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (inflammation et cancer du côlon). Nous avons l'expertise au laboratoire sur ce modèle animal et nos données précédentes sur le rôle de TRa1 dans des études in vivo ont été générées chez la souris. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. En effet, dans notre projet, les études de pousse tumorale ne peuvent se faire que dans des organismes complets prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte jeune.