Cancers
- Alimentation animale
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- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
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- Maladies infectieuses
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- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
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- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Identification des mécanismes impliqués dans la fonction pro-tumorale des cellules tuft dans le cancer gastrique causé par Hélicobacter
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie sous anesthésie sans réveil et le reste de gravité légère à modérée. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter felis, qui provoque des lésions gastriques et un cancer de l'estomac avec perte de poids, et reçoivent des gavages et des injections répétés. Le porteur indique suivre l'apparition des lésions sur des durées d'au moins six mois et mettre à mort les animaux dès l'atteinte de scores de souffrance définis. Il qualifie le modèle animal d'"indispensable" faute de méthode reproduisant ce processus, l'objectif restant de comprendre le rôle de certaines cellules dans la tumeur.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de découvrir les mécanismes impliqués dans les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft en utilisant des modèles murins innovants suite à une infection à Helicobacter.
Bénéfices attendus
Elucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les propriétés pro-oncogeniques des cellules intestinales suite à une infection à H. felis. Les analyses moléculaires pourraient permettre l'identification de substances biologiques potentiellement médicamenteuses. Cela mettrait en lumière de nouveaux mécanismes d’interaction entre H. felis, les cellules tuft et la muqueuse gastrique, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques inexplorées.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 1100 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Injection intrapéritonéale sur animal vigile : 150 souris, 1 fois par jour pendant 5 jours Prélèvement sanguin rétro-orbitaire sous anesthésie générale : 1980 souris, 1 fois en phase terminale
Impact sur les animaux
Perte de poids liée à l’infection à H. felis et au développement de lésions gastriques dans les expériences d’infection d’une durée supérieure ou égale à 6 mois. Souffrance observée.
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft gastriques suite à une infection à H. felis. A ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus ce qui rend le modèle animal indispensable.
Réduction
Le modèle d’infection à H. felis est connu et maitrisé par notre équipe. En souris contrôle (dit WT) nous utiliserons les souris non transgéniques issues des accouplements des lignées dans un but de réduire le nombre d’animaux. Nous prévoyons également d’utiliser des mâles et des femelles pour l’objectif 5 dans les expériences de lineage tracing, toujours dans un but de réduction. Pour les autres objectifs, des mâles seront utilisés car la réponse inflammatoire et la carcinogenèse sont maximales chez les mâles d’après les études antérieures du laboratoire et d’après la littérature scientifique. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. felis qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.
Raffinement
Les souris seront suivies en suivant les critères de la feuille de scoring fournie en annexe. Pour un score compris entre 6 et 12 les souris recevront de la nourriture humidifiée dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement sacrifié. Si le score est supérieur ou égal à 12, l’animal sera sacrifié sans attendre. Les souris seront pesées (de façon hebdomadaire), si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera sacrifié sans attendre.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. felis a été mis au point chez la souris. De plus nous disposons de plusieurs lignées de souris transgéniques pour ce projet qui nous permettront de répondre aux objectifs fixés. Les souris seront utilisées à un âge de 6-7 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. felis. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.
Étude des agents de contraste capables de détection du zinc – un biomarqueur de cancer de pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
345 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart reçoivent une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections d'agents de contraste radiomarqués et un prélèvement de sang intracardiaque suivi de la mise à mort, pour étudier la détection du zinc par imagerie. Le porteur indique un suivi par grille de score, avec mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si les signes cliniques s'aggravent. Il affirme que la complexité des tumeurs pancréatiques ne peut se modéliser que sur un "organisme vivant entier".
Objectifs
Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans le pancréas : le zinc est relargué avec l’insuline et est impliqué dans le diabète mais aussi dans le cancer pancréatique. C’est estimé que le cancer du pancréas deviendra la deuxième cause de mortalité liée au cancer au cours de la prochaine décennie, dans les pays occidentaux. Son pronostic actuel est extrêmement mauvais avec un taux de survie global à 5 ans de seulement 3% en raison de l'absence de symptômes spécifiques et de l'absence de diagnostic précoce. Des chercheurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au zinc. Après complexation avec le zinc présent au niveau du pancréas, il va s’ensuivre une variation du signal sur l’image du pancréas. Des études précédentes, déjà validées par le ministère, ont permis l’obtention de preuve de concept de la détection IRM de Zn2+ in vivo dans le cadre du diabète et dans le cadre de l’adénocarcinome de pancréas. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. L’objectif de cette saisine est d’étudier la biodistribution in vivo (par tomographie d’émission monophotonique, TEMP) et ex vivo (prélèvement d’organes post-mortem à des temps précis), des agents de contraste développés (et validés en IRM) en souris saines et souris modèle de cancer de pancréas (modèles adénocarcinome et insulinome), à l'aide des analogues marqués à l'111In ou à l'165Er, deux émetteurs gamma possibles de visualiser par TEMP.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette demande est donc d'évaluer la possibilité de détecter et quantifier le zinc par TEMP, grâce à des agents de contraste dédiés, développés par le client, dans des souris témoins saines et modèles de cancer du pancréas. Des biodistributions ex vivo de ces agents de contraste sont réalisées. L'objectif à long terme de ce projet sera de fournir un diagnostic précoce aux populations à haut risque afin d'accroître leur taux de survie et d'améliorer le suivi des patients après traitement.
Procédures
270 souris auront des greffes orthotopiques au niveau du pancréas (procédures 1, 2, 3) Elles seront placées sous paracétamol (analgésique) dans l'eau de boisson la veille de l’intervention (500mg dans un biberon de 200mL) jusqu’à 24h post induction. L'induction sera réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2% dans l'air). A la fin de l’intervention, une injection de tolfédine 4mg/kg (anti inflammatoire) sera réalisée en sous cutané (50μL) et renouvelée le lendemain de l'intervention. Elles subiront une seule chirugie lors de l'induction tumorale qui durera 20 minutes maximum. 75 souris vigiles (dont 60 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 2 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue (à un temps précoce J7 et à un temps tardif J21 ou J35) (procédure 2) et 180 souris vigiles (dont 120 avec des tumeurs pancréatiques) recevront 1 fois 150μL d'agent de contraste radiomarquée par voie intraveineuse au niveau de la queue. 180 souris vigiles portant une tumeur du pancréas recevront une IP de 50μL de glucose 40% (modèle insulinome dans les procédures 1, 2 et 3). 180 souris ((dont 120 avec des tumeurs du pancréas) anesthésiées à l'isoflurane (2% dans l'air) subiront un prélevement sanguin de 400μL en intracardiaque qui sera immédiatement suivi par la mise à mort sans réveil intermédiaire. (procédure 3)
Impact sur les animaux
Les dommages attendus lors de ce projet sont dûs au développement tumoral pancréatique. Pour suivre cela, nous mettons en oeuvre une grille de scoring qui permettra de prendre les mesures nécessaires afin d'éviter toute souffrance chez l'animal. En pratique, une perte de poids et une modification du comportement pourront être observés (diminution de la locomotion, prostration, amaigrissement, aspect du pelage).
Devenir
Procédure 1: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever les foies et les pancréas post mortem pour le dosage du Zinc présent. Procédure 2: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les souris ayant des tumeurs pancréatiques et ayant été injectées avec des agents de contraste radiomarquées ne peuvent être réutilisées. Procédure 3: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort, afin de pouvoir prélever différents organes (pancréas, rate, foie, coeur, poumons, reins, cerveau, intestins, muscles) post mortem afin de quantifier précisément des molécules marquées à l'111In ou à l’165Er préalablement administrées.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisqu'à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs pancréatiques et la distribution des agents de contraste à tester in vitro ; cette étude ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.
Raffinement
Les animaux seront suivis par observation individuelle chaque jour de la semaine pour anticiper, le cas échéant, le développement de douleurs ou de souffrances. Les animaux seront également suivis individuellement par pesée 1 fois par semaine. Si une perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, cela entraînera la mise à mort de l’animal (points limites). Par ailleurs, l’absence de socialisation des animaux, le changement d’aspect de la peau (reflet de la qualité du toilettage de l’animal) et l’absence de toilettage seront évalués quotidiennement pour anticiper la souffrance des animaux. Les modèles de tumeur pancréatique peuvent se dérouler sur une période maximale de 35 jours postinjection des cellules. De par notre expérience, à J35, les tumeurs auront une taille inférieure ou égale à 100mm3. Si toutefois un animal venait à présenter des signes de souffrance, il serait mis à mort avant. Une grille de scoring sera utilisée pour le suivi clinique des animaux :ASPECT GENERAL, COMPORTEMENT/ LOCOMOTION, PHYSIOLOGIE CLINIQUE Chaque animal sera mis à mort dès que le score d’un paramètre sera égal à 2, ou dès que le total des scores sera strictement supérieur à 3. De plus, l’imagerie TEMP est une approche non invasive pratiquée sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le modèle d’adénocarcinome chez la souris a été décrit et mis en oeuvre par notre équipe depuis plusieurs années. La lignée immunodéprimée Swiss nude est la lignée qui répond le mieux à l’induction de l’adénocarcinome. Les niveaux de zinc changeant avec la lignée et le sexe des souris, cette même lignée sera utilisée comme témoin et pour l’induction des insulinomes. Des souris femelles âgées adultes de 6-8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur ce modèle.
Induction de la mort cellulaire immunogène par vaccination prophylactique chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis la greffe chirurgicale d'un fragment de tumeur gastrique sous la peau, pour tester si cette vaccination ralentit le développement tumoral. Le porteur indique qu'une tumeur va croître et pourrait gêner les déplacements, avec une douleur modérée en cas d'ulcération. Il qualifie la vaccination de modèle "gold standard" dans la littérature et affirme qu'un passage à l'"organisme entier" est "indispensable" après la phase in vitro.
Objectifs
Notre projet repose sur une procédure de vaccination chez la souris en lui administrant des cellules traitées qui induirait une MCI (mort cellulaire immunogène). Cette MCI induite par vaccination permettrait de ralentir ou d’empêcher le développement de tumeur, induite dans un second temps chez les souris vaccinées en procédant à l’implantation d’une tumeur de cancer gastrique en sous-cutané. Cette procédure est considérée, dans la littérature, comme le " gold standard" permettant de démontrer l'induction de la MCI. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité.
Bénéfices attendus
Le cancer gastrique (CG) est un cancer très agressif associé à une médiane de survie de 10 mois et à un taux de survie à 5 ans inférieur à 25%. La stratégie thérapeutique actuelle repose sur la chirurgie combinée à la chimiothérapie à base de sels de platine (oxaliplatine). Ce traitement est agressif, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et le pronostic de ces tumeurs reste sombre. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur CG. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothèse qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées déjà utilisées dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particulière qui stimule le système immunitaire. Le but ultime est d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement des cancers gastriques.
Procédures
Les 36 souris engagées dans ce projet subiront d'abord une injection sous-cutanée. Une semaine plus tard, un fragment de tumeur de la même lignée cellulaire sera implantée en sous-cutanée . Cette intervention nécessite une anesthésie, en effet, une incision est faite sur le flanc droit pour insérérer le fragment tumoral et un point de suture est réalisé pour refermer. Les animaux sont ensuite suivis durant maximum 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux engagés dans ce projet subiront une première injection (vaccination) en sous-cutané au niveau du flanc gauche. Une semaine plus tard, une chirurgie sera pratiquée pour implanter en sous-cutané un fragment de tumeur sur le flanc droit des mêmes animaux. Cette étape nécessite de faire une incision de la peau sur quelques millimètres et donc de faire un point de suture après l’implantation. Cette chirurgie dura une quinzaine de minutes. Un développement de tumeurs est attendu sur les animaux. Les tumeurs grossiront et pourront gêner les souris dans leurs déplacements. Si la peau au niveau de la tumeur devait s'ulcérer, une douleur modérée pourrait apparaître.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.
Remplacement
Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. En effet, la démonstration la plus robuste de ces phénomènes repose sur la vaccination de modèles animaux. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients.
Réduction
Le projet nécessitera un nombre maximum 36 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été définis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole limitant ainsi dans le temps la souffrance et le stress potentiels.
Choix des espèces
La preuve d'une Mort Cellulaire Immunogène (MCI) complète nécessite des éléments in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche vaccinale est la seule approche admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale. Il nous est donc indispensable, après la phase in vitro de passer à un modèle d'organisme entier, ici la souris. Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6 à 8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.
Rôle pathogénique du stroma médullaire dans la leucémie myélomonocytaire chronique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 170 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré. Elles sont irradiées puis greffées de cellules et suivies pendant leur vieillissement, avec prélèvements de sang mensuels sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IGFBP2 dans une leucémie chronique. Le porteur indique que les effets indésirables tiennent à l'irradiation et au développement du clone leucémique. Il affirme travailler autant que possible sur des cellules de patients, mais conclut que certaines questions ne peuvent être résolues ni chez l'homme ni en culture in vitro.
Objectifs
Notre équipe explore les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’une leucémie chronique appelée leucémie myélomonocytaire chronique. C’est une affection maligne associée au vieillissement de la moelle osseuse hématopoïétique, le tissu qui fabrique les cellules sanguines. C’est une affection sévère puisque l’espérance de vie est en moyenne de 2 à 3 ans après le diagnostic. Le seul traitement susceptible de guérir de cette leucémie est la greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques mais ce traitement est souvent irréalisable compte tenu de l’âge des patients – en moyenne 70 ans et ne fonctionne pas très bien avec des rechutes fréquentes. Il n’y a pas de solution médicamenteuse efficace. Depuis des années, notre équipe s’efforce de déchiffrer les mécanismes de cette maladie afin d’imaginer des solutions thérapeutiques. Le plus souvent, nous travaillons à partir de cellules de patients. Pour répondre à certaines questions, il nous est utile de recourir aux modèles animaux. Cette leucémie est attribuée à l’accumulation d’évènements génétiques anormaux dans une cellule souche de la moelle osseuse hématopoïétique. Ces évènements sont nécessaires, ils ne sont pas suffisants. Pour que la maladie se développe, il faut que le tissu dans lequel se fait la fabrication des cellules sanguines (on parle de niche médullaire) le permette. En d’autres termes, la leucémie est la conséquence à la fois d’un dérèglement du tissu hématopoïétique (celui qui fabrique les cellules sanguines) et du tissu qui l’entoure (la niche médullaire). Nos travaux nous ont permis d’observer que l’une des modifications les plus nettes de la niche médullaire est la capacité de certaines des cellules de cette niche à produire une protéine appelée IGFBP2. Or, cette protéine est connue pour modifier le comportement des cellules hématopoïétiques. Elle est même utilisée pour favoriser l'expansion des cellules souches hématopoïétiques humaines dans le contexte de la greffe de moelle. Dans le projet proposé, nous posons la question suivante : est-ce qu’IGFBP2 produit anormalement par les cellules de la niche médullaire favorise le développement de cellules leucémiques? Nous explorerons l’impact du vieillissement normal, de la production excessive de la protéine IGFBP2, et du développement d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire. Puis nous déterminerons si la quantité d’IGFBP2 produite favorise le développement d’un clone leucémique.
Bénéfices attendus
Les résultats de nos travaux chez la souris, complétés par des analyses en cours chez les patients, nous indiquerons s’il serait utile de tester un médicament inhibant IGFBP2 pour contrôler l’évolution de la leucémie étudiée. C’est une hypothèse d’autant plus séduisante que la neutralisation d’IGFBP2 chez la souris la protège de maladies chroniques comme le diabète.
Procédures
Irradiation des souris destinées à subir une transplantation (environ 10min). Transplantation de splénocytes (sous anesthésie par inhalation d'isoflurane 1.5-2%) (environ 10min). Prélèvement de sang au niveau sous-mandibulaire sous anesthésie par inhalation d'isoflurane 1.5-2% (< 5min).
Impact sur les animaux
Nous allons suivre l’évolution de la composition de la niche médullaire au cours du vieillissement de souris sauvages ou produisant trop d’IGFBP2. Les nuisances et effets indésirables seront limités puisque nous laisserons les souris vieillir sans autre manipulation qu’un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les mois. Il a été montré que la surexpression d’IGFBP2 chez la souris la protège de l’obésité et du diabète induit par un régime riche en sucres et graisses sans phénotype délétère identifié. Nous allons également suivre l’évolution de la composition de la niche médullaire au cours du vieillissement de souris développant une leucémie. Les effets indésirables seront liés au développement du clone leucémique au cours du vieillissement. Les effets indésirables seront ceux de l’irradiation (perte de poids transtoire) nécessaire à la greffe puis ils seront liés au développement du clone leucémique .
Devenir
Pour chaque procédure, les souris seront euthanasiées à terme afin de récolter tout le matériel biologique (souris CTRL comprises) nécessaire à nos analyses (scRNAseq, cytométrie en flux, numération des cellules sanguines, immunohistochimie sur coupes, ELISA)
Remplacement
Aussi souvent que possible, les expériences réalisées dans ce programme le sont à partir de cellules de patients collectées lors de bilans de surveillance. Cependant, la réponse à certaines questions ne peut pas être obtenue chez l’homme ni dans des systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D in vitro. Il s’agit de connaître 1)le rôle du vieillissement sur l’évolution de la composition de la niche médullaire (l’analyse de souris de génotype identique et d’âge variable permet de maîtriser ce paramètre considéré comme important puisque la maladie étudiée est une maladie directement liée au vieillissement, ce que révèle l’analyse génomique des cellules leucémiques des patients) 2)la dynamique de l’impact d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire qui, elle aussi, nécessite des analyses répétées au cours du vieillissement, non réalisables chez l’homme. 3)l’impact d’un taux accru d’IGFBP2 sur la croissance d’un clone leucémique et sa compétitivité vis-à-vis d’un clone sauvage est une troisième question à laquelle il n’est pas possible de répondre à partir d’échantillons issus de patients. Ces données doivent nous permettre d’évaluer l’utilité d’une approche thérapeutique visant à maîtriser la production d’IGFBP2 chez les patients lorsqu’un clone leucémique a été détecté. Dans ce programme de recherche, les animaux ne sont utilisés que lorsque la réponse aux questions générées par l’exploration de la leucémie étudiée ne peut être obtenue chez l’homme et par des expériences à partir de modèles in vitro : la plupart des expériences du programme de recherche soutenu par l’INCa sont réalisées à partir de prélèvement de sang ou de moelle obtenus de patients avec leur accord. Ce sont ces analyses qui nous conduisent maintenant à interroger le rôle d’IGFBP2 dans la leucémie myélomonocytaire chronique.
Réduction
Les expériences seront réalisées sur des cohortes d’animaux les plus petites possibles, mais assez grandes pour nous permettre d’obtenir des résultats fiables et, lorsque cela a du sens, significatifs d’un point de vue statistique. Le nombre des animaux nécessaires a été calculé - A partir du nombre de cellules à collecter pour les analyses envisagées : l’analyse de la composition de la niche médullaire des souris au cours du vieillissement ne nécessite pas de calcul statistique puisqu’il s’agit d’analyses observationnelles qui seront réalisées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires à la collecte de 25000 cellules analysables par une approche de séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire. Tout sera fait pour optimiser la collecte de cellules afin de réduire le nombre des animaux impliqués. - A partir d’une hypothèse sur le gain de compétitivité du clone muté en présence d’IGFBP2,le nombre d’animaux utilisés repose sur un calcul statistique. Certains animaux seront caractérisés à différentes étapes de leur vieillissement (4, 8, 12 mois). Il pourra s’agir d’animaux sans phénotype anormal ou d’animaux génétiquement modifiés susceptibles de développer un phénotype lié à l’expansion du clone leucémique après quelques mois. Ils seront étudiés à différentes étapes de leur vieillissement.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement, des mesures d'adaptation du régime seront mises en place quand nécessaire (en cas d'amaigrissement, même minime, un régime de haute énergie, facile à ingérer sera fourni). Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale, dépendanmment de l'intervention. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi à l’aide de nestlets et maisons en cartons afin de réduire le stress. Des points limite stricts ont été définis et seront scrupuleusement appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris est dicté 1) par la bonne connaissance que nous avons de l’hématopoïèse murine qui reproduit de nombreux aspects de l’hématopoïèse humaine ; 2) la disponibilité de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre aux questions que nous nous posons ; 3) son vieillissement relativement rapide, compatible avec les analyses envisagées Nous envisageons de réaliser nos expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques sur des souris âgées de 1.5 à 5 mois pour mimer la situation chez les patients. Les analyses au cours du vieillissement spontané seront réalisées chez des souris âgées de 4, 8 et 12 mois pour observer une évolution de la maladie dans le temps comme chez les patients.
Evaluation de nouvelles thérapies et étude des mécanismes de progression des tumeurs du foie dans un modèle murin immunocompétent
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales du foie, par chirurgie dans l'organe ou par injection sous la peau, puis des traitements par voie intrapéritonéale ou par plasma froid et un suivi par imagerie sous anesthésie, pour évaluer de nouvelles thérapies des cancers hépatiques. Le porteur indique que la contrainte principale tient au développement tumoral et prévoit des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".
Objectifs
Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.
Bénéfices attendus
Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.
Etude de l’induction d’une mort cellulaire immunogène par thérapie photodynamique et vaccination
- Recherche appliquée
- Cancers
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, pour tester si une vaccination prévient l'apparition de tumeurs des voies aérodigestives. Le porteur indique que des tumeurs sont attendues, au moins dans les groupes témoins, et prévoit des points limites de taille et d'aspect. Il affirme que le recours à des souris immunocompétentes est "indispensable" et invoque le même fond génétique de l'"organisme entier" pour éviter le rejet de greffe.
Objectifs
Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) définissent un groupe hétérogène de tumeurs malignes qui se développent au dépend de l'épithélium des voies aérodigestives supérieures (cavité orale, pharynx et larynx). Les CETC sont le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde, avec plus de 600 000 cas diagnostiqués chaque année. Leur incidence est particulièrement élevée en Europe de l'Ouest, et dans le Nord et le Nord-Est de la France (23 cas/100.000 habitants). Les CETC diagnostiqués à un stade précoce sont traités par radiothérapie ou chirurgie, et le pronostic est bon avec une survie globale à 5 ans d'environ 90%. Cependant, la majorité des CETS sont diagnostiqués à un stade localement avancé. La prise en charge de ces tumeurs de haut grade est multimodale et repose sur la combinaison de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie à base de platine. Malgré des modalités de traitement agressives, le pronostic des CETC ne s'est que marginalement amélioré au cours des trois dernières décennies, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 45-50 %. Ces traitements sont agressifs, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et malgré cela, le pronostic de ces tumeurs reste sombre, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 50%. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur ORL. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothese qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées deja utilisees dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particuliere qui stimule le systeme immunitaire. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter leur efficacité. L’enjeu de ce projet est donc la réalisation d’une expérience d’immunisation (vaccination) sur de modèles murins de cancer et l’évaluation de la capacité de cette vaccination à prévenir l’apparition ou la progression tumorale de manière prophylactique.
Bénéfices attendus
Cette approche nous permettra d’établir si les protocoles de vaccination que nous avons mis au point sont capables de mobiliser le système immunitaire. Si une action anti-tumorale prophylactique est démontrée, cela permettra d’établir un rationnel solide sur l'induction d'une MCI. Cette mort cellulaire immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité pour des stratégies thérapeutiques futures.
Procédures
Chaque souris engagée dans ce projet sera d'abord injectée en sous-cutanée avec une suspension cellulaire pour la phase de vaccination. Une semaine plus tard, une deuxième injection sous-cutanée de suspension de cellules tumorales sera réalisée pour induire une tumeur.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront 2 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle. Ce geste ne devrait pas engendrer de douleur ou de souffrance particulière. La deuxième injection a pour but d'effectuer une greffe tumorale. Nous nous attendons donc à observer l'appartition de tumeurs, au moins pour les groupes témoins si la vaccination devait être un succès. Les souris seront surveillées tous les jours afin d'observer leur état général (état du pelage, comportement...). Des points limites sont définis (aspect et taille de la tumeur par exemple) pour pouvoir soustraire un animal avant qu'une souffrance ou une douleur ne s'installe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.
Remplacement
Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients. La démonstration de capacité de notre protocole vaccinla à induire une MCI complète nécessite des éléments de preuves in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche est la seule admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale.
Réduction
Le projet nécessitera un nombre maximum de 120 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été établis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris de la lignée C57BL/6. Ceci se justifie par le fait que les lignées cellulaires que nous allons utiliser sont dérivées de carcinome ORL de souris C57BL/6. Il est indispensable que les lignées cellulaires et l'organisme entier utilisé pour cette étude que faut le même fond génétique pour éviter un phénomène de rejet de greffe (les souris C57BL/6 étant immunocompétentes). Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6-8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.
Développement de radiotraceur pour l’imagerie de la mutations mIDH1 dans le chondrosarcome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales en sous-cutané ou près du tibia, puis l'injection de traceurs radioactifs pour l'imagerie, avant d'être tuées pour analyser la distribution des molécules. Le porteur reconnaît que la greffe près du tibia peut être douloureuse et gêner le déplacement une fois la tumeur développée. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" pour valider ces traceurs.
Objectifs
Les mutations des gènes de l’Isocitrate Déshydrogénase (mIDH) favorisent la progression tumorale. Ces mutations sont fréquemment identifiées dans des cancers comme le gliome ou le chondrosarcome (CHS), tumeurs solides infiltrantes et invasives, limitant une résection complète et provoquant souvent des récidives ainsi qu’une incapacité progressive des patients. De nouveaux inhibiteurs ciblant mIDH pourraient représenter de nouveaux espoirs de thérapie, mais leur succès repose sur une évaluation préalable de l’expression de mIDH dans ces tumeurs. Cependant, contrairement aux alternatives invasives comme la biopsie, les modalités d’imagerie non invasives pour la quantification de l’expression de mIDH n’ont été que peu étudiées pour ces tumeurs. Ce projet consiste en une approche translationnelle et multimodale de développement de méthodes d’imagerie, via des radiotraceurs marqués au fluor-18 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP). Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Bénéfices attendus
Si les résultats de biodistribution sont favorables au transfert et à évaluation clinique de radiotraceurs, la quantification de l’expression de mIDH sera évaluée par autoradiographie sur tissus de tumeurs cérébrales et de CHS issus de patients, afin de conduire pour la première fois à des données quantitatives concernant l’expression de mIDH sur des tumeurs humaines. Si ces résultats sont favorable, cette mutation et son impact métabolique seront également étudiés en clinique par spectroscopies per-opératives de résonance magnétique chez des patients atteints de gliome ou de CHS afin d’évaluer leur intérêt pour estimer plus précisément l’étendue de la résection à réaliser, paramètre impactant fortement le taux de survie. A plus long terme, Ces stratégies d’imagerie constitueraient un outil précieux pour une médecine de précision pour ces pathologies cancéreuses.
Procédures
L’ensemble des animaux recevra une injection sous cutanée ou paratibiale sous anesthésie gazeuse (durée 5min). Pour les animaux des lots 2 à 4, ils recevront également une injection intraveineuse (moins de 1min) en vigile entre 15 jours et 6 semaines après l’injection sous cutanée ou paratibiale.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules en paratibiale pourrait entrainer une douleur poste injection (douleur anticiper par l’administration préventive d’antalgique (Rimadyl, 20mg/kg ou Méloxicam 5 mg/kg) en pré et post implantation. Une gêne au déplacement pourra aussi être observé une fois la tumeur ayant atteint un certain stade de développement.
Devenir
Procédure 1 et 2 : Mise à mort Lot 1 pour l’analyse protéique, génomique et histologique des tumeurs Procédure 3 : Mise à mort Lot 2 détermination de la distribution des radiotraceur dans les organes des animaux à différent temps Mise à mort Lot 3 analyses de spécificité de fixation par prélèvement Mise à mort du lot 4 analyses des métabolites sang et urine et tumeur
Remplacement
Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouveaux radiotraceurs requièrent la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude pilote (étude 1) et les examens d’imagerie (étude 3) permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 488 souris maximum sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques (Rimadyl, 5mg/kg en sous-cutanée, 1 fois par jours pendant 5 jours maximum) avant l'atteinte des points limites définis (perte de poids supérieure à 20%, du poids maximal observé, prostration, hérissement du poil, volume tumoral, aspect du point d’injection…). Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, l’étude pilote ainsi que l’étude impliquant des examens d’imagerie permettent de raffiner cette étude en termes de caractérisation du modèle et d’examen non invasif.
Choix des espèces
Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptés pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Des animaux de 5 à 7 semaines sont classiquement utilisés pour ce type de modèle.
Dépendances génomiques du myélome multiple surexprimant MYC
- Recherche appliquée
- Cancers
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois modèles de myélome leur sont greffés par injection de cellules tumorales, suivie de traitements administrés chaque jour pendant quatre semaines, l'animal étant tué en cas de détresse vitale ou quand la tumeur atteint deux centimètres cubes. Le porteur revendique l'importance de valider ces cibles thérapeutiques "in vivo" pour reconstituer le microenvironnement tumoral. Il affirme que l'utilisation des animaux est "essentielle" pour produire des données précliniques fiables.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence de ces dépendances géniques in vivo. Objectif. Etablir des approches thérapeutiques à partir de modèles précliniques in vivo pour cibler le MM surexprimant MYC. a. Etudier in vivo les stratégies de létalité synthétique dans des modèles murins de xénogreffes de MM surexprimant MYC. b. Etudier in vivo les stratégies thérapeutiques ciblant les dépendances géniques dans le modèle murin transgénique Vk*MYC
Bénéfices attendus
En utilisant le concept de dépendance génomique, nous avons pu prouver l'importance élevée du métabolisme de la glutamine dans les cellules MYC+, que nous étudions en tant que nouvelle stratégie de traitement. Notre travail vise à mettre en évidence la possibilité d'orienter précisément la thérapie vers certains types de cancers grâce à l'identification de leurs vulnérabilités.
Procédures
Trois modèles murins differents seront utilisés: 1-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injectées en intraveineux avec 3.5 millions de cellules des lignées de MM exprimant la luciférase disponibles dans le laboratoire (MM1S luc-GFP). Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 2-Modèle syngénique à partir de souris C57BL/6J injectées en intraveineux avec 3.5 millions des cellules disponibles dans le laboratoire vk*myc, les prises de sang se feront toutes les semaines pour suivre le pic monoclonal. Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 3-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injection sous-cutanée dans le flanc droit de 5millions cellules U266-CT ou U266-MYC dans du Matrigel. Le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains).
Impact sur les animaux
Les toxicités: Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume). CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels des souris sera surveillé pour identifier une éventuelle toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison
Devenir
Les souris sont sacrifiées par inhalation de CO2 pendant 5 minutes, suivi d’une dislocation cervicale. Les souris sont sacrifiées en cas de signe de souffrance ou de détresse vitale et en cas de volume tumorale atteignant 2cm3
Remplacement
L'utilisation des animaux dans cette étude est essentielle afin de valider l'efficacité de thérapies ciblées sur des tumeurs de myélome surexprimant MYC. Cette étape de validation in vivo est déterminante afin de produire des données pré-cliniques fiables, avec la reconstitution du microenvironnement tumoral, y compris du système immunitaire interagissant avec les cellules tumorales. Ces données pourraient permettre de développer par la suite des essais cliniques de phase précoce.
Réduction
A fin de respecter le principe de réduction, les experiences ont été conçues afin de coordoner plusieur paramètres d'analyse à partir d'expériences individuelles et permettent une analyse longitudinale. Cela réduit la nombre total d'animaux requis. De plus, si les premiers résultats obtenus sont statistiquement signifiatifs et suffisamment homogènes, le nombre d'animaux et de répétitions d'expérimentations sera diminue. Des groupes de 7 souris seront étudiés, permettant une puissance de 80% en projetant une différence de 1.5 déviation standard en utilisant un t test avec un risque alpha de 0.05. Chaque groupe sera exposé à des traitements en combinaisons de différents inhibiteurs d’intérêt ou aux inhibiteurs seuls ou à du DMSO
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions standards et auront une période d'acclimatation dans l'animalerie de 7 jours avant toute manipulation. Ils seront manipulés tous les jours avec douceur et calme par du personnel expérimenté. Les signes de souffrances seront activement recherchés. Lors des procédures (injections IP, SC ou mesure du volume tumoral), les souris seront maintenus sous anesthésie par inhalation d'isoflurane (2% d'isoflurane) afin de les maintenir immobile et d'empêcher l'angoisse des animaux. Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume) et CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels seront surveillés pour l’indication de toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison.
Choix des espèces
Les modèles murins sont adaptés aux lignées cellulaires utilisées dans le myélome multiple et permettant de générer les données in vitro. Deux modèles sont utilisés dans ce projet, un modèle de xénogreffe à partir des souris génétiquement modifiées SCID, injectées avec les lignées cellulaires MM.1S luc/GFP et U266. Ces deux lignées cellulaires sont des lignées de référence dans le myélome multiple. Afin de valider les données du modèle de xénogreffe, un modèle syngénique sera utilisé avec des souris BL6 injectées avec la lignée cellulaire murine Vk*MYC. Ce modèle permet une analyse de l’efficacité des thérapeutiques dans un contexte immunocompétent, plus représentatif des conditions biologiques humaines. La pertinence de ces modèles de xénogreffe et syngénique a été démontré dans de nombreuses études pré-cliniques, ce qui en fait le modèle de choix des analyses in vivo. Les souris SCID et C57BL/6J seront injectées entre 6 et 8 semaines d'âge, ce qui coorespond au modèles les plus fréquemments utilisés dans la litérature.
VaccinoLIV : Étude de l’immunogénicité et de l’efficacité chez la souris de candidats vaccins recombinants
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Toutes tuées à la fin de chaque procédure, 3 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer des candidats vaccins et des virus de la rougeole modifiés contre le cancer. Une partie est infectée par des virus humains ou par le parasite du paludisme des rongeurs Plasmodium berghei, une infection qui peut entraîner selon le porteur fièvre, prostration, perte de poids et paralysie, avec une mise à mort dès le score 2 de sa grille de douleur. D'autres reçoivent une greffe de cellules tumorales, avec des tumeurs qui peuvent s'infecter ou s'ulcérer, et des injections de vaccins une à deux fois par semaine pendant dix semaines au plus. Pour la virothérapie des cancers, le porteur invoque un "besoin médical" et un "marché" qu'il dit "également immenses".
Objectifs
L’objectif du projet est l’évaluation préclinique chez la souris de l’immunogénicité et de l’efficacité des différents candidats vaccins développés au laboratoire. Les capacités anticancéreuses de virus de la rougeole modifiés seront aussi évaluées dans des modèles de greffes de tumeurs syngéniques. Ces objectifs sont justifiés du point de vue scientifique car ils permettent de démontrer la fonctionnalité des candidats vaccins ou thérapeutiques. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves, ainsi qu’un possible traitement contre certains cancers, deux domaines d’impact majeur en santé publique.
Bénéfices attendus
Les candidats vaccins développés dans le laboratoire sont destinés à être évalués par la suite dans des essais cliniques. Leur évaluation préalable dans un modèle murin permet de démontrer leur efficacité et leur sûreté préclinique et de définir les doses et schémas vaccinaux. Le but ultime de ce projet est la mise à disposition de vaccins préventifs contre plusieurs pathologies infectieuses graves pour lesquelles le besoin médical est immense, ainsi qu’un traitement viro-thérapeutique contre certains cancers pour lesquels le besoin médical et le marché sont également immenses.
Procédures
Les animaux sont immunisés par voie intrapéritonéale, intramusculaire, intradermique, intraveineuse ou orale selon l'agent pathogène ciblé (quelques secondes par animal). Les prélèvements sanguins à la veine rétro-mandibulaire sont effectués à J0 - J7 - J28 - J60 après la vaccination (quelques secondes par animal). Pour évaluer l'efficacité des vaccins, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses (quelques secondes par animal) par des virus humains pathogènes ou non-pathogènes chez les souris contrôles ou par le parasite du paludisme Plasmodium berghei, pathogène. Le suivi du challenge est effectué sur une goutte de sang récupérée à la queue de chaque animal à J1, J2, J3, J5, J7, J10 (quelques secondes par animal). Pour évaluer les propriétés immuno-oncolytiques des vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales (quelques minutes par animal). Le traitement des tumeurs est effectué par des injections intratumorales, intrapéritonéales, intramusculaires, intradermiques ou intraveineuses de vaccins recombinants contre la rougeole (quelques secondes par animal). Les vaccins candidats sont inoculés (quelques secondes par animal) une ou deux fois par semaine pendant un maximum de 10 semaines.
Impact sur les animaux
Pour évaluer l'efficacité des vaccins recombinants, certaines souris seront confrontées à des épreuves infectieuses par des virus humains pathogènes ou non chez les souris contrôles, ainsi que par le parasite du paludisme murin Plasmodium berghei, également pathogène. Selon l'agent testé, l'infection peut entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précédera la mort de l'animal. Pour évaluer les propriétés anticancéreuses des candidats vaccins, les souris seront greffées avec des cellules tumorales syngéniques qui peuvent entrainer des effets indésirables. En effet, la croissance des tumeurs chez la souris peut provoquer une gêne ou affecter le comportement ou la locomotion. La tumeur peut s'infecter ou s'ulcérer.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternatives non-animales dans le domaine de la recherche préclinique sur les vaccins recombinants. En absence de telles alternatives, l'utilisation d'animaux vivants dans les procédures expérimentales est prévue pour atteindre les objectifs du projet. L'étude des réponses immunitaires des candidats vaccins nécessite l'utilisation d'un organisme vivant entier avec un système immunitaire développé. Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris IFNAR ou hCD46/IFNAR permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins.
Réduction
Pour appliquer le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous composons les groupes d’animaux « contrôles » de 4 souris et les groupes « test » de 6 souris. Ainsi deux souris sont épargnées à chaque test. Par la suite nous pourrons diminuer le nombre d’animaux à 4 dans les groupes « contrôle négatif » car, d’une expérience à l’autre, ces animaux contrôles reçoivent systématiquement le vaccin rougeole standard Schwarz et que la réponse des souris à l’immunisation est relativement homogène d’un animal à l’autre. Les groupes « test » sont composés de 6 souris, le nombre minimal d’animaux pour que les résultats soient statistiquement significatifs, comme validés par un bioinformaticien en interne. Le nombre de souris utilisées par groupe représente la moitié des normes utilisées dans l’industrie du vaccin. Nous pouvons appliquer cette réduction car nous observons des effets forts : réponses immunitaires présentes ou absentes ; protection d’épreuves infectieuses efficace ou non. Ces observations sont basées sur notre longue expérience (67 publications dans ce domaine).
Raffinement
Les animaux soumis à des procédures qui produisent une douleur ou une détresse minimale/transitoire seront suivis par une observation quotidienne. Lorsque les animaux subiront des épreuves infectieuses, ils seront également contrôlés quotidiennement. En effet, selon le pathogène utilisé, l’infection pourra entraîner une souffrance (fièvre, prostration, perte de poids, paralysie) qui précèdera la mort de l’animal. La mort des animaux comme point limite est strictement évitée. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une grille évaluation douleur stress inconfort sera utilisée pour noter la douleur et la détresse qui peuvent survenir chez les animaux exposés à des agents pathogènes connus pour provoquer des effets graves. Nous suivrons : 1) L'apparence générale (poil luisant/terne, hérissé, état d'embonpoint, perte de poids, rétrécissement des orbites oculaires, renflement du nez, changement de position des vibrisses. 2) Signes cliniques : respiration, posture, activité, fèces, pli cutané. 3) Comportement : comportement normal/agitation, mobilité, mâchonnement des barres, déplacement en cercle, saut arrière. Pour éviter au maximum la douleur et la détresse nous suivrons les recommandations suivantes : mise à mort en cas de score 2 et observation quotidienne si score >0. Un aliment enrichi sera ajouté et l'enrichissement de l’environnement sera amélioré dès le début des procédures des épreuves infectieuses.
Choix des espèces
Le virus de la rougeole (sauvage ou vaccinal) n’infecte que les primates, dont l’homme. Dans ce contexte et en premier choix, nous avons opté pour un modèle non-primate, mais présentant une organisation tissulaire et du système immunitaire proche de l’homme. Ainsi, un modèle de souris permissif pour la rougeole est utilisé pour étudier les réponses immunitaires aux candidats vaccins. Nous utilisons ces souris depuis de nombreuses années et avons publié un grand nombre d’articles décrivant leurs propriétés et leurs qualités dans ce contexte. Pour étudier les propriétés immuno-oncolytiques du virus de la rougeole, des modèles de greffe de tumeurs sont utilisés. Age moyen des animaux : 11 semaines +/- 4 semaines. Les animaux doivent être matures au plan immunologique. Par ailleurs les jeunes individus répondent mieux que les plus vieux. Enfin, il est inutile de laisser vieillir les animaux avant utilisation.
Caractérisation des fibroblastes infiltrant les tumeurs pulmonaires dans le modèle transgénique Kras/Tp53.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Vingt souris de réforme servent, sous anesthésie et sans réveil, à entraîner un geste technique au niveau du larynx, tandis que 88 souris porteuses de tumeurs pulmonaires, dans des procédures de souffrance sévère, sont suivies par imagerie sous anesthésie pour étudier les fibroblastes qui isolent la tumeur des lymphocytes. Le porteur indique surveiller poids et respiration, avec une mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour isoler et caractériser ces fibroblastes.
Objectifs
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par la chirurgie et la radiothérapie conduisent à des rémissions mais les stades métastatiques ont une faible survie. Les nouvelles approches par immunothérapie permettent de détruire les cellules cancéreuses en stimulant le système de défense immunitaire du patient (lymphocytes T). Ces nouvelles approches ont conduit à des résultats spectaculaires de rémission durable de tumeurs solides (mélanome et cancer du poumon principalement). Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (30% environ), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Une caractéristique fréquemment observée chez les patients ne répondant pas aux immunothérapies est l’exclusion des lymphocytes T des ilots de cellules tumorales. Maintenus à distance les lymphocytes T sont inaptes à détruire les cellules tumorales. Les fibroblastes associés aux tumeurs (CAF) semblent en partie responsables de cette exclusion en formant une barrière autour des ilots tumoraux. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo dans un modèle transgénique de tumeur pulmonaire chez la souris, les différentes populations de CAF et d’étudier leurs interactions avec les lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Pour cela nous avons choisi un modèle transgénique murin inductible de tumeurs pulmonaires qui permet d’étudier les interactions entre les cellules tumorales pulmonaires et le microenvironnement fibroblastique et immunitaire. Cette recherche fondamentale pourrait déboucher sur des applications cliniques en proposant des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et libérer les lymphocytes T afin qu’ils infiltrent les îlots tumoraux permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie.
Procédures
Tous les gestes techniques de ce projet sont réalisés sous anesthésie : - Induction de l’expression du transgène par administration à l’entrée de la trachée- réalisée sous anesthésie générale des souris transgéniques 108 souris sont concernées. Le geste n’est pas douloureux mais l’anesthésie générale est obligatoire pour garantir une immobilité de l’animal et l’accès au larynx. Durée de l'anesthésie : 20 minutes. - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour le suivi longitudinal des tumeurs pulmonaires par imagerie. Celle-ci est réalisée tous les 15 jours à partir de 8 semaines post induction : 3 imageries maximum pour le temps précoce 10-12 semaines (44 souris concernées) et 8 imageries maximum pour le temps tardif 20-24 semaines(44 souris concernées). Durée de l'anesthésie : 10 min - Une anesthésie gazeuse des souris est réalisée pour l’administration intra-veineuse de lymphocytes T La cornée est protégée par un onguent durant l’anesthésie générale. Durée de l'anesthésie : moins de 5 minutes
Impact sur les animaux
Les souris inductibles élevées n’ont pas de phénotype dommageable car le transgène ne s’exprime qu’après une étape d’induction. Cette induction dans les cellules épithéliales pulmonaires conduit au développement de tumeurs pulmonaires chez 100% des animaux en 3 mois. Les dommages sont causés par le développement des tumeurs pulmonaires qui induisent à long terme une perte de poids importante et une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces permet d’éviter la survenue de douleur en suivant la croissance des tumeurs par imagerie et par suivi du poids des animaux.
Devenir
Mise à mort pour les 20 souris de réforme utilisées dans la procédure sans réveil d’apprentissage de la technique d’administration au niveau du larynx afin de vérifier la qualité du geste technique. Euthanasie des 88 souris induites porteuses de tumeurs pulmonaires pour prélèvement post mortel des poumons et analyse
Remplacement
Ce projet est fondé sur ces observations préliminaires réalisées sur des tumeurs humaines. L’établissement d’un modèle de tumeur pulmonaire murine est indispensable afin d’isoler et de caractériser la fonction de ces CAF. Il sera complété par des approches alternatives ex vivo Seul un modèle in vivo permet de modéliser toutes les interactions cellulaires et d’apprécier l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés pour ce projet sera de 108 souris pour 5 ans. L'imagerie des animaux permet des analyses et un recueil de données longitudinales et donc contribue à la réduction du nombre d'animaux Les analyses cellulaires des CAF seront réalisées sur N=6 souris par temps (10-12 sem et 20-24 sem post induction) . Une caractérisation des CAF sera réalisée et une corrélation avec une exclusion des lymphocytes T des ilots tumoraux sera recherchée (test de correlation de Pearson) Le nombre de souris par groupe a été défini à minima tout en permettant une analyse fiable. Afin d’apprécier la reproductibilité des résultats obtenus l’expérience sera répétée une fois avec le même nombre d’animaux par groupe. 10 souris transgéniques porteuses de tumeurs pulmonaires seront nécessaires à chacun des temps afin d’obtenir suffisamment de CAF pour les analyses de single cell RNA
Raffinement
La bonne connaissance du modèle tumoral, un suivi adapté des points limites (suivi des tumeurs par imagerie et pesées des animaux) et la manipulation des animaux sans stress, sous anesthésie si besoin, par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum le stress et la douleur des souris. Les tumeurs seront mesurées par imagerie. Les animaux sont pesés 1 fois/sem. La grille de score jointe est appliquée pour confirmer le bon état général de l’animal. Les points limites plus spécifiques pour ce modèle sont une perte de poids>20% du poids à l’induction, une dypsnée..
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées qui reproduisent la physiopathologie des tumeurs humaines. Le modèle transgénique choisi ici reproduit la pathologie de certains cancers pulmonaires humains. De plus, de nombreux outils sont disponibles (anticorps, cytokines, souris transgéniques possédant des lymphocytes T spécifiques de tumeurs) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris transgéniques seront induites à l’âge de 3 à 4 mois pour l’expression du transgène et utilisées dans les procédures, 10 à 12 semaines ou 20 à 24 semaines post induction donc âgées de 6 mois à 12 mois. Souris adultes avec un système immunitaire mature
Production de souris humanisées pour le système immunitaire : modèle d’étude pour l’immunobiologie, les pathologies humaines et l’évaluation de traitements.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une souris qui montre une difficulté respiratoire dans les cinq à dix minutes suivant l'injection hydrodynamique est mise à mort. 3 260 souris profondément immunodéficientes vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : une irradiation, une injection de cellules souches sanguines humaines avant l'âge de neuf jours, l'injection hydrodynamique et jusqu'à huit prises de sang pour mesurer la part de cellules humaines dans leur sang. Le porteur cite parmi les effets une grande sensibilité aux infections, des dermatites et des tumeurs après l'irradiation. Les souris produites sont fournies aux laboratoires utilisateurs de la plateforme, 75 en moyenne par utilisateur et par an, pour être réutilisées dans d'autres projets.
Objectifs
L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite utilisées par ou en collaboration avec des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements.
Bénéfices attendus
Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).
Procédures
- irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes)
Impact sur les animaux
Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 pourront être inclus dans la procédure 2. Certaines souris issues de la procédure 1 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet ultérieure. Les souris issues de la procédure 2 pourront également être incluses, à la demande des utilisateurs de la plateforme, dans d’autres procédures qui seront décrites dans une demande de projet.
Remplacement
Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.
Réduction
Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).
Raffinement
La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+isolées dans des souriceaux nouveau-nés (
Validation d’une molécule ciblant un récepteur membranaire pour l’imagerie des tumeurs neuroendocrines 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit des greffes tumorales, dont une par chirurgie intrasplénique après laparotomie, des anesthésies répétées et des injections, pour valider une molécule d'imagerie des tumeurs neuroendocrines. Toutes les souris sont mises à mort à l'issue de chaque procédure pour analyser les tumeurs et les organes. Le porteur affirme que le recours à "l'organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité de la molécule.
Objectifs
Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.
Procédures
- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)
Impact sur les animaux
La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.
Remplacement
Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.
Réduction
Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe souscutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.
Choix des espèces
Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.