Cancers

3 328 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes puis leur greffe, pour chaque patient, ses cellules immunitaires et sa tumeur, afin de constituer des cohortes dites "avatars" servant à tester des traitements. Il indique que l'injection de cellules humaines provoque invariablement une réaction contre les cellules de la souris, avec perte de poids, de poils et de mobilité sur un à deux mois, les animaux étant mis à mort à un stade avancé pour récupérer les tumeurs. Sur la réduction, il se contente d'écrire que le nombre d'animaux "sera à évaluer au cours des expériences", justification sommaire pour un effectif de plus de trois mille souris.

Objectifs

Il est proposé d’utiliser un modèle de souris immunodéficiente afin de constituer, pour chaque patient atteint d’une tumeur, une cohorte de souris doublement humanisée/greffée (système immunitaire et tumeur) qui sera utilisée pour évaluer l’activité de thérapies, dans un délai compatible avec les contraintes cliniques, typiquement 1 mois. Les souris présentent des mutations entrainant une déficience en cellules immunitaires murines. Ces souris ont montré être des bons modèles de greffe de cellules tumorales humaines ainsi qu’un bon réservoir pour une reconstitution de système immunitaire humain. La mise en place d’une cohorte de souris porteuse de tumeur dérivée de patient (PDX) est un projet ambitieux à forte valeur ajoutée pour la recherche sur les cancers permettant d’évaluer l’activité des traitements les ciblant. Ces souris sont greffées avec des fragments de tumeur fraiche et la tumeur peut se développer dans l’environnement murin en absence de système immunitaire pouvant le reconnaitre comme étranger. Cependant, des obstacles sont présents pour optimiser l’établissement de cette cohorte : taux de prise de greffe des PDX très faible et/ou variable, temps avant apparition de la PDX (plusieurs semaines, voire mois), instabilité génétique amplifiée au cours des passages successifs des PDX dans une souris à l’autre et absence d’un système immunitaire autologue. Afin de palier à ces obstacles, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) du patient ainsi que des fragments tumoraux, du même patient seront greffés, dans les souris sans passer par l’étape d’établissement d’une tumeur macroscopique de type PDX classique. La détection précoce de ces cellules, par les techniques d’imagerie, permettrait d’évaluer l’efficacité des traitements afin de comprendre notamment les mécanismes de résistance mais aussi d’évaluer le traitement le plus efficace parmi le choix possible actuellement et dans un futur proche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer la pertinence et la corrélation clinique des réponses aux traitements chez le patient au regard de de la réponse observable dans la cohorte avatar aux patients. En cas, de corrélation positive, cela permettre d’obtenir une preuve de concept de la pertinence d’une méthodologie comme outil de diagnostic afin de proposer aux cliniciens le traitement le plus adéquat pour chaque patient, dans des contraintes temporelles acceptables pour les cliniciens et les patients.

Procédures

Injection de thérapie deux à trois fois par semaine sur animaux vigiles ou endormis, chaque injection demande une contention de 15 à 30 secondes ; Echographie une à deux fois par semaine sur animaux endormis, le temps d'acquisition par échographie (et donc de l'anesthésie) est compris entre 10 et 20 min par souris ; Prélèvement de sang une fois au cours de la procédure sur animaux endormis, le prélévement dure entre 15 et 30 secondes (l'anesthésie environ 3 minutes). La durée pendant laquelle les animaux subiront ces interventions sera de 5 semaines à 2 mois.

Impact sur les animaux

L’injection de PBMC humain dans une souris immunodéficiente entraine, invariablement, une réaction des cellules immunitaires humaines injectées contre les cellules murines reconnues comme étant étrangères. Cette réaction entraine une perte de poids des animaux, une perte de poil et une perte de mobilité des animaux dans un délai pouvant aller d’un mois à deux mois. A un stade avancé de la maladie, les animaux doivent être sacrifiés. Aucun autre effet indésirable n’est attendu notamment par l’injection des traitements.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort car les tumeurs doivent être récupérées

Remplacement

Les méthodes actuelles permettant d’évaluer l’efficacité de thérapie personnalisé sont inefficaces, actuellement, par absence de biomarqueur fiable, permettant de choisir le traitement le plus adapté à chaque patient.

Réduction

Le nombre de souris par groupe de traitement est évalué, en fonction de la variabilité des modèles animaux. Ce nombre sera à évaluer au cours des expériences en fonction de cette variabilité.

Raffinement

Le raffinement de l’étude est : surveiller les animaux pour l’apparition de la réaction immunitaire des cellules immunitaires humaines injectées vis-à-vis des cellules murines de l’hôte qui sera monitoré deux fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont les seules modèles animaux correctement validés ayant montrés une prise de greffe de tumeurs humaines et de système immunitaire humain. Les animaux seront des adultes à partir de 6 semaines, stade qui a montré de bons résultats pour prise de greffe tumorale et immunitaire.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes et leur greffe des cellules tumorales marquées par fluorescence, par injection sous-cutanée ou intraveineuse, pour suivre la croissance des tumeurs et leur capacité à métastaser. Il indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements, que la peau peut s'ulcérer en provoquant une douleur modérée et que des métastases au foie ou aux poumons peuvent dégrader l'état des animaux, tous mis à mort en fin de procédure. Il affirme que ces cellules doivent être implantées dans un "organisme entier" et que le modèle souris est "nécessaire".

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences de suivi de pousse tumorale chez la souris immunodéficiente à partir de cellules cancéreuses modifiées pour qu'elles expriment plus ou moins une protéine au niveau de leur noyau. La quantité présente de cette protéine dans les cellules jouerait un rôle dans le comportement des cellules cancéreuses. Ces cellules cancéreuses seront également marquées par fluorescence en fonction de la quantité de la protéine exprimée. Ainsi cette fluorescence nous permettra de visualiser les différents types de cellules cancéreuse et d'observer leur évolution dans les tumeurs. Nous nous intéresserons à la corrélation entre le type de cellules retrouvées dans les tumeurs, la vitesse de croissance des tumeurs et l'agressivité des cellules cancéreuses à travers leur capacité à métastaser.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l'impact du niveau d’expression de TRa1 sur la croissance des tumeurs. Nous pourrons étudier si ce niveau d'expression module la capacité de croissance, de migration ou de mort cellulaire ainsi que l’agressivité du développement tumoral. A terme, une meilleure compréhension des mécanismes du développement des cancers permettra de mieux adapter les traitements et/ou d'envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris du projet seront greffées avec des cellules tumorales marquées par fluorescence, soit par injection ou implantation sous-cutanée soit par injection intra-veineuse. Ces greffes se dérouleront sous anesthésie, l'opération ne durant que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées. Ces animaux, par leur système immunitaire défaillant, sont hébergés dans une pièce dédiée avec toutes les barrières sanitaires permettant de garantir leur bon état de santé pendant toute la durée de leur vie. Les souris subiront chacune une unique injection ou implantation de cellules tumorales. Les souris seront donc amenées à développer des tumeurs. Ces tumeurs pourraient éventuellement les gêner dans leurs déplacements. Si la peau venait à s’ulcérer au niveau d’une tumeur, cela provoquerait une douleur modérée à l’animal. Des métastases pourraient également apparaître, notamment sur le foie ou dans les poumons. L’état des souris pourraient alors se dégrader : amaigrissement, difficultés à respirer, troubles moteurs… Il y a 3 types possible d’injection dans ce projet ; une injection sous-cutanée au niveau du flanc, une injection intra-veineuse à la veine de la queue et une implantation sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux, des souris, seront mis à mort en fin de procédure. En effet, ils développeront des tumeurs sur le flanc et potentiellement des métastases. De plus, des analyses doivent être menées sur plusieurs de leurs tissus afin d'étudier la distribution des différents types cellulaires dans les tumeurs et d'analyses les organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité de plusieurs types de cellules cancéreuses à former des tumeurs et à métastaser. Pour cela, ces cellules doivent être implantées dans un organisme entier afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles elles se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est de 90 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet. Nous mesurerons pour chaque animal engagé le nombre de tumeurs primaires et métastases ainsi que leur taille.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin d'identifier au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. De plus, les procédures se feront sous anesthésie générale. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant toute la durée de l'anesthésie. Une couverture analgésique est mise en place afin de prendre en charge toute douleur potentielle qu'impliquerait l'implantation des cellules tumorales. Un développement tumoral est attendu, un suivi de poids et de taille des tumeurs sera réalisé 3 fois par semaine. Des points limite qui auront pour effet l'arrêt de la procédure ont été déterminés.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (inflammation et cancer du côlon). Nous avons l'expertise au laboratoire sur ce modèle animal et nos données précédentes sur le rôle de TRa1 dans des études in vivo ont été générées chez la souris. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. En effet, dans notre projet, les études de pousse tumorale ne peuvent se faire que dans des organismes complets prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte jeune.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules cancéreuses en sous-cutané puis administre un traitement par voie intrapéritonéale chaque jour pendant vingt jours, pour étudier le rôle d'une enzyme dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Comme pour un projet voisin du même laboratoire, il indique que les souris sont maintenues sans antalgique afin de ne pas modifier la croissance tumorale, tout signe de souffrance entraînant la mise à mort. Il affirme que l'effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être évalué qu'in vivo et que le modèle murin est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme scd1 dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse et l’importance de cette enzyme dans la résistance à l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

L’inhibition de l’activité Scd1 a montré une efficacité contre la progression tumorale. Cependant, cette réponse demeure limitée et la recherche de thérapies combinées à une thérapie anti-Scd1 pourrait améliorer la réponse. Nous attendons une réactivation bénéfique du système immunitaire anti-tumorale avec une immunothérapie anti-PDL1 à la suite d’une thérapie anti-Scd1 conduisant à une régression tumorale complète.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 20 jours. Chaque contention et injection ne dureront pas plus de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les injections IP répétées peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation des cellules quant à elle, se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Les souris KO scd1 seront produites par le croisement de souris hétérozygotes scd1+/- sans phénotypes délétères pour les seules études expérimentales et ne seront jamais maintenues en colonies car elles présentent ont un phénotype délétère inflammatoire avec une adiposité réduite, une augmentation de la sensibilité à l’insuline et des lésions de la peau à un âge avancé. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront maintenues 20 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 180 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux Scd1 KO et WT requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.

Objectifs

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.

Bénéfices attendus

Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.

Procédures

Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.

Impact sur les animaux

Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.

Devenir

Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).

Remplacement

Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.

Choix des espèces

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.

75 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales humaines leur sont greffées dans le cerveau, suivies d'un suivi par bioluminescence, de séances de radiothérapie et d'une injection sous ultrasons, les animaux présentant en fin de protocole des symptômes neurologiques. Le porteur indique tester une molécule, l'AsiDNA, contre des tumeurs cérébrales pédiatriques qu'il décrit comme incurables, et affirme qu'il faut évaluer in vivo le passage de la molécule dans un cerveau entier. Les retombées pour les enfants malades sont présentées comme un espoir à court terme.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes infiltrant de la ligne médiane (ou DMG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont inopérables en raison de leur nature infiltrante et de leur localisation profonde dans le tronc cérébral. Elles sont chimiorésistantes et la radiothérapie, traitement standard, n'est efficace que transitoirement. En cela, ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Les AsiDNA sont des molécules composées de courts ADN. Lors de l'absorption, les cellules perçoivent les AsiDNA comme un dommage à la cellule et déclenchent une activation aberrante des voies de signalisation de réparation à l'ADN. Ce large mécanisme d'action en fait un radio- et chimiosensibilisateur efficace dans un large éventail de tumeurs malignes, y compris les tumeurs cérébrales, telles que le glioblastome. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence un effet antitumoral des AsiDNA en combinaison à la radiothérapie dans nos modèles de xénogreffes de DMG. Dans une première étude cinétique et pharmacodynamique, nous confirmerons le passage de ces molécules à travers la barrière hémato-encéphélique (BHE) et l’effet potentialisant d’un système d’ouverture de la BHE par des ultrasons sur ce passage. Puis, dans le cas où le passage est suffisant pour atteindre la tumeur et provoqué une réponse dans celle-ci, nous évaluerons l’effet antitumoral des molécules sur un modèle de xénogreffes de DMG par un suivi longitudinal de la croissance tumorale couplée à une étude de survie. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules seront directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.

Bénéfices attendus

Les DMG sont des tumeurs pédiatriques universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour car aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par des AsiDNA est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie de ces enfants à court terme.

Procédures

Greffes intracérébrales stéréotaxiques sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 20 minutes, une fois. Suivis en bioluminescence sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 15 minutes: 1 à 3 fois. Irradiation de radiothérapie localisée à 4 kGy guidée par l'image (SARRP), sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 2 minutes, maximum 8 fois. Injection intranveineuse sous stimulation ultrasonique sous anesthésie générale, durée 15 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés avec des tumeurs directement en intracérébral. Bien que nous contrôlions la croissance tumorale, en fin de protocole, les animaux présenteront des symptômes neurologiques (principalement apathie) qui correspondront à la fin de la procédure et à l'arrêt de la procédure. Les doses de radiothérapie utilisées ici sont très bien tolérées chez l’animal et n’engendrent aucun effet secondaire. Les doses utilisées d’AsiDNA pour traiter les souris sont bien inférieures aux doses maximales tolérées. Les ultrasons à faibles intensités (stimulation ultrasonique) n'induisent aucun effet secondaire chez l'animal à court ou à long terme.

Devenir

Afin de pouvoir étudier les effets des traitements sur les tumeurs et le tissu cérébral, nous devrons mettre à mort l'animal afin d'étudier son cerveau.

Remplacement

L’efficacité des AsiDNA développées par la société Onxeo a été évaluée dans un 1er temps in vitro, avec un bénéfice supérieur lorqu’ils sont utilisés en combinaison avec de l’irradiation. Toutefois, il est reconnu que la BHE est un réel frein quant aux passages de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc nécessaire d’évaluer dans un contexte in vivo le passage et la pharmacodynamique des AsiDNA dans un cerveau vivant entier. De plus, pour le soutien du passage de la molécule vers un essai clinique humain, il est nécessaire d’avoir des données précliniques chez l’animal démontrant l’efficacité et la non toxicité des médicaments.

Réduction

Nos xénogreffes sont suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d'extrapoler le volume tumoral sans avoir besoin de sacrifier des animaux. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédures et de prévoir au plus tôt la souffrance des animaux. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogènes et reproductibles (100% de prise tumorale). Pour la procédure 1, nous utiliserons uniquement 3 animaux par conditions pour confirmer le passage de la molécule dans le tissu cérébral. Nous ne ferons pas statistiques sur cette partie. Pour la procédure 2, nous avons calculer le nombre optimum de souris afin d'avoir un résultat statistiquement fiable, soit l'utilisation de 60 souris pour 6 conditions différentes testées.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe clinique, les animaux recevront un antalgique (0,1 mg/kg de buprénorphine par voie souscutanée (10mL/kg)). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 1 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée chez l’homme, 1300mg et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité. Les études précliniques utilisant les AsiDNA, n'ont pas rapporté de toxicité supplémentaire de ces médicaments seuls ou en association avec des agents génotoxiques. De plus, les résultats récents de l'essai clinique de phase I/II du DRIIM ont démontré que l'administration locale d'AsiDNA améliorait la réponse radiologique des métastases cutanées du mélanome, sans toxicité cutanée supplémentaire. Les doses d’irradiation ont été déterminées par l’étude de la radiorésistance in vivo dans nos modèles et n’engendre aucun effets secondaires. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l'espèce privilégiée en oncologie. Dans ce projet, des cellules humaines seront greffées à des souris immunodéficientes nudes, modèle sur lequel les chercheurs en cancérologie ont un très grand recul, ce qui permet d'obtenir des résultats fiables et comparables. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (4 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 6 mois), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.