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Effets in vivo des inhibiteurs de DYRK1A sur la prolifération des cellules bêta du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
192 rats, dont des rats rendus diabétiques, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent pendant quatre semaines un inhibiteur par injection, voie orale ou patch, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires par section du bout de la queue et des tests métaboliques, avant d'être tués pour analyse du pancréas. Le projet vise une "preuve de concept" pour une molécule candidate contre le diabète. Le porteur n'attend "aucun effet indésirable" hormis la douleur des piqûres et des coupures de queue, et affirme qu'il n'existe "pas de méthode de remplacement".
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique associée à une diminution de la masse des cellules β du pancréas qui sécrètent l’insuline. La régénération des cellules béta est désormais considérée comme une stratégie thérapeutique de premier plan. Au cours des dernières décennies, des études ont été menée pour identifier les cibles moléculaires pouvant être modulées afin de restaurer la masse β cellulaire et parmi elles l'enzyme DYRK1A. Nous proposons d’étudier, in vivo, un nouvel inhibiteur de DYRK1A, plus puissant et plus spécifique que ceux actuellement disponibles pour la recherche et ayant comme particularité d’être actif sous différentes voies d’administration ( intra-péritonéale, transdermique et orale). Durant 4 semaines nous administrerons, selon ces trois voies, deux doses de cet inhibiteur à deux modèles animaux, le rat Wistar non diabèrique et le rat Goto Kakizaki ( GK) diabétique. Nous analyserons par des tests in vivo l'évolution de la glycémie et de l’Insulinémie. Enfin, à l’issue des traitements, les animaux seront sacrifiés et une étude par des approches d'immunohistochimie sera menée pour analyser les aspects structurels et fonctionnels du pancréas .
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera la livraison d'une preuve de concept solide indiquant que l’inhibiteur EMD92 est un candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée sur les patients diabétiques. En plus de construire une meilleure connaissance de l'implication de DYRK1A dans la régulation de la croissance des cellules β au cours du diabète, des résultats positifs sur les rats diabétiques GK nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique « curative », capable de prévenir la progression du diabète, grâce à la restauration d'une masse cellulaire β fonctionnelle
Procédures
Dans ce projet des rats mâles Wistar et GK âgés de 8 semaines recevront les molécules d'intérêt selon 3 voies d’administration et durant 4 semaines : -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront une injections intrapéritonéales (IP) 1 jour sur 2, -32 rats Wistar et 32 rats GK recevront par voie orale (dans l’eau de boisson) -32 rats wistar et 32 rats GK recevront par diffusion transdermique (par patch). Un prelèvement de sang de 10 microlitres sera réalisé une fois par semaine jusqu'a la fin du traitement. A l'issue du traitement tous les animaux ( 96 rats wistar et 96 rats GK) subiront des tests métaboliques durant lesquels il recevront une injection soit de glucose pour mesurer la tolérance à cette molécule, soit d'insuline pour etudier leur sensiblité à cette hormone. Au cours du test de tolerance au glucose 4 prélèvements de sang seront faient de chacun 10 microlitres.
Impact sur les animaux
Les molécules étudiées ne sont pas censé induire de toxicité, aucun effet indésirable n’est donc attendu sur les animaux. De plus, ces molécules ne pouvant pas traverser la barrière hémato-encéphalique, aucune neurotoxicité ne devrait être observée. Par contre de legers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure d'aiguille lors de l'injection en intrapéritonéale des molécules, du glucose et de l'insuline pendant les tests in vivo ainsi qu'à la coupure de l'extrémité de la queue lors des prelèvements de sang.
Devenir
Aprés le traitement à l'EMD tous les animaux sont gardés en vie. Aprés les tests métaboliques les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Pour ce projet il n'existe pas de méthode de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d'appréhender les paramètres structurels du pancréas, à savoir les interactions entre les cellules bêta et les cellules acinaires/canalaires qui entrent dans la constitution du pancréas. Le choix du rat Wistar et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'il présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme
Réduction
Nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur. Les résultats seront analysés et validés par des tests statistiques adaptés : Mann-Whitney, Wilcoxon ou Anova (différences significatives P
Raffinement
Pour le traitement nécessitant une injection ainsi que pour les tests in vivo, les animaux sont préparés à la contention par les expérimentateurs. La douleur liée à l'injection est celle du niveau d'une piqure de l'aiguille. Ces méthodes sont en accord avec la classe lègère des procédures.
Choix des espèces
Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'Homme. Les rats seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines. A cet âge, les rats GK développent le diabète et les cellules béta du pancréas sont altérées. Le traitement à l’EMD92 a pour but de rétablir cette défection en augmentant la masse béta cellulaire. Pour les rats Wistar, le traitement à l’EMD92 indiquera l’effet de la molécule sur les cellules béta d’un pancréas sain.
Evaluation d’un nouveau type d’aiguille pour la technique d’ablation percutanée par micro-ondes permettant la destruction de lésions tumorales rénales et hépatiques sur modèle porcin
- Recherche appliquée
- Cancers
5 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués sans réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal subit huit ablations par micro-ondes, quatre au foie et quatre aux reins, avant d'être tué pour mesurer les volumes détruits. L'objectif est de vérifier les tables d'un fabricant d'aiguilles d'ablation, établies jusqu'ici sur des tissus cadavériques. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit la perfusion des tissus vivants et juge "nécessaire" de travailler sur animal vivant.
Objectifs
Les techniques d’ablation percutanée permettent la destruction de lésions tumorales par une approche mini-invasive. L’ablation par micro-ondes présente plusieurs avantages par rapport aux autres techniques aussi bien au niveau des effets indésirables pour les patients que pour la facilité d’utilisation pour le praticien. Le principe de l’ablation par micro-ondes est de déposer localement une énergie qui induit une agitation moléculaire et donc une élévation de température significative entrainant alors une destruction cellulaire, afin d’obtenir un volume d’ablation contenant l’intégralité de la lésion plus une marge de sécurité. Pour cela, deux paramètres, la puissance et la durée d’application, sont adaptés au volume d’ablation souhaité. Il est donc nécessaire de disposer de tables fiables permettant de prévoir le volume d’ablation selon les valeurs de ces deux paramètres. La plupart des fournisseurs ne proposent que des tables basées sur des études expérimentales cadavériques, or la perfusion tissulaire (processus qui alimente les organes en nutriments et oxygène nécessaires à son activité) peut entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés et de s’assurer de la conformité et de l’absence de variabilité entre les volumes d’ablation étalonnés par le constructeur et les volumes d’ablation réels. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est le 6ème cancer le plus fréquent au monde et de la 2ème cause de mortalité par cancer. Le cancer du rein est le troisième cancer des voies urinaires et génitales. La technique d’ablation percutanée par micro-onde permet de traiter avec efficacité ces deux cancers. Elle est particulièrement adaptée pour les patients fragiles chez qui la chirurgie est délicate. La précision du volume d’abblation obtenu est essentiel. L’objectif de l’étude est de déterminer les volumes d’ablation réels que ce nouveau type d'aiguille permet d’obtenir au sein de foies et reins perfusés. Cela permettra de s’assurer que les tables mises à disposition par le fabricant et établis à partir de modèles cadavériques sont conformes avec la réalité. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades de tumeurs rénales et hépatiques le traitement le plus adapté.
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgiques. A l’aide d’un guidage échographique , l’aiguille permettant de déposer localement l’énergie micro-ondes sera introduite en percutanée dans les zones à traiter : foie ou reins. Quatre ablations percutanées hépatiques et quatre ablations rénales (2 par rein) seront réalisées sur chaque animal avec différents paramètres (puissance et durée d’application). Une échographie de contraste sera réalisée à la fin du traitement pour évaluer la zone d’ablation. A la fin du traitement des 8 zones, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes traités pour les analyser.
Impact sur les animaux
La procédure se fait sous anesthésie et analgésie et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu au cours de ce projet.
Devenir
Les 5 porcs du projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs foie et reins pour les analyser (mesure du volume de l’ablation et degré de nécrose).
Remplacement
Des études préalables pour évaluer la technique ont été faites sur modèles animaux cadavériques. Il n'existe pas de modèle in vitro ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter la perfusion tissulaire pouvant entrainer un refroidissement et donc une réduction du volume d’ablation. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant.
Réduction
Un minimum de cinq animaux sera nécessaire pour évaluer la reproductibilité des volumes par type d’application (puissance / temps de traitement). Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs applications (8 au total) seront réalisées sur le même animal car le foie et les reins du porc sont suffisamment grands pour le permettre.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum 7 jours avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire, dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. le personnel animalier observera deux fois par jour le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale et sous antalgiques pour éviter des souffrances à l’animal.
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car la taille, l'anatomie et la physiologie de ses organes (foie, reins) sont comparables à celles de l'homme. Les animaux auront un poids d'environ 70 kg et auront entre 4 et 5 mois pour avoir une taille d’organes comparable à ceux des humains.
Optimisation de combinaisons de radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie pour un modèle murin de tumeur cérébrale orthotopique
- Recherche appliquée
- Cancers
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée par chirurgie stéréotaxique, puis elles reçoivent radiothérapie, chimiothérapie et immunothérapie, avec un suivi par imagerie et des prélèvements sanguins, avant mise à mort. Le projet cherche à optimiser des combinaisons de traitements contre le glioblastome, dont le porteur rappelle la médiane de survie d'environ treize mois. Il juge "indispensable" de tester ces combinaisons et n'envisage qu'une étude in vivo à ce stade.
Objectifs
Les nouvelles techniques de radiothérapie (RT) permettent de délivrer des traitements hypofractionnés (avec des fractions de 3 à 15-20Gy) tout en évitant de fortes toxicités radio-induites. Depuis plusieurs années il est décrit dans la littérature que la radiothérapie modifiait le microenvironnement tumoral. La description de ces mécanismes a entrainé un intérêt à associer la RT à des immunothérapies. Cependant, jusqu’à récemment l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire n’était pas connu. L’objectif de ce projet est de décrire la réponse immunitaire radio-induite selon le fractionnement de la radiothérapie et la combinaison avec des chimiothérapies et/ou immunothérapie, pour un modèle de glioblastome orthotopique afin de pouvoir optimiser les combinaisons de traitements.
Bénéfices attendus
Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005. Pourtant cette pathologie présente une incidence de 3/100 000 habitants et la médiane de survie des patients est d’environ 13 mois. Il est donc indispensable de développer/tester de nouvelles combinaisons de traitements dans le but de les évaluer rapidement via des essais cliniques. Les combinaisons de radiothérapie et immunothérapie sont de plus en plus développé en essais cliniques pour d’autres localisations que des tumeurs cérébrales. Ces combinaisons semblent plutôt bien tolérées et pour plusieurs indications les premiers résultats sont très encourageants. Les résultats obtenus dans ce projet permettront de proposer une combinaison de RT + immunothérapie +/- CT optimisé sur le schéma de fractionnement de la RT et son effet sur la réponse immunitaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure de chirurgie stéréotaxique pour implantation de cellules tumorales, puis 7 jours plus tard à un traitement par radiothérapie (1 ou 4 fractions espacées de 24h - non invasif sous anesthésie) et/ou chimiothérapie (per os 5 fois par semaine pendant 3 semaines et/ou immunothérapie (intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines). Le volume tumoral sera suivi par IRM ou imagerie optique à J7, J14, J21 (procédure non invasive sous anesthésie). 150 µL de sang sera prélevé à J0, J7, J14 et J21 sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances / effets indésirables peuvent provenir de trois éléments du protocole : 1) la procédure de chirurgie intra cérébrale par technique de stéréotaxie ; 2) la radiothérapie intracérébrale ; 3) la croissance tumorale intra cérébrale. 1) La chirurgie stéréotaxique pour l’implantation des tumeurs sera réalisée selon la procédure enseignée par l’université de Strasbourg lors du DU de chirurgie intra cérébrale, et déjà utilisée par nos collaborateurs qui se sont proposés pour nous assister pour les premières injections. Une étude pilote de 10 souris est prévue afin de pouvoir affiner si besoin les points limites détaillés dans ce protocole. Ces souris bénéficieront d’un suivi plus fin (notamment durant les heures post-opératoires….). Les effets indésirables potentiels attendus lors de la procédure de chirurgies, sont: une hypothermie post opératoire, une infection post opératoire, des signes de douleurs, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions. 2) Concernant la procédure de radiothérapie externe, peu d’effets indésirables sont attendus puisque ce traitement sera délivré en plusieurs faisceaux et avec une précision qui permet de délivrer la dose souhaitée sur la tumeur tout en évitant la dose reçue aux organes à risque avoisinants. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. 3) Enfin une tumeur intra cérébrale de taille trop importante peut entrainer des symptômes tels qu’un comportement atypique, et d’éventuels signes neurologiques comme amaurose, ataxie, parésie, syndrome vestibulaire, convulsions ainsi qu’une perte de poids ou une douleur. Si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids de plus de 20%, cf tableau annexe), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : -Les animaux dont la greffe n’aura pas prise -Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude -Euthanasiés si points limites atteints L’ensemble des souris seront euthanasiées de la même manière : dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane.
Remplacement
A ce stade de nos connaissances, seule une étude in vivo sur des modèles animaux syngéniques (animaux pour lesquels une greffe de cellules cancéreuses d’origine murine pourra former une tumeur) de développement tumoral permettra d’analyser l’effet de l’inhibiteur de PAR1 (traitement en développement) seul et/ou combiné à la radiothérapie et/ou chimiothérapie et/ou immunothérapie sur l’efficacité thérapeutique et la réponse immunitaire. De plus, notre étude repose sur l’effet de la radiothérapie hypofractionnée (forte dose administrée à en 1 ou 4 séances) sur le recrutement de cellules immunitaires au sein de la tumeur (selon les cellules présentes elles peuvent accélérer ou ralentir l’efficacité de la radiothérapie). Le modèle animal est le seul permettant de tels objectifs impliquant la présence de plusieurs types de cellules dans une tumeur.
Réduction
Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus sur l’étude du système immunitaire dans l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales (avec évaluation de la croissance des tumeurs et/ou de leur composition en différents types de cellules au cours du temps après traitement). Dans une démarche de Réduction, les quantités de cellules injectées ainsi que les coordonnées stéréotaxiques utilisées pour les injections seront celles optimisées par nos collaborateurs de ce projet qui ont testé cette année plusieurs conditions et fixé les conditions optimales d’injections. Ces échanges de protocole au sein d’une collaboration nous permettent d’éviter de répéter ces étapes d’optimisation et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser, notamment dans l’étude pilote de la procédure N°1. La prise tumorale dans des souris sélectionnées est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires (pour garantir des volumes de tumeurs homogène au moment du traitement) au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris (qui se sont initialement développées dans les mêmes types de souris) permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité et la fiabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat (trois expérimentations indépendantes).
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages (ayant une surface de 800 cm2 (425 x 266 x 185 mm)) de 10 individus en présence d’enrichissement. Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées sans anesthésie en intra péritonéale ou en par voie orale selon les formulations des médicaments. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids (cf tableau annexe Points limites)), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur (transplantation, irradiation) seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris seront observées quotidiennement et la croissance des tumeurs évaluée régulièrement. Les symptômes seront gradés à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de la douleur, poids…) et l’animal pris en charge selon le score obtenu (traitement de la douleur si nécessaire). Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% (8+2 souris/groupe) d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Souris de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.
Validation de l’efficacité antitumorale du ZZW-115 et ses dérivées dans des modelés du cancer pancréatique spontané
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer du pancréas vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant huit semaines pour tester une molécule anti-tumorale, la ZZW-115, et ses dérivés. Le porteur décrit des signes possibles de cyphose, de prostration, de poil hirsute et de perte de poids, et prévoit la mise à mort avant l'apparition d'un phénotype trop dommageable. Sur le remplacement, il affirme qu'un modèle proche de l'humain est indispensable et qu'il ne peut se passer de l'animal vivant.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer très meurtrier. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents efficaces basés sur la nanotechnologie pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, un analogue de la trifluopérazine (ZZW-115) et des dérivées sont été développé et s'ont avéré très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs ont été obtenu in vitro qui montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire de plus de 50 lignées cellulaires différentes. De plus, nous avons obtenu des résultats prometteurs in vivo qui montrent une réduction significative de la croissance tumorale de xénogreffes obtenues après implantation de cellules tumorales humaines (MIAPaCa2 ou Hep3B) sur des souris NUDE. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique, NUPR1. Cependant, nos résultats ont été basés sur des modèles de xénogreffes et jamais sur des modèles spontanés, qui se rapprocheraient davantage de la réalité du patient. En ce sens, nous avons deux objectifs avec ce projet, d'une part évaluer le pouvoir de cette famille de molécules comme agent préventif, pour cela nous utiliserons des souris avec la mutation Pdx1-Cre;KrasG12D/+, qui développent des lésions précancéreuses : les PanINs. Notre objectif est d'évaluer si le traitement à partir de l'âge de 5 semaines réduit l'apparition de ces lésions chez les souris traitées avec le ZZW-115 ou ses dérivés. D'autre part, notre objectif est d'évaluer si ce groupe de molécules a un effet curatif dans des modèles d'adénocarcinome pancréatique spontané. À cette fin, nous utiliserons le modèle KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), l'un des modèles les plus précis qui récapitule le plus fidèlement la carcinogenèse telle qu'elle se produit chez les patients. Dans ce cas, nous allons évaluer si le ZZW-115 et ses dérivés ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, notre objectif est de déterminer si le ZZW-115 (et deux de ses dérivés) est efficace dans le traitement de l'hypertension artérielle. 1) prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. Par le passé, notre groupe de recherche a démontré que l'apparition des PanINs était liée à la présence de NUPR1, c'est-à-dire que chez les souris KO de NUPR1, même en présence de l'oncogène Kras, les lésions précancéreuses n'apparaissaient pas. En ce sens, notre objectif est de démontrer qu'avec des inhibiteurs pharmacologiques, nous pourrions prévenir l'apparition de lésions prénéoplasiques. 2) étudier l'effet du ZZW-115 et de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) dans des modèles animaux de cancer pancréatique spontané. Dans le passé, nos études ont toujours été réalisées dans des modèles animaux avec des xénogreffes, cependant, ce modèle, bien qu'il présente de nombreux avantages, est insuffisant à plusieurs égards. Avec le modèle animal KPC (LSL-KrasG12D/+ ; LSL-Trp53R172H/+ ; Pdx1-Cre), un modèle qui récapitule plus fidèlement la carcinogenèse pancréatique chez les patients, nous pourrons déterminer si l'inhibition de NUPR1 par des inhibiteurs pharmacologiques a un effet anti-tumoral dans un modèle spontané et immunocompétent. 3) d'évaluer quel traitement, le ZZW-115 ou l'un de ses deux dérivés (ZZW-145 et ZZW-143) a un plus grand pouvoir antitumoral. Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.
Procédures
Les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution (véhicule ou traitement, 60 microlitres) par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 8 semaines (chaque jour). L’intervention dure 15-20 secondes.
Impact sur les animaux
Les premiers signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, poil hirsute, diminution du poids de l’animal. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris NUDE dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que le ZZW-115 n'a montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse (4% isoflurane, 3 - 5 minutes). Le sang, les tumeurs et les organes seront ensuite prélevés en vue des analyses biochimiques et histologiques pour l’évaluation de l’effet anti-cancer et la toxicité éventuelle. Les cadavres seront stockés dans un congélateur à -20°C en attendant leur évacuation par la société spécialisée dans le traitement des déchets biologiques.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le ZZW-115 et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 96 individus (4 groupes de 12 souris KIC et 4 groupes de 12 souris KC) conformément à la règle de réduction.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution contenant le ZZW-115 sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%. Aucun animal ne faisant pas partie de l'étude n'est maintenu avec un phénotype dommageable. Les souris sont sacrifiées avant l’apparition de ce phénotype dommageable
Choix des espèces
Les souris sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées. Les animaux KC seront utilisés à 6 semaines, juste avant l'apparition des lésions précancéreuses, pour évaluer l'effet protecteur du ZZW-115 et de ses analogues. Les animaux KPC seront utilisés à partir de 10 semaines, lorsque des lésions précancéreuses se seront développées, pour évaluer si le ZZW-115 et ses analogues sont efficaces pour inhiber la progression des tumeurs.
Développement d’une sonde théranostique ciblant les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, des traitements par injection et des séances d'imagerie sous anesthésie, la radiothérapie pouvant provoquer une nécrose de la tumeur, avant d'être tué pour prélever la tumeur et les organes voisins. Le porteur prévoit une grille de score entraînant la mise à mort au-delà de six points ou d'un volume tumoral de 1 500 mm3. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la réponse immunitaire à la radiothérapie impose le recours à l'animal.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. L’impact du microenvironnement tumoral, notamment la présence de cellules immunitaires agressives, sur le développement tumoral est aujourd’hui clairement établie. La présence de ces cellules immunitaires (e.g. les lymphocytes T régulateur (Treg)) favorise l’échappement tumoral qui promeut le caractère agressif et invasif des cancers. L’objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes théranostiques (combinant des propriétés d’imagerie et de thérapie) pour évaluer la présence de ces cellules immunitaires au sein des tumeurs au court de divers traitements (radiothérapie, immunothérapies…), et également cibler spécifiquement ces cellules pro-tumorales dans le cadre de stratégies thérapeutiques (e.g. radiothérapie interne vectorisée). Cela permettra d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen non-invasif d’imagerie moléculaire.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux agents d’imagerie permettra à terme de réaliser ou affiner le diagnostic chez l’homme mais également de suivre l’efficacité des traitements tout en utilisant des méthodes non invasives. Ce projet aboutira également au développement de traceurs théranostiques permettant une utilisation diagnostique et thérapeutique ciblant les Treg, acteurs majeurs de l’agressivité tumorale, de l’invasion métastatique et de la résistance aux traitements.
Procédures
Les animaux subiront des injections de cellules par voie sous-cutanée (injection unique, 5 minutes sous anesthésie). Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie intrapéritonéale ou intraveineuse (injections quotidiennes sur 15 jours maximum, 15 secondes de contention maximum par animal). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (SPECT/CT, session d’imagerie de 45 minutes sous anesthésie maximum répétée une fois par semaine sur 8 semaines maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de tumeurs seront observés quotidiennement et suivis 3 fois par semaine depuis l’implantation des cellules. La pousse tumorale en SC peut occasionner une gêne à la mobilité qui sera évaluée. La radiothérapie peut entrainer l’apparition d’une nécrose tumorale de surface. Généralement cette nécrose est « sèche » et n’est pas associée à de la douleur. Cependant si cette nécrose était responsable de douleur (évaluée par palpation de la tumeur nécrosée) et /ou une taille de tumeur supérieure à 1500 mm3 les souris seraient sacrifiées. Les observations faites lors de la procédure 1 permettront d’adapter les points limites pour les procédures suivantes. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures. Les critères d’arrêt du protocole par rapport à la souffrance et les points limites seront déterminés suivant le tableau en annexe 1. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera sacrifié. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.
Devenir
L’analyse du microenvironnement tumorale nécessite le prélèvement de la tumeur et des organes avoisinants. L’analyse de la biodistribution des différents traceurs radioactifs nécessite également le prélèvement de différents organes justifiant ainsi le recours à l’euthanasie de tous les animaux inclus dans ce projet.
Remplacement
Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la radiothérapie sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)
Réduction
En comparaison avec une étude de « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant.
Raffinement
Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Enfin, la totalité des procédures d’imagerie impliquant les animaux (injection intraveineuse, sous-cutanée et imagerie) sera réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante pour réduire l’inconfort potentiel à son minimum permettant ainsi le RAFFINEMENT de l’étude.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permet, sur un nombre d’animaux relativement réduit, de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques des souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. C’est pourquoi les tumeurs CT26 ou 4T1 seront greffées sur des souris Balb/c et les tumeurs MC38 sur des souris C57Bl/6. Des souris de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel > 20 g seront utilisées.
Développement de vaccins thérapeutiques HLA universels contre les cancers
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 132 souris transgéniques humanisées pour des molécules HLA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales sous-cutanées répétées et des prélèvements de sang à la veine sous-maxillaire, avant d'être tuées pour prélever la rate et d'autres organes. Le porteur vise un vaccin peptidique dit universel censé couvrir plus de 80 % de la population mondiale, un bénéfice renvoyé au développement futur. Sur le remplacement, il affirme que la réponse immunitaire après vaccination ne peut être reconstituée hors d'un "organisme entier" et juge "indispensable" le recours aux souris transgéniques.
Objectifs
Une avancée majeure dans le traitement des cancers a été réalisée au cours de ces dernières années grâce à l’utilisation de l’immunothérapie. L’immunothérapie consiste à réactiver les cellules du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Bien que très efficace chez certains patients, une large proportion de personnes atteintes par le cancer ne répond pas à ces nouvelles thérapies (environ 80% des patients). De nombreuses études montrent à présent, que chez les patients traités par certaines immunothérapies, l’ajout d’une vaccination dirigée contre des cibles appelées «antigènes» présentes à la surface des cellules tumorales peut améliorer la destruction de la tumeur et induire une rémission ou une stabilisation des patients. Dans ce cas, l’efficacité de la réponse vaccinale dépend directement de la nature des antigènes sélectionnés pour cibler les tumeurs et de la capacité du système immunitaire à reconnaitre efficacement ces cibles tumorales. On appelle antigène toute substance capable de déclencher une réponse immunitaire visant à l'éliminer. Dans le cas des cancers, il s'agit le plus souvent de peptides (fragments de protéines) qui sont reconnus de manière spécifique par certains globules blancs, les lymphocytes T CD8 (étudiés dans le cadre de ce projet). Nous avons développé une méthode pour identifier des cibles tumorales très efficace pour détruire les tumeurs, consistant à activer le système immunitaire avec des antigènes bactériens très semblables à certains antigènes tumoraux. L’utilisation d’antigènes bactériens permet de réactiver une réponse immune similaire à celle pouvant exister lors d’une infection bactérienne et d’induire une réponse contre les tumeurs similaires à celle observée contre un pathogène étranger. Utilisés pour la vaccination des patients, ces antigènes bactériens semblables aux antigènes tumoraux pourraient devenir un nouvel outil pour le traitement des cancers. L’objectif de notre projet est de développer un vaccin thérapeutique efficace qui ciblerait la grande majorité de la population mondiale.
Bénéfices attendus
Les objectifs pour ce projet sont d'étendre nos connaissances scientifiques sur le mimétisme moléculaire peptidique à d'autres HLA et de développer un vaccin peptidique universel (pour tous).
Procédures
Les interventions auxquelles les souris seront soumises sont les suivantes pour la 1e procédure expérimentale (Immunisation par méthode prime-boost): • Vaccination par injection sous-cutanée : 2 injections à 14 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 3 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10 et 17 jours après la vaccination). Pour la procédure expérimentale n°2 (Cinétique de vaccination) : • Vaccination par injection sous-cutanée : 5 injections à 7 jours d’intervalle • Prélèvement sanguins sur animaux vigiles : 4 prélèvements (le premier 4 jours avant la vaccination, puis 10, 17 et 31 jours après vaccination)
Impact sur les animaux
Lors de l’immunisation des animaux et du suivi des cinétiques de vaccination, douleurs légères associées à une injection sous-cutanée et à des prélèvements de sang par voie sous-maxillaire (plaie réduite au point d’injection ou de prélèvement, œdème).
Devenir
Tous les animaux de cette procédure seront euthanasiés en fin d'expérience afin de pouvoir prélever leur rate et autres organes pour effectuer les analyses in vitro.
Remplacement
La mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination est un phénomène complexe. Cela implique la reconnaissance des antigènes par des cellules spécifiques et la collaboration de différents types cellulaires (lymphocytes T, B et cellules présentatrices d’antigène). L’efficacité de la réponse immunitaire est favorisée par de nombreux facteurs solubles provenant du microenvironnement dans lequel l’antigène est présenté. Ces particularités (collaboration de différents types cellulaires et microenvironnement) ne peuvent pas actuellement être reconstituées en dehors d’un organisme vivant. L’étude d’une réponse immunitaire après vaccination sur organisme entier ne peut donc être remplacée et n’a pas d’équivalent expérimental n’utilisant pas d’animaux. Il est donc indispensable d’avoir recours aux modèles animaux transgéniques pour le HLA humain pour récapituler ces interactions complexes antre cellules et microenvironnement afin de démontrer la mise en place d’une réponse immunitaire après vaccination. Ce projet ne vise pas à l’évaluation directe d’une réponse anti-tumorale chez l’animal. La vaccination sera réalisée chez des animaux non porteurs de tumeur.
Réduction
En amont, 2 étapes ont permis de réduire le nombre de peptide et d’animaux qui seront utilisés : 1/ Une analyse in silico et la réalisation de tests in vitro ont permis de sélectionner un nombre restreint de peptides vaccinaux immunogènes et de forte affinité pour les HLA ciblés. 2/ L’analyse in silico via l’outil en ligne tools.iedb.org/population/ a permis de déterminer que le ciblage de 3 HLA-A (parmi les 68 possibles) et 2 HLA-B (parmi les 125 possibles) permet une couverture de 80% de la population mondiale. La réduction du nombre d’animaux a été réalisée pour permettre d’obtenir un nombre suffisant de données pour répondre à la problématique. L’utilisation d’outils statistiques du calcul de puissance de test et de taille d’échantillons (https://biostatgv.sentiweb.fr/?module=etudes/sujets#), permet de définir un nombre minimal d’animaux de 12 par groupe, en considérant un seuil de significativité à p
Raffinement
Le bien-être des animaux étant primordial, les souris sont acclimatées au moins 7 jours avant le début de la procédure expérimentale. A réception, les souris sont hébergées par 7 maximum par cage pour les femelles et 6 maximum par cage pour les mâles. Les animaux seront maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (température, humidité, cycle jour/nuit), dans un espace suffisant, en groupe pour maintenir les interactions sociales, et avec un enrichissement environnemental permettant de répondre aux besoins physiologiques et comportementaux des souris (présence de petite maison permettant aux animaux de se cacher). Toutes les manipulations seront réalisées dans le respect de l’animal. Le temps de manipulation des animaux sera de plus réduit au maximum afin de réduire le stress des animaux et l’impact possible sur la réponse immunitaire. La procédure expérimentale (vaccination) est de classe de gravité légère et ne nécessite pas d’y associer un protocole d’anesthésie. Les prises de sang régulières seront effectuées afin de suivre l’évolution dans la circulation sanguine la reponse immunitaire, ce qui élève le niveau de la procédure à une classe modérée. Ces prélèvements de sang seront effectués à la veine sous-maxillaire, 1 fois par semaine (ou tous les 15jours), selon le chronogramme prédéfini (cf annexe). Un volume total prélevé inférieur à 10% du volume sanguin de l’animal (soit au total environ 100µL/semaine ou 200µL/15jours, pour une souris de 25g) sera effectué afin de ne pas causer de dommage aux animaux. Toujours pour le bien-être de l’animal, le prélèvement sera effectué par alternance sur les 2 côtés.
Choix des espèces
Le principe de la vaccination repose sur la présentation des antigènes par le système HLA chez l’Homme. Le système de présentation antigénique est différent d’une espèce à l’autre. Ainsi les antigènes reconnus chez la souris peuvent être très différents de ceux reconnus chez l’homme car présentés par des molécules CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) différents. Le vaccin final développé dans le cadre de ce projet représente un mélange de plusieurs peptides restreints par le HLA. Ce vaccin sera un vaccin HLA universel qui traitera une grande majorité des patients cancéreux (prédiction >80%) car ciblant les HLA du locus A et B les plus représentés chez l’homme (HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B35 et HLA-A2). Ce projet nécessite donc l’utilisation de souris dites humanisées transgéniques pour les différents HLA humains et parfaitement caractérisées pour leurs réponses aux vaccins peptidiques humains (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7 ou HLA-B35 restreint). Le modèle de souris transgéniques humanisées pour les différents HLA-A et HLA-B sont des modèles existants et relevant pour étudier l’immunogénicité de ces vaccins destinés à l’homme. Les études pourront être réalisées sur des souris adultes âgées au début de l’expérimentation de 7 jusqu’à 15 semaines, âge où le système immunitaire est mature et donc à partir duquel une réponse immunitaire peut être correctement évaluable. Pour chaque étude, des souris d’âges similaires seront utilisées (plus ou moins une semaine). En cas de variation de plus d’une semaine, les animaux seront répartis de façon équilibrée dans chacun des groupes afin d’assurer l’homogénéité des groupes.
Evaluation de l’activité anti-tumorale et/ou métastatique de composés sur différents modèles de greffe implantée chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
50 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 49 300 d'entre elles et sévère pour 700, afin de cribler des molécules anti-cancéreuses. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de fragments tumoraux sous la peau, dans la glande mammaire, la plèvre ou le sang, subissent parfois une résection de la tumeur, des gavages, des injections répétées et jusqu'à huit prélèvements sanguins. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer et provoquer des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires, et que la totalité des animaux est tuée à la fin de chaque étude parce que les tumeurs sont incurables. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ne modélise la dissémination métastatique dans un "organisme entier" et conclut que l'évaluation finale sur la souris est incontournable.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'identifier et de caractériser des molécules anti-cancéreuses
Bénéfices attendus
Le cancer demeure la première cause de mortalité en France. Même lorsque des traitements de première ligne existent, de nombreux mécanismes de résistance provoquent un échappement des tumeurs aux traitements administrés, les tumeurs métastasent et sur le long terme, rares sont les cancers curables définitivement. En effet, les nouvelles stratégies thérapeutiques telle que l’immuno-oncologie ne permettent de soigner que 20% des patients traités. Il a donc encore un énorme besoin médical pour pouvoir prendre en charge correctement ces patients. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, la compréhension de leur mécanisme d’action et la découverte de nouveaux traitements adaptés à chaque patient sont autant d’enjeux de ce projet. Les composés démontrant une activité anti-tumorale significative poursuivront leur phase de développement avec pour finalité l’évaluation en essais cliniques chez l’homme.
Procédures
implantation de cellules sous-cutanée (s.c.) : 1 fois 1 minute pour chaque animal /ou implantation de fragments tumoraux (granules) : 1 fois 5 minutes pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement du fragment tumoral (≤ 0.5 x 0.5 mm) dans le trocart et insertion sous cutanée. - Suture (agrafe)/ Ou implantation de cellules tumorales en intra-mammaire : 1 fois 1 minute pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement en décubitus dorsal, « ponction » de la glande et injection des cellules /Ou injection de cellules en intra-pleurale (i.pl) : 1 fois 5 minutes pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement en décubitus dorsal - Injection à travers la cage thoracique dans l’espace pleural gauche de la souris/ Ou injection de cellules en intraveineuse (i.v.) : 1 fois 1 minute pour chaque animal - Animaux vigiles - Introduction dans un cylindre de contention - Vasodilatation des veines latérales de la queue - Injection des cellules/ Randomisation : 1 fois 2 minutes pour chaque animal - Animaux vigiles - Contention manuelle - mesure de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse/ Identification : 1 fois 1minute pour chaque animal - Animaux vigiles - Contention manuelle - Entaille oreille/ Mesures des tumeurs au pied à coulisse : 2 à 3 fois 2 minutes par semaine pendant 3 à 10 semaines pour chaque animal/ Résection de la tumeur primaire (sous anesthésie générale) : 1 fois 5 minutes pour chaque animal - Anesthésie volatile - Positionnement en décubitus ventral - Resection de la tumeur primaire par incision au scalpel - Suture (agrafe ou colle chirurgicale) /Traitements : 1 à 3 fois (1 minute) par semaine pendant 3 à 10 semaines pour chaque animal soit, par gavage , par injection sous- cutané, par injection intrapéritonéale, par injection intra-musculaire, par injection intra-veineuse. les composés sont évalués en effet dose, avec 3 doses./ Prélèvements sanguins : 8 fois 1 minute pour chaque animal - Animaux vigiles - Ponction de la veine saphène ou - Introduction dans un cylindre de contention - Scarification de la veine caudale latérale/ Injection de thioglycolate par voie intra-péritonéale : 1 fois 1 minute pour chaque animal - Contention manuelle - Injection de buprénorphine - Positionnement en décubitus dorsal - Injection par voie intra-veineuse
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet les effets indésirables prévisibles chez l’animal peuvent être liés soit à la présence de la tumeur soit à l’administration du composé à évaluer. Le développement de la tumeur chez l’animal peut occasionner plusieurs types d’effets indésirables tel que des difficultés de déplacement liées à la localisation de la tumeur, la perte de poids, l’ulcération de la tumeur, des difficultés respiratoires (dans le cas de métastases pulmonaires). Dans le cas d’apparition d’ulcération sur la tumeur, afin de limiter sa progression, l’animal conserné peut être isolé de ses congénéres. L’administration de composés à visée thérapeutique peut induire de la toxicité qui se manifeste par da la perte de poids, de la douleur, de la prostration et dans les cas extrêmes, la mise à mort de l’animal est nécessaire.
Devenir
A la fin de chaque étude, la totalité des animaux sont mis à mort. En effet, tous nos animaux sont porteurs de tumeurs sous-cutanées ou de métastases incurables. Afin de ne pas provoquer de souffrance inutile liée à la présence d'une tumeur de plus en plus grosse ou liée à présence de métastases, les animaux sont mis à mort à la fin de chaque étude.
Remplacement
Les molécules évaluées dans ce projet, font au préalable l'objet d'une évaluation in vitro afin de d'assurer un premier crible. Seuls les composés ayant fait la preuve d'une efficacité dans ces tests sont ensuite évalués dans les modèles animaux. L'activité anti-tumorale ou métastatique d'un composé évalué in vivo peut résulter de son activité anti-proliférative, anti-angiogénique, pro-apoptotique, immunologique, etc… ou d'un mécanisme encore inconnu. Malgré les nombreux tests in vitro ou cellulaires disponibles capables de mimer une fonction de la biologie de la tumeur, aucun test in vitro à ce jour n'est assez complexe pour permettre de modéliser la dissémination métastatique et donc l'activité anti-métastatique ou l’impact du système immunitaire d'un composé dans un environnement aussi complexe que celui d'un organisme vivant tel que la souris. Par ailleurs la mise au point de thérapies ciblées nécessite la définition de biomarqueurs d’activité permettant de guider la sélection d’une sous-population de patients répondeurs au traitement. Seule l’utilisation d’un organisme entier intégrant la tumeur et son microenvironnement peuvent permettre une telle évaluation par la mise en place d’analyses ex-vivo. L'ultime étape de sélection d'un futur candidat médicament en oncologie en vue de son passage en développement clinique ne peut donc s'affranchir d'une évaluation in vivo sur la souris de laboratoire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les molécules candidates subissent un premier crible sur une série de tests in vitro et seules les molécules significativement actives dans ces tests sont évaluées chez l'animal. Afin que les résultats soient statistiquement robustes, des lots de 6 à 10 souris sont constitués, et, ainsi 10 à 12 souris par lots à constituer sont commandées pour le protocole. En effet, tous les protocoles d’évaluation de composés sont effectués après randomisation des souris en fonction du volume et de l’aspect des tumeurs. Cette étape, qui permet de constituer des lots statistiquement identiques au premier jour du traitement, est nécessaire à l’interprétation des résultats. Seuls les effets des composés seront mesurés. A ce stade et basé sur notre historique, au maximum 50% des animaux sont exclus de l’étude. Les résultats expérimentaux sont traités par des tests statistiques selon l’objectif expérimental. Chaque modèle fait l’objet d’une étude préliminaire sur un nombre réduit d’animaux (une vingtaine par souche) pour déterminer quelle souche de souris permet le meilleur rendement de greffe. Les animaux présentant des tumeurs non retenues sont euthanasiés et prélevés en vue d’études ex-vivo et ce dans le but de réduire le nombre d’animaux greffés non utilisés. Une tumorothèque est constituée pour l’évaluation des caractéristiques des tumeurs en fonction des projets.
Raffinement
Au cours de ce projet, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans des cages possédant un enrichissement tel que de la litière en sac Nespack et des copeaux de peuplier permettant la création d’un nid, des tunnels à l’arrivage, des bâtonnets en bois et des bâtonnets de coton. Les animaux sont visités tous les jours par du personnel formé et compétant. Les tumeurs sont mesurées 2 à 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse afin d’assurer un suivi du volume tumoral et les animaux sont pesés au minimum 2 fois par semaine afin d’assurer leur suivi pondéral. Dès la suspicion d’un signe de mal être, un suivi clinique quotidien est mis en place à l’aide d’une grille de score, afin de permettre la mise en place de soins palliatifs type buprénorphine si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal de référence en oncologie en raison de sa petite taille, de la facilité avec laquelle elle s’élève et se soigne, de sa disponibilité auprès de fournisseurs agréés, d’une génétique très étudiée et de la disponibilité de nombreux mutants et animaux génétiquement modifiés qui permettent d’adresser des questions particulières concernant le mécanisme d’action des composés et les biomarqueurs d’activité. Les différents fonds génétiques de souris permettent l’implantation de lignées tumorales sans rejet de greffe. La croissance tumorale rapide est également un atout dans les études d’évaluation de l’activité des produits testés. De plus, les modèles vivo d’étude de la dissémination métastasique reproduisent, selon la bibliographie disponible, la même distribution des métastases que celle observée chez l’homme. Les mécanismes liés à la formation de métastases sont similaires pour la pathologie humaine et murine Pour chaque modèle de greffe, la souche retenue est celle permettant un rendement de greffe supérieur afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Les animaux immunodéprimés sont réceptionnés au plus tôt à 5 semaines et correspondent donc à des animaux jeunes adultes sevrés. En effet la littérature abondante sur le sujet des greffes de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée décrit l'utilisation des modèles murins à partir de cet age. Les animaux immunocompétents sont réceptionnés au plus tôt à 8 semaines, en effet à cet age le système immunitaire des animaux présente un stade de maturation qui correspond aux besoins de nos expérimentations.
Etude de pharmacocinétique et de tolérabilité non-GLP chez le primate non humain après administration d’anticorps polyclonaux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
16 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit trois anesthésies profondes de deux heures et six prélèvements de sang sous anesthésie légère, pour évaluer la tolérance et la pharmacocinétique d'anticorps polyclonaux avant des études de toxicité réglementaires. Tous sont tués en fin de protocole pour un prélèvement de plusieurs organes. Le porteur revendique le macaque comme "l'espèce la plus représentative de l'homme" et affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier la pharmacocinétique d'un "organisme entier".
Objectifs
Notre société développe des anticorps polyclonaux glyco-humanisés. Deux d’entre eux sont en développement clinique de phase 2 et 3 en transplantation et dans la COVID-19. La bonne tolérance des anticorps polyclonaux glyco-humanisés chez l’homme a été démontrée et publiée. Deux autres anticorps polyclonaux glyco-humanisés dans le domaine de la cancérologie ont démontré leur efficacité dans des modèles murins précliniques. Des études de toxicité réglementaire GLP sont requises chez le primate non humain par les recommandations ICH (EMA/CHMP/ICH/646107/2008). En préalable à ces études et dans un souci de réduction du nombre d’animaux à inclure, il est nécessaire de valider l’innocuité d’une dose équivalente à la dose thérapeutique visée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués afin d’effectuer un bilan cardiaque/musculaire, hépatique/pancréatique, inflammatoire. Les animaux seront observés quotidiennement et soumis à une grille d’observation comportementale, afin d’obtenir un bilan cognitif primaire. Les prélèvements sanguins seront aussi utilisés pour déterminer la pharmacocinétique du produit, conformément aux recommandations ICH. Cette étude préliminaire permettra de valider la bonne tolérance de la dose présumée, de mettre au jour d’éventuels points d’alerte qui permettront de prévoir une surveillance accrue et plus exhaustive de ces paramètres, et de limiter l’étude de toxicité réglementaire à un simple groupe à cette dose.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider la tolérabilité d’une dose thérapeutique
Procédures
3 anesthésies profondes par animal (2h) avec prélèvements (2 anesthésies lors de l’administration du produit thérapeutique et la 3ème pour l’euthanasie), et 6 prélèvements sanguins sous anesthésie légère (15 min)
Impact sur les animaux
Les anesthésies profondes de 2h ainsi que les prélèvements de sang multiples sous anesthésie légère peuvent occasioner de l'inconfort, de la confusion et du stress pour les animaux au moment du réveil, pour autant elles permettent de diminuer ces effets d'inconfort, de confusion et de stress pendant les procédures, les rendant ainsi le moins traumatisantes possible pour les animaux par rapport à ces même procédures qui seraient effectuées sur animaux vigiles.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort, sous procédure complète d'anesthésie, en fin de protocole de gravité modérée pour prélèvement multi-organes post-mortem.
Remplacement
Cette autorisation de projet a pour objectif de valider la dose thérapeutique ciblée pour les anticorps polyclonaux XON, de manière à optimiser l’étude de toxicité réglementaire nécessaire à la constitution du dossier de demande d’autorisation d’essai clinique. Les études pré-cliniques réalisées montrent que le macaque est l’espèce la plus représentative de l’homme pour l’évaluation de la toxicologie de XON car la cross-réactivité cellulaire (TCR) est comparable. Ce genre d’étude nécessite l’évaluation au niveau des différents systèmes et appareils d’un organisme entier. A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la pharmacocinétique de nouveaux composés thérapeutiques permettant de remplacer l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque dose, le nombre d’animaux est réduit à son minimum soit 2 par dose, en raison de la variabilité interindividuelle, plus 1 animal par contrôle. De plus, chaque étude est divisée en 2 parties. Dans la partie 1 seule l’équivalent de la dose thérapeutique ciblée chez l’homme sera administrée. La dose forte ne sera pas admninistrée si une des précédentes doses à provoquer des effets indésirables graves
Raffinement
-De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale. Un traitement analgésique leur sera donné si nécessaire en fonction de la procédure. -Les anesthésies et traitements analgésiques donnés aux animaux sont adaptés selon les procédures. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des expérimentations et consiste en un examen clinique de l’animal selon une grille de signes notables, signes sévères et un arbre décisionnel. -Si des effets indésirables apparaissent dès la première injection, la seconde injection ne sera pas réalisée. -Les animaux sont hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur mode de vie en communauté, puis, au cours du protocole expérimental les individus sont hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. -Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement du milieu par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.
Choix des espèces
Le primate non humain, et plus particulièrement ici le macaque, représente une espèce animale de choix comme modèle animal pré-clinique, car proche de l’homme de par son anatomie et physiologie, son métabolisme, sa proximité phylogénétique et sa similitude avec le système immunitaire de l’homme. Seuls les PNH ont montré une cross-réactivité suffisante dans des expériences in vitro, en comparaison avec d’autres espèces (rongeurs, lagomorphes,…), et par rapport aux cibles humaines, cibles des anticorps thérapeutiques XON. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 8Kg) dont le système immunitaire est mature.
Etude de l’efficacité anti-tumorale de différents formats d’anticorps anti-B7-H3
- Recherche appliquée
- Cancers
10 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 950 dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent des injections répétées et des greffes de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, pour tester différents formats d'anticorps anti-B7-H3 en cancérologie. Le porteur indique que les greffes peuvent provoquer nécrose, saignement, ulcération et perte de poids, et que les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou en fin de protocole par dislocation cervicale. Il conclut au "besoin de nouveaux traitements innovants" et affirme que l'efficacité ne peut être évaluée que dans un modèle vivant, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 9 millions de décès. L’immuno-oncologie est aujourd’hui une approche thérapeutique prometteuse. Sa particularité n’est pas uniquement de cibler la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques mais aussi d’aider le système immunitaire à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. L’utilisation d’anticorps dans le traitement des cancers est l’une des stratégies approuvées et en continuel développement. Différents formats d’anticorps ont été approuvés en clinique : les anticorps monoclonaux présentant une action cytotoxique par ADCC via l’engagement des récepteurs Fc sur les cellules cytotoxiques (Rituximab, Cetuximab,…) ; les anticorps multi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices de l’immunité, favorisant l’élimination des cellules tumorales par les cellules immunitaires (Blinatumomab) ; les anticorps conjugués à un agent cytotoxique appelés ADC (Antibody Drug Conjugate) qui est libéré au niveau du site tumoral (Padcev, Enhertu..). Notre laboratoire travaille sur le développement d’anticorps thérapeutiques équivalents sur les formats monoclonaux (mAb), ADC mais également sur le format multi-spécifiques. Les anticorps multi-spécifiques développés par notre laboratoire engagent les cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale ainsi que les cellules tumorales (via un antigène tumoral). Dans le cadre de ce projet, l’antigène ciblé est une molécule que l’on retrouve exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigène ainsi qu’à la surface de cellules tumorales. Des anticorps de la concurrence, dirigés contre cette molécule, sont actuellement en cours d’évaluation clinique. Les premiers essais montrent des signes d’efficacité, ce qui nous conforte dans le choix de cibler cette molécule. L’objectif de ce projet consistera à évaluer chez la souris l’efficacité d’anticorps anti-antigène tumoral sous différents formats (ADCC, multi-spécifique ou ADC).
Bénéfices attendus
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, on dénombre plus de 9 millions de décès par an. Ce chiffre démontre le besoin de nouveaux traitements innovants. Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de l’efficacité anti-tumorale de nouveaux anticorps dans des modèles pré-cliniques, une meilleure connaissance de leur mode d’action et de leur potentiel d’efficacité en combinaison avec des traitements de références. Tout ceci afin d’amener ces anticorps dans des phases de tests cliniques sur des patients atteints de cancer. Le bénéfice à long-terme est le traitement et l’augmentation de l’espérance de vie de patients atteints de cancer exprimant la cible à la surface de leurs cellules tumorales.
Procédures
Pharmacodynamie / pharmacocinétique : a. 1 injection IV de composés thérapeutiques avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse. Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. 1 injection IP de composés thérapeutiques avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL. Test fonctionnel ex-vivo : a. 1 injection en IP de poly(I:C) avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL ; b. prélèvement de rate post-mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle sous-cutané (SC) : a. injection sous-cutané de cellules tumorales avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, une à deux injections SC par animal, volume ≤200 µL par injection ; b. prélèvement de tumeurs et/ou organes en post mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle intra-veineux (IV) : a. 1 injection intra-veineuse de cellules tumorales via veine caudale avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigile, volume ≤100 µL pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. prèlèvement de poumons et/ou foie post-mortem après dislocation cervicale ou surdosage chimique d’anesthésique. Test d’efficacité modèles SC et IV : a. injections IV de composés thérapeutiques ou de composés déplétant 1 population immunitaire avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL. A doses et fréquences variables. Si les injections IV sont réalisées via le sinus rétro-orbital, maximum de 1 injection par œil et par jour sera réalisé avec un maximum de 5 injections par œil ; b. injections IP de composés thérapeutiques ou de composés déplétant une population immunitaire avec aiguilles 30G 1/2 ou 26G, sur animaux vigiles. Doses et fréquences variables dans un volume ≤400 µL ; c. injections per os de composés thérapeutiques avec sondes de gavage, sur animaux vigiles. Volume ≤200 µL et pouvant aller jusqu’à 400 µL. A doses et fréquences variables. Etude de pharmacodynamie et pharmacocinétique + test d’efficacité dans modèles SC et IV : a. prélèvement de sang au sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume de sang prélevé par animal < à 7.5% du volume sanguin total par semaine. Si prélèvements à la fin de la procédure expérimentale, volume prélevé pouvant aller jusqu’à 600µL et l’animal sera sacrifié par dislocation cervicale avant réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux bien que répétés et/ou multiples, sont de gravité modérée. Cependant, les composés thérapeutiques injectés dans études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une toxicité dans les jours suivant l’administration. Celle-ci se traduisant par une perte de poids sur 4-5 jours. Les animaux revenant en phase de prise de poids et donc à un état général normal au maximum 7 jours après l’injection. Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèles sous-cutané peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, une nécrose importante et/ou saignement et/ou ulcération et/ou inflammation très importante, une tumeur altérant la mobilité des animaux, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme).
Devenir
Les animaux de la procédure 1, ayant subit un nombre répété de gestes techniques (injection et prélèvement), seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 2 doivent être sacrifiés pour prélèvement de rate post-mortem. Les animaux de la procédure 3 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de réduire les nuisances sur le bien-être des animaux et d’éviter tout effet indésirable. Les animaux exclus lors de la randomisation seront sacrifiés avant atteinte des points limites et pour certains un prélèvement d’organes/de sang sera effectué pour des analyses ex-vivo et de caractérisation du mode d’action du composé thérapeutique. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 4 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable.
Remplacement
Evaluer des stratégies d’immuno-oncologie implique d’être dans un système biologique complexe qui rassemble tumeur, environnement tumoral et système immunitaire. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro, il est nécessaire d’obtenir des preuves de concept chez l’animal dans le processus de développement d’anticorps thérapeutiques. Le remplacement des animaux est donc impossible à mettre en place du fait de la nécessité d’étudier l’efficacité dans un modèle vivo complexe, impossible à mimer in vitro.
Réduction
Le nombre nécessaire de souris a été calculé afin de couvrir les différentes études qui permettront d’investiguer les effets anti-tumoraux des anticorps développés par notre laboratoire et de fournir des résultats statistiquement significatifs. Les données obtenues pour chaque paramètre sur des animaux traités seront comparées aux données obtenues sur des animaux ayant reçu un traitement placebo et/ou traitement de référence et permettre ainsi l’évaluation précise de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre moyen de 10 souris par groupe a été préalablement déterminé sur la base des moyennes et déviations mesurées pour chaque paramètre. C’est le nombre minimum de souris nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement interprétables. Si plusieurs composés candidats ou plusieurs doses du même composé doivent être testés dans le cadre de la même série expérimentale, les groupes contrôles ne seront réalisés qu’une seule fois. Pour l’utilisation des souris transgéniques, animaux mâles et femelles d’âges différents pourront être utilisés, afin de réduire le nombre d’animaux générés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans la mesure du possible, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage en cours d’expérimentation, sinon un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. Les schémas d’injections des traitements de déplétion de populations immunitaires seront établis et l’absence de toxicité vérifiée lors de mise au point préalable sur un petit nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, des aiguilles de diamètre 30G 1/2 seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. Le poids des animaux sera suivi une fois par semaine. Certains composés thérapeutiques peuvent induire une perte de poids transitoire des animaux intervenant généralement entre 1 à 6 jours après le traitement. Lorsqu’une perte de poids sera initiée (10% de perte de poids), les souris seront pesées 3 fois par semaine. Dès l'atteinte de 15% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. De plus, dès l'atteinte de 15% de perte de poids, il sera ajouté de la nourriture humidifiée ou gélifiée, au fond de la cage, afin de faciliter l’accès à la nourriture. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou de volume tumoraux (classiquement deux fois par semaine). Si une tumeur commence à montrer des signes de nécrose modérée (inflammation importante et/ou croute), les souris seront surveillées tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif avec signe de nécrose modérée, les souris seront surveillées quotidiennement. De plus, si l’aspect général et le comportement de l’animal se dégrade (yeux plissés, oreilles rabattues, prostration, isolement) mais ne nécessitant pas son euthanasie, la surveillance des animaux sera réalisée tous les deux jours. Les points limites relatifs à la perte de poids, à l’apparence et au comportement des animaux, à l’aspect et aux volumes des tumeurs sont des critères qui justifieront l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La majorité des modèles animaux en immuno-oncologie ont été développés chez la souris. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité d’anticorps thérapeutiques et l’activation du système immunitaire. Des modèles murins de tumeurs solides et hématologiques sont à disposition dans différentes souches. Dans les souches de souris immuno-déficientes : xénogreffes pour tester le candidat médicament sur des cellules tumorales humaines. Le système immunitaire de ces souris bien que déficient, possède tout de même des macrophages ainsi que des cellules NK permettant l’évaluation de nos molécules. Dans les souches de souris immuno-compétentes : modèles syngéniques via la greffe de cellules tumorales murines exprimant l’antigène humain permettant ainsi de tester le candidat médicament en évaluant l’impact de la réponse immunitaire. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études auront un âge minimal de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est décrit comme mature.
Nouvelles associations thérapeutiques dans le traitement du cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du pancréas sous anesthésie, puis des gavages et des injections dans le ventre deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester une association de chimiothérapie et d'un inhibiteur de réparation de l'ADN. La tumeur est laissée croître jusqu'à un volume de 1 500 mm³, seuil déclenchant la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable dû au traitement" et conclut qu'aucune méthode alternative ne remplace ces expériences de preuve de concept in vivo.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de therapies sont proposées, seulement la gemcitabine et deux combinaisons de chimiothérapie (FOLFIRINOX et Gemcitabine/Nabpaclitaxel) sont disponibles. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie (présence d’un microenvironnement très dense) ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de surive des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement, dont des inhibiteurs de la réparation de l’ADN suite à des cassures induites par la chimiotherapie. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti tumorale de l’association du FOLFIRINOX, à un inhibiteur de réparation de l’ADN dans des modèles de co-culture cellules tumorales pancréatique et cellules du micro environement. L’efficacité de cette association est étudiée in vitro lors de test de viabilité et confirmé in vivo sur différents modèles de souris avec ou sans système immunitaire. Les mécanismes impliquées dans cette réponse anti-tumorale sont étudiées au niveau de la mort cellulaire, du dialogue (protéines) entre les différents types cellulaires et des cellules immunitaires. Ce projet, qui est important pour le devenir des patients atteints de cancer du pancréas, est réalisé en collaboration avec les services cliniques de l’ICM notamment la chirurgie et l’anatomopathologie
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré in vitro l’efficacité de l’association du FOLFIRINOX avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN (ATR) dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Il s’agit maintenant de démontrer cette synergie dans 2 modèles de souris nudes xénogreffées chacun avec une tumeur de cancer pancréatique issues de tumeur de patient (PDX : Patient-Derived Tumor Xenografts) et 2 modèles de souris immuno compétentes greffées avec une tumeur murine pancréatique, ces derniers modèles permettront de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie générale courte pour la procédure chirurgicale de greffe de PDX (15 minutes maximum / souris). Les traitements à raison de deux fois par semaine sur 4 semaines seront des injections intrapéritonéales ( 5 secondes/ injection/souris, contention comprise) et des gavages (10 secondes/gavage/souris, contention comprise). Les prélévements seront uniquement des prélèvement terminaux sur animaux eutanashiés.
Impact sur les animaux
De nombreuses études ayant déjà été élaborés dans notre institut et dans d'autres, nous maitrisons les doses administrées aux animaux et de ce fait n'attendons aucun effet indésirable dû au traitement. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.
Devenir
Les animaux en sortie de procédure 1 seront directement intégrées dans la procédure 2. A l'issue de celle ci les niamaux seront euthanasié et les tumeurs seront récupéré pour des tests d'immunohistochimie, immunophénotypage et western blot.
Remplacement
Ces associations de drogues ont montré une efficacité in vitro. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Des modèles précliniques sur souris immunodéprimées et compétentes sont impératifs pour valider l’efficacité de nos traitements, ceci afin d’envisager la translation vers la recherche clinique.
Réduction
D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux. L’analyse statistique sera réalisée avec une Unité de Biométrie. L’étude de l’effet des traitements sur la croissance tumorale permettra de faire deux types d’analyse. 1 : Modélisation de la croissance tumorale et comparaison entre les groupes en utilisant un modèle linéaire mixte. 2 : Analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre une taille de tumeur de 1500 mm3. Le point limite est donc une taille de tumeur de 1500 mm3. Les courbes de survie seront ensuite estimées par la méthode de KaplanMeier et comparées par le test du logrank. Pour confirmer le nombre de souris nécessaire, nous avons calculé la puissance statistique en utilisant le logiciel STATA 13. La puissance a été vérifiée en se fondant sur des hypothèses posées à partir de résultats in vivo et selon une des méthodes proposées par Frison et Pocock (1992) qui considère des résultats de mesures continues répétées. Sous les hypothèses alpha:0,05, delta:1,5 (à J17:moyenne du groupe contrôle attendu ~17 et moyenne du groupe traite attendu ~15,5), écart type : 1,6, la prise en compte de 8 mesures répétées, une corrélation de 0,5 entre ces mesures, et une taille d'échantillon égale a 10 pour chaque groupe, la puissance statistique estimée est de 80%.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée dans des conditions
Choix des espèces
Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés , et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymic nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétente gréffées avec une tumeur murine. Age 5 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe, et suffisamment âgées pour permettre une récupération dans les meilleures conditions après la greffe.
Biodistributions nouveaux de vecteurs radiomarqués sur des modèles tumoraux de souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et une injection intraveineuse de produits radiomarqués, puis une imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la distribution de nouveaux radiopharmaceutiques anticancéreux. Le porteur décrit l'arme du projet comme le radioélément destiné à détruire la cellule tumorale et affirme n'attendre aucune douleur. Il indique qu'aucune méthode alternative n'existe à ce jour pour cette pathologie complexe.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Divers radiopharmaceutiques élaborés par notre équipe serons testés : nous disposons de différents vecteurs et de différents radioéléments. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon «toxique» pour cette cellule. Le radioélément est lié à un vecteur spécifique de la tumeur afin de former un radiopharmaceutique, qui doit cibler et détruire la tumeur, tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. L’objectif de l’étude de la biodistribution de nos radiopharmaceutiques est d’appréhender leur distribution dans l’organisme au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre le développement de nouveaux radiopharmaceutiques ciblant les tumeurs, utilisables soit en thérapie soit en imagerie.
Procédures
810 souris vigiles reçoivent une injection sc de cellules tumorales (100µl) : douleur légère Ces mêmes souris vigiles reçoivent une injection iv de radiopharmaceutique dans la veine latérale de la queue : douleur légère. Puis elles sont anesthésiées sous isoflurane pour 10 minutes d’imagerie (dans cellule d’imagerie chauffante avec du gel de protection occulaire), sans douleur. A la fin de la cession d’imagerie les souris endormies subissent un prélèvement sanguin (200µl) dans le sinus orbital puis sont mises à mort. L'ensemble de la procédure durera 2 semaines à 3 semaines et demi. (pousse tumorale 2 à 3 semaines, biodistribution du traceur 72h maximum, imagerie 10 minutes).
Impact sur les animaux
Ce projet ne devrait pas engendrer de douleur. La procédure 1 : greffe de tumeur en sous cutané n’entraine pas de douleur. On ne laisse pousser la tumeur que jusqu’à 100mm 3 (équivalent d’un petit kyste sur le flanc qui n’entraîne pas de gène ni de douleur). La procédure 2 d’injection du radiopharmaceutique en iv pour la biodistribution n’est pas douloureuse. Enfin la procédure 3 d’imagerie TEP/CT sous anesthésie gazeuse et lit chauffant est sans douleur. Le prélèvement sanguin terminal est fait sur souris endormies et analgésiées avant leur mise à mort.
Devenir
Les 810 souris de la procédure 1 (greffe de cellules tumorales) sont toutes gardées en vie pour la procédure 2 (injection du radiopharmaceutique) et la procédure 3 (imagerie de la biodistribution du radiopharmaceutique injecté). Il s’agit des 3 étapes nécessaires pour quantifier la distribution du radiopharmaceutique dans la tumeur et les différents organes des souris.
Remplacement
Remplacer : la pathologie cancéreuse étant une pathologie complexe, il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives à l’expérimentation animale
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism.
Raffinement
L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. Par ailleurs, les animaux seront anesthésiés pendant la procédure 3.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. Les souris sont utilisées à 7 semaines, au stade jeune adultes.
Bivalimage: traceurs peptidiques bivalents pour le ciblage tumoral en imagerie nucléaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intraveineuses de traceurs radioactifs sous anesthésie, suivies d'imagerie et d'un prélèvement sanguin terminal, pour tester des peptides de ciblage du cancer de la prostate. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grâce à l'imagerie non invasive. Il indique recourir à des cultures cellulaires tant que possible et réserver la souris aux expériences in vivo.
Objectifs
Les tumeurs peuvent co-exprimer différents récepteurs, cibles de nouvelles stratégies de détection et traitements tumoral. Des peptides à deux parties distinctes peuvent se lier à ces différents récepteurs et présenter des avantages (meilleure affinité, rester plus longtemps sur la tumeur, augmenter les chances de visualiser le tissu malade indépendamment du stade de la maladie) par rapport à des peptides simples. Ainsi ce projet vise à étudier les propriétés de ciblage tumoral de ces nouveaux peptides, marqués par de la radioactivité, pour leur utilisation en imagerie et thérapie nucléaires.
Bénéfices attendus
Un peptide à deux parties, ciblant à la fois le récepteur de la gastrine (GRPR) et le récepteur membranaire spécifique de la prostate (PSMA) pourrait permettre de détecter puis de traiter une très large gamme de profils d'expression du cancer de la prostate (y compris les tumeurs PSMA négatives ou GRPR négatives) quel que soit le stade de développement de la maladie.
Procédures
Les animaux du projet seront soumis à différents actes, en premier lieu acte 1 des greffes de cellules tumorales au niveau sous cutanée réalisées sous anesthésie qui vont permettre une croissance tumorale pendant 7 à 8 semaines au cours desquelles tous les animaux recevront sous anesthésie des injections intraveineuses de radiotraceurs qui permettront un suivi des tumeurs par imagerie non invasive TEP/TDM et enfin suite à la dernière imagerie un prélèvement sanguin sous anesthésie sera réalisé suivi d'une euthanasie par une méthode réglementaire. L'acte 2 s'étalera au maximum sur 3 semaines. L'acte 3 aura lieu environ entre 7 et 8 semaines après l'acte 1 de greffe tumorale soit lorsque les souris auront entre 12 et 14 semaines.
Impact sur les animaux
D’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir d'effets indésirables attendus sur les animaux. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour des prélèvements post mortem.
Remplacement
Des cellules de cancer de la prostate en culture seront utilisées tant que les expériences le permettent et le modèle de souris de xénogreffe tumorale pour les expériences nécessaires in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux, 160 au total, sera limité au maximum par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Le nombre d'animaux a également été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive pour suivre des modèles in vivo uniques parfaitement décris dans la littérature (modèle de greffe sous-cutanée de cancer de la prostate).
Raffinement
Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maison de type igloo en plastique) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Pour chaque procédure, des points limites ont été fixés et des méthodes prévues (anesthésie) pour éviter toute souffrance ou douleur aux animaux, qui resteront sous surveillance tout au long du projet.
Choix des espèces
Des souris immunodéprimées sont utilisées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.