Cancers

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules cancéreuses en sous-cutané puis administre un traitement par voie intrapéritonéale chaque jour pendant vingt jours, pour étudier le rôle d'une enzyme dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Comme pour un projet voisin du même laboratoire, il indique que les souris sont maintenues sans antalgique afin de ne pas modifier la croissance tumorale, tout signe de souffrance entraînant la mise à mort. Il affirme que l'effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être évalué qu'in vivo et que le modèle murin est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme scd1 dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse et l’importance de cette enzyme dans la résistance à l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

L’inhibition de l’activité Scd1 a montré une efficacité contre la progression tumorale. Cependant, cette réponse demeure limitée et la recherche de thérapies combinées à une thérapie anti-Scd1 pourrait améliorer la réponse. Nous attendons une réactivation bénéfique du système immunitaire anti-tumorale avec une immunothérapie anti-PDL1 à la suite d’une thérapie anti-Scd1 conduisant à une régression tumorale complète.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 20 jours. Chaque contention et injection ne dureront pas plus de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections IP répétées peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation des cellules quant à elle, se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Les souris KO scd1 seront produites par le croisement de souris hétérozygotes scd1+/- sans phénotypes délétères pour les seules études expérimentales et ne seront jamais maintenues en colonies car elles présentent ont un phénotype délétère inflammatoire avec une adiposité réduite, une augmentation de la sensibilité à l’insuline et des lésions de la peau à un âge avancé. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront maintenues 20 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 180 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux Scd1 KO et WT requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

75 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales humaines leur sont greffées dans le cerveau, suivies d'un suivi par bioluminescence, de séances de radiothérapie et d'une injection sous ultrasons, les animaux présentant en fin de protocole des symptômes neurologiques. Le porteur indique tester une molécule, l'AsiDNA, contre des tumeurs cérébrales pédiatriques qu'il décrit comme incurables, et affirme qu'il faut évaluer in vivo le passage de la molécule dans un cerveau entier. Les retombées pour les enfants malades sont présentées comme un espoir à court terme.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes infiltrant de la ligne médiane (ou DMG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont inopérables en raison de leur nature infiltrante et de leur localisation profonde dans le tronc cérébral. Elles sont chimiorésistantes et la radiothérapie, traitement standard, n'est efficace que transitoirement. En cela, ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Les AsiDNA sont des molécules composées de courts ADN. Lors de l'absorption, les cellules perçoivent les AsiDNA comme un dommage à la cellule et déclenchent une activation aberrante des voies de signalisation de réparation à l'ADN. Ce large mécanisme d'action en fait un radio- et chimiosensibilisateur efficace dans un large éventail de tumeurs malignes, y compris les tumeurs cérébrales, telles que le glioblastome. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence un effet antitumoral des AsiDNA en combinaison à la radiothérapie dans nos modèles de xénogreffes de DMG. Dans une première étude cinétique et pharmacodynamique, nous confirmerons le passage de ces molécules à travers la barrière hémato-encéphélique (BHE) et l’effet potentialisant d’un système d’ouverture de la BHE par des ultrasons sur ce passage. Puis, dans le cas où le passage est suffisant pour atteindre la tumeur et provoqué une réponse dans celle-ci, nous évaluerons l’effet antitumoral des molécules sur un modèle de xénogreffes de DMG par un suivi longitudinal de la croissance tumorale couplée à une étude de survie. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules seront directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.

Bénéfices attendus

Les DMG sont des tumeurs pédiatriques universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour car aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par des AsiDNA est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie de ces enfants à court terme.

Procédures

Greffes intracérébrales stéréotaxiques sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 20 minutes, une fois. Suivis en bioluminescence sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 15 minutes: 1 à 3 fois. Irradiation de radiothérapie localisée à 4 kGy guidée par l'image (SARRP), sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 2 minutes, maximum 8 fois. Injection intranveineuse sous stimulation ultrasonique sous anesthésie générale, durée 15 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés avec des tumeurs directement en intracérébral. Bien que nous contrôlions la croissance tumorale, en fin de protocole, les animaux présenteront des symptômes neurologiques (principalement apathie) qui correspondront à la fin de la procédure et à l'arrêt de la procédure. Les doses de radiothérapie utilisées ici sont très bien tolérées chez l’animal et n’engendrent aucun effet secondaire. Les doses utilisées d’AsiDNA pour traiter les souris sont bien inférieures aux doses maximales tolérées. Les ultrasons à faibles intensités (stimulation ultrasonique) n'induisent aucun effet secondaire chez l'animal à court ou à long terme.

Devenir

Afin de pouvoir étudier les effets des traitements sur les tumeurs et le tissu cérébral, nous devrons mettre à mort l'animal afin d'étudier son cerveau.

Remplacement

L’efficacité des AsiDNA développées par la société Onxeo a été évaluée dans un 1er temps in vitro, avec un bénéfice supérieur lorqu’ils sont utilisés en combinaison avec de l’irradiation. Toutefois, il est reconnu que la BHE est un réel frein quant aux passages de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc nécessaire d’évaluer dans un contexte in vivo le passage et la pharmacodynamique des AsiDNA dans un cerveau vivant entier. De plus, pour le soutien du passage de la molécule vers un essai clinique humain, il est nécessaire d’avoir des données précliniques chez l’animal démontrant l’efficacité et la non toxicité des médicaments.

Réduction

Nos xénogreffes sont suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d'extrapoler le volume tumoral sans avoir besoin de sacrifier des animaux. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédures et de prévoir au plus tôt la souffrance des animaux. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogènes et reproductibles (100% de prise tumorale). Pour la procédure 1, nous utiliserons uniquement 3 animaux par conditions pour confirmer le passage de la molécule dans le tissu cérébral. Nous ne ferons pas statistiques sur cette partie. Pour la procédure 2, nous avons calculer le nombre optimum de souris afin d'avoir un résultat statistiquement fiable, soit l'utilisation de 60 souris pour 6 conditions différentes testées.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe clinique, les animaux recevront un antalgique (0,1 mg/kg de buprénorphine par voie souscutanée (10mL/kg)). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 1 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée chez l’homme, 1300mg et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité. Les études précliniques utilisant les AsiDNA, n'ont pas rapporté de toxicité supplémentaire de ces médicaments seuls ou en association avec des agents génotoxiques. De plus, les résultats récents de l'essai clinique de phase I/II du DRIIM ont démontré que l'administration locale d'AsiDNA améliorait la réponse radiologique des métastases cutanées du mélanome, sans toxicité cutanée supplémentaire. Les doses d’irradiation ont été déterminées par l’étude de la radiorésistance in vivo dans nos modèles et n’engendre aucun effets secondaires. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l'espèce privilégiée en oncologie. Dans ce projet, des cellules humaines seront greffées à des souris immunodéficientes nudes, modèle sur lequel les chercheurs en cancérologie ont un très grand recul, ce qui permet d'obtenir des résultats fiables et comparables. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (4 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 6 mois), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".

Objectifs

Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.

Bénéfices attendus

L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.

Procédures

270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)

Impact sur les animaux

Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).

Devenir

Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.

Remplacement

Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.

Raffinement

Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis la greffe chirurgicale d'un fragment de tumeur gastrique sous la peau, pour tester si cette vaccination ralentit le développement tumoral. Le porteur indique qu'une tumeur va croître et pourrait gêner les déplacements, avec une douleur modérée en cas d'ulcération. Il qualifie la vaccination de modèle "gold standard" dans la littérature et affirme qu'un passage à l'"organisme entier" est "indispensable" après la phase in vitro.

Objectifs

Notre projet repose sur une procédure de vaccination chez la souris en lui administrant des cellules traitées qui induirait une MCI (mort cellulaire immunogène). Cette MCI induite par vaccination permettrait de ralentir ou d’empêcher le développement de tumeur, induite dans un second temps chez les souris vaccinées en procédant à l’implantation d’une tumeur de cancer gastrique en sous-cutané. Cette procédure est considérée, dans la littérature, comme le " gold standard" permettant de démontrer l'induction de la MCI. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité.

Bénéfices attendus

Le cancer gastrique (CG) est un cancer très agressif associé à une médiane de survie de 10 mois et à un taux de survie à 5 ans inférieur à 25%. La stratégie thérapeutique actuelle repose sur la chirurgie combinée à la chimiothérapie à base de sels de platine (oxaliplatine). Ce traitement est agressif, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et le pronostic de ces tumeurs reste sombre. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur CG. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothèse qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées déjà utilisées dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particulière qui stimule le système immunitaire. Le but ultime est d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement des cancers gastriques.

Procédures

Les 36 souris engagées dans ce projet subiront d'abord une injection sous-cutanée. Une semaine plus tard, un fragment de tumeur de la même lignée cellulaire sera implantée en sous-cutanée . Cette intervention nécessite une anesthésie, en effet, une incision est faite sur le flanc droit pour insérérer le fragment tumoral et un point de suture est réalisé pour refermer. Les animaux sont ensuite suivis durant maximum 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux engagés dans ce projet subiront une première injection (vaccination) en sous-cutané au niveau du flanc gauche. Une semaine plus tard, une chirurgie sera pratiquée pour implanter en sous-cutané un fragment de tumeur sur le flanc droit des mêmes animaux. Cette étape nécessite de faire une incision de la peau sur quelques millimètres et donc de faire un point de suture après l’implantation. Cette chirurgie dura une quinzaine de minutes. Un développement de tumeurs est attendu sur les animaux. Les tumeurs grossiront et pourront gêner les souris dans leurs déplacements. Si la peau au niveau de la tumeur devait s'ulcérer, une douleur modérée pourrait apparaître.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. En effet, la démonstration la plus robuste de ces phénomènes repose sur la vaccination de modèles animaux. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum 36 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été définis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole limitant ainsi dans le temps la souffrance et le stress potentiels.

Choix des espèces

La preuve d'une Mort Cellulaire Immunogène (MCI) complète nécessite des éléments in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche vaccinale est la seule approche admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale. Il nous est donc indispensable, après la phase in vitro de passer à un modèle d'organisme entier, ici la souris. Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6 à 8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.