Cancers

1 610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeurs bronchiques humaines, des gavages quotidiens jusqu'à deux fois par jour cinq jours sur sept et des scanners, pour étudier la résistance aux thérapies ciblées du cancer du poumon. Le porteur indique des difficultés respiratoires liées à la tumeur et des inconforts liés aux gavages répétés. Il affirme que la croissance tumorale ne peut s'étudier que sur un modèle vivant et que les données précliniques chez la souris sont une étape "nécessaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des résistances aux thérapies ciblées dans les cancers bronchiques, principalement les inhibiteurs tyrosine kinase de l’EGFR (ou EGFR-TKi) dans le but d’identifier des combinaisons thérapeutiques permettant de limiter ou de prévenir la rechute chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet servira d'une part à apporter des connaissances scientifiques sur l'origine des mécanismes de résistance aux thérapies ciblées in vivo afin d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques, et d'autre part de tester les cibles qui auront préalablement été validées in vitro en réalisant des combinaisons de traitement dans le but de prévenir l'émergence de résistances. Les bénéfices seront à moyen terme de développer des essais cliniques chez les patients.

Procédures

1) Implantation de tumeurs sous-cutanées (PDX et xénogreffes) ; 5 à 10 minutes/manipulation, 1565 souris; 2) Gavages ; une à deux fois/jour, 5 jours/semaine,

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables potentiels ainsi que les mesures prises pour réduire, éviter ou atténuer ces nuisances sont décrits dans les procédures expérimentales. Les principaux effets indésirables peuvent être : 1) Des difficultés respiratoires liées à la tumorigénèse bronchique du modèle CCSP-rTA-EGFRL858R 2) Des inconforts liés aux gavages quotidiens 3) Des effets potentiellement indésirables liés aux traitements, dont les potentiels signes de toxicité feront l’objet d’un suivi rapproché

Devenir

Procédure 1 (implantation de PDX) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 2 (Implantation de cellules tumorales bronchiques humaines) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 3 (Traitement des souris par gavage) : une fois les tumeurs établies, les animaux seront traités par gavage et mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 4 (Tumorigenèse pulmonaire du modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R) : la croissance tumorale sera déterminée par CT-scan (procédure 5) et les souris seront traitées par gavage (procédure 3) puis mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 5 (CT-scan) : la croissance tumorale sera monitorée, les souris seront ensuite traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2.

Remplacement

L'étude des mécanismes à l'origine des résistances aux thérapies ciblées est en majeure partie réalisée in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, pour étudier la croissance tumorale, la dissémination métastatique et la réponse aux traitements qui sont des processus complexes, il faut prendre en compte plusieurs paramètres comme la présence du microenvironnement tumoral, le métabolisme in vivo, la circulation sanguine ou encore la présence du système immunitaire le cas échéant, ce qui n'est possible que via l'utilisation de modèles vivants. De plus, l’obtention de données précliniques chez la souris est une étape nécessaire pour l’établissement d’un protocole clinique chez les patients.

Réduction

Le nombre de souris utilisées fera l'objet d'une étude statistique préalable a fin de limiter au mieux le nombre d'animaux à utiliser tout en garantissant la fiabilité statistique des résultats

Raffinement

Les souris sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur. Afin de réduire au maximum le stress des animaux, ils seront manipulés avec précautions et calme durant toute la durée de l’expérience. Pour éviter le stress des animaux, le milieu environnemental et les conditions d’hébergement des souris seront optimisés (enrichissement, igloos, ajout de gels nutritifs, manipulation par personnel formé). Si besoin, nous utiliserons un agent analgésique (Buprecare, Buprénorphine) pour réduire la douleur liée notamment à l'implantation de tumeurs sous-cutanées. Quand nécessaire, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane 3%. Les souris seront quotidiennement observées pour détecter d’éventuels signes de souffrance (difficultés à respirer, prostration, dos voûté, agitation, activité sociale anormale).

Choix des espèces

Les souris NSG sont classiquement utilisées en oncologie car elles favorisent l’implantation et le suivi des tumeurs d’origine humaines (PDX), et les souris nudes sont classiquement utilisées dans le cadre de l’implantation et le suivi de lignées cellulaires telle que les lignées PC9, HCC4006 ou H3122. Il existe de plus de nombreuses données bibliographiques sur ces modèles, ce qui permet d’une part d’optimiser les séquences techniques (protocoles d’implantation) et d’autre part d’ajuster les traitements en fonction des données publiées. Le modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R a déjà été utilisé dans de nombreuses études et notamment au laboratoire, car il présente le double avantage d’avoir des caractéristiques histopathologies très similaires aux adénomes et adénocarcinomes humains (Politi et al. Genes Dev. 2006) et de reproduire l’évolution clinique observée chez les patients sous traitement aux EGFR-TKi (Politi et al, Dis Model Mech. 2010 ; Starrett et al., Cancer Res. 2020). Implantation PDX et xénogreffes réalisés sur des souris jeunes âgées de 6 et 8 semaines, ce qui permet d’une part de favoriser la prise des greffes et d’autre part de pouvoir réaliser des traitements pouvant aller jusqu’à 6 à 8 mois selon les modèles.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour développer des cancers disséminés, puis des séances d'imagerie sous anesthésie, afin de mettre au point des agents de diagnostic des métastases. Le porteur décrit une perte de poids et des signes de mal-être suivis par une grille, l'animal étant tué dès un score supérieur à 6, les autres tués pour prélever les tumeurs. Les retombées annoncées pour les patients relèvent d'une médecine personnalisée future, l'imagerie étant présentée comme réduisant le nombre d'animaux par rapport à une étude classique.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladies systémiques par l’apparition de métastases. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est d’abord de mettre en place des modèles de cancers disséminés mimant l’envahissement systémique des métastases, puis de développer de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer la réponse aux traitements anti-cancéreux et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira au développement d’agents d’imagerie non invasifs permettant le diagnostic et le suivi des métastases issues de divers cancer. Ces agents permettront une meilleure prise en charge des patients et sera un pas de plus vers la médecine personnalisée en oncologie. De plus, ce projet permettra l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre l’apparition de métastases au cours du développement tumoral.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie IP ou IV. Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie IP, IV ou oral (gavage). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (PET/SPECT/fluorescence/bioluminescence).

Impact sur les animaux

Le développement de modèles animaux de cancer disséminés est susceptible d’induire chez les animaux des signes cliniques tels qu’une perte de poids ou des signes de mal être qui seront très étroitement suivis tout au long des procédures du projet afin de mettre à mort les animaux dès l’apparition de ces signes cliniques indésirables comme décrit dans le tableau 1 en annexe. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera mis à mort. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tumeurs.

Remplacement

La mise en place de ce projet s’est attachée à respecter la règle des 3R. L’étude préalable des molécules d’intérêt sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée.

Réduction

En comparaison avec une étude « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant d’obtenir des données anatomiques et fonctionnelles quantifiables se substituant à des méthodes de prélèvements plus traumatiques pour l’animal. La totalité des procédures impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Les murins de type souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie moléculaire eux-mêmes très proches des appareillages humains (SPECT, TEP, IRM et fluorescence), facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales puis de cellules CAR-T, avec suivi de la croissance de la tumeur par imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins, jusqu'à une ponction intracardiaque terminale. Le porteur reconnaît l'apparition de tumeurs et de possibles difficultés respiratoires liées à des métastases pulmonaires. Il présente ce modèle murin comme un "prérequis indispensable" avant un éventuel essai clinique, tout en reconnaissant qu'aucun modèle animal n'existe encore pour cette stratégie.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules tumorales. Après réinjection aux patients, ces cellules dites "CAR-T" sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Les CAR-T cells représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certains cancers du sang réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète au traitement par la thérapie CAR-T cell, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules CAR-T, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie CAR-T cell, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices des CAR-T pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Avant administration des cellules progénitrices CAR-ProT et évaluation de l’effet thérapeutique, il est nécessaire de valider dans un premier temps le modèle animal pour le développement de tumeur de lymphome et la régression tumorale en injectant des cellules CAR-T matures, connues pour leur capacité d’élimination de tumeur in vivo. Si cette 1ère étude est concluante, une 2è étude sera réalisée avec les cellules progénitrices CAR-ProT et fera l’objet d’une 2è demande d’autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Si le modèle animal, tel qu’il est décrit dans ce projet, permet de démontrer une réponse antitumorale avec une dose faible de cellules CAR-T classiques, nous pourrons ensuite continuer l’étude avec des cellules progénitrices CAR-ProTcell. Cette deuxième partie du projet fera l’objet d’une deuxième demande d’autorisation. A notre connaissance aucun modèle animal n’est établi à ce jour pour répondre aux besoins de nos études avec des cellules progénitrices humaines nécessitant de poursuivre leur différenciation in vivo en cellules effectrices. Le modèle doit être adapté à l’évaluation des fonctions anti-tumorales des progéniteurs des CAR-T génétiquement modifiés. Ce modèle murin représente par conséquent un prérequis indispensable afin de tester in vivo notre stratégie thérapeutique dans des conditions proches de celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable avant l’application éventuelle de notre stratégie thérapeutique innovante dans un essai clinique. Les résultats de ce projet permettront ainsi la validation du potentiel de notre plateforme et l’acquisition de données indispensables au développement clinique d’une thérapie innovante, à fort potentiel translationnel.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections par voie intraveineuse (1X à l'age de 8 semaines); - des injections par voie intrapéritonéale et des anesthésies sous isoflurane pour suivre laecroissance tumorale par imagerie (2X/semaine, sur une durée de 1 mois environ); - des prélèvements sanguins, toutes les 2 semaines (sur une durée de 1 mois environ, soit 3X maximum); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, sous anesthésie profonde, sub-léthale).

Impact sur les animaux

Les cellules CAR-T matures pourraient occasionner au long cours une réaction des lymphocytes humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules hématopoiétiques humaines. La durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet effet indésirable. Par ailleurs, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Par ailleurs, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations phénotypiques et moléculaires du produit final par des méthodes de type séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire et par cytométrie de masse. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les cellules T matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules souches hématopietiques avec des cellules stromales. Bien que ce modèle permette d’obtenir des cellules T exprimant des marqueurs CD3 de différentiation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénotransplantation, réceptif aux cellules hématopoïétiques humaines, permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs lymphoides dans l’environnement thymique. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet consiste à utiliser des cellules CAR-T matures et à valider le modèle tumoral avec une décision de poursuivre ou non à l’issue de cette étape avec les cellules progénitrices des CAR-T. Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal de base choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, y compris pour la greffe des progéniteurs lymphoïdes. D’autre part, le rendement de la reconstitution hématopoïétique est supérieur chez les souris femelles. Nous utiliserons donc de préférence des souris femelles dans nos protocoles permettant d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental en fonction de la différence relative attendue. En utilisant des tests statistiques non paramétriques de type Kruskal Wallis, Mann Whitney ou Wilcoxon, selon le design expérimental et le paramètre mesuré, nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux si ces différences existent.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes NOD/SCID/gc- (NSG) sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire des souris NSG permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris NSG, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules hématopoïétiques sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. L’étude de la thymopoïèse et de la régénération thymique humaine chez ces souris nous permettra ainsi d’évaluer les progéniteurs lymphoïdes greffés dans un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris NSG adultes de 8 semaines, permettant une bonne prise de greffe des cellules tumorales et des CAR-T matures.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer du foie, elles reçoivent des traitements par gavage cinq jours sur sept ou par injection pendant huit semaines, des échographies sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable" des immunomodulateurs testés, alors que les souris portent une tumeur hépatique évolutive. Il conclut qu'aucun modèle ne reproduit ces interactions et parle d'un "passage obligatoire par le modèle animal".

Objectifs

Notre projet est d’évaluer l’intérêt de l’immunomodulation dans le CHC, et pour se faire il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de CHC immunocompétent. Nous proposons d’utiliser un modèle de souris transgénique (ASVB) développant un carcinome hépatocellulaire évoluant en trois stades bien définis : dysplasie, nodulaire, et diffus (Dupuy, et al., 2003 ; Contreres, et al., 2006 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). Ce modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain) (Dupuy, et al., 2003 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). De plus, des résultats préliminaires ont montré une augmentation de l’expression de PD-1 et PD-L1 au cours du développement du CHC (Tijeras-Raballand, et al., abstract accepté ILCA 2019). Toutes ces caractéristiques en font un excellent modèle d’étude pour ce projet.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seul 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti- PDL1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. Ce projet tend donc à proposer des méthodes combinatoires, permettant à la fois d’augmenter l’efficacité des thérapies proposées, ainsi que d’éviter l’apparition de résistance.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 type d'intervention en étant vigiles: L'administration du traitement soit par gavage 5 jours sur 7 soit en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 8 semaines. Ils seront ensuite anesthésiés pour être soumis à un échodoppler qui n'est pas une précédure invasive, donc non douloureuse 3fois (à 8 12 et 16 semaines). Enfin, ils seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale où les animaus ne seront pas réveillés à 16semaines.

Impact sur les animaux

Il n'y a aucun effets indésirables attendus avec l'utilisation d'immunomodulateurs. Aussi, la dose sélectionnée de Sorafenib (traitement contrôle dont on connaît les effets) a été choisie pour ne pas induire d'effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après l’échographie de la 16ème semaine par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti-PD-L1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. A ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, tout en étant statistiquement valide, le nombre d’animaux par groupe (10) a été déterminé grâce aux expérimentateurs (personnel en charge de l’échographie, anatomo-pathologistes, pharmacologues et chercheurs) qui participent à ce projet et qui ont de l’expérience avec ce modèle. De plus, dans la mesure du possible, plusieurs groupes de traitements seront testés en parallèle afin de ne pas multiplier le groupe contrôle (ou placebo), pour un total de 360 animaux sur 36 mois. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes de monothérapie et les groupes de monothérapie avec les combinaisons.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (qui ne sera jamais pris en compte individuellement dans la mesure où l’accroissement du volume hépatique peut provoquer une légère prise de poids), le gonflement de l’abdomen (signe de développement tumoral trop important) et la survenue d’une gêne pour se déplacer (signe de douleur possible au niveau hépatique). Le comportement et l’apparence physique feront aussi l’objet d’observations. Les dispositions retenues pour stopper ou atténuer les problèmes liés à l’apparition de points limites seront prises dès constatation. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC). Ce modèle est un des rares modèles immuno-compétents de CHC, disponibles pour l’étude de nouvelles thérapies. Le modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain). Les anomalies vasculaires observées sont également les mêmes que celles observées chez l’homme et permettent d’analyser les effets anti-angiogéniques attendus des molécules, en plus de leurs effets antitumoraux. Enfin, ce modèle possède un stroma immun riche et complexe, à l’image de celui observer dans les tumeurs issues de patients. Le début de l’administration des médicaments aura lieu à l’âge de 8 semaines. En effet, dans ce modèle, 3 stades de carcinogenèse bien définis ont été mis en évidence. Une hyperplasie (8 semaines), stade nodulaire (12 semaines) et carcinome diffus (à partir de la semaine 16). En oncologie, les patients commençant à être traités une fois leur pathologie déclarée, cela explique pourquoi nous attendons également le début de la carcinogenèse dans les animaux.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mutation de l'oncogène Kras déclenche chez elles des lésions précancéreuses du pancréas, puis elles reçoivent des injections et des gavages répétés de molécules candidates avant un prélèvement terminal de sang et d'organes. Le porteur affirme que ces lésions "ne devraient pas" entraîner de douleur, en s'appuyant sur le diagnostic tardif du cancer chez l'humain. Il sollicite 1 200 souris sur cinq ans tout en indiquant que le projet ne devrait en nécessiter qu'environ 300, et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"organisme intégré".

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer en constante augmentation qui devrait d’ici fin 2022 se classer comme le second cancer le plus mortel. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunité de traitement thérapeutique, conduisant les patients à moins de 5% de chance de survie 5 ans après leur diagnostic. Grâce aux analyses génétiques à grande échelle, plusieurs mutations impliquées dans cette pathologie ont déjà été identifiées chez l’Homme. L’initiation des cancers du pancréas est majoritairement associée à l’acquisition de mutations de l’oncogène Kras. Face à ces mutations, les cellules affectées deviennent précancéreuses, elles développent une réponse de protection visant à limiter leur expansion. Ce processus appelé « Sénescence oncogénique induite » ou OIS conduit les cellules précancéreuses à induire des mécanismes visant à limiter leur prolifération, mais également à sécréter de nombreux composés complexes (regroupés sous le terme: SASP) dont le rôle bénéfique ou délétère sur la progression tumorale restent encore mal compris. De nombreuses fonctions sont décrites au large spectre de molécules sécrétées qui compose le « SASP ». Ces molécules sont produites en aval de grandes voies canonique de signalisation (mTOR, JAK (Janus Kinase), Notch, Toll Like Receptor (TLR), …). Leurs actions peuvent être inflammatoiree, favoriser la fibrose ou plus bénéfique pour certaines d’entre elles. Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, le développement de molécules appelées « sénomorphiques » vise à bloquer spécifiquement les molécules du SASP aux effets délétères tout en conservant l’action des molécules bénéfiques. L’objectif de notre projet vise à évaluer les effets thérapeutiques de 5 candidats molécules capables de bloquer les voies de signalisation qui conduisent à la production de différentes molécules du « SASP » par les cellules précancéreuses pancréatiques. Il consistera à traiter à court terme (2 semaines) ou à long terme (2 mois) de jeunes souris porteuses dans leur pancréas de la mutation KRAS qui est à l’origine des cancers pancréatiques chez l’Homme. Les résultats bénéfiques ou délétères seront ensuite observés sur les lésions développées afin de mieux comprendre le rôle complexe du SASP dans l’initiation des tumeurs pancréatiques.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à mieux comprendre l'intérêt du ciblage thérapeutique des cellules sénescentes et des molécules qu’elles secrètent dans le cadre du développement des cancers pancréatiques. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité d'action du SASP dans les pré-lésions pancréatiques et fournir des pistes importantes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les cancers du pancréas

Procédures

Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés, sur 2 semaines à 2 mois, pour administrer les molécules candidates thérapeutiques. La fréquence d’administration dépendra des molécules concernées (3 injections intrapéritonéales et de 3 à 5 gavages par une canule adapté par semaine). Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin des procédures de traitements sur des animaux, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

L'activation ciblée de la mutation de Kras dans le pancréas des souris entrainera l'apparition de pré-lésions cancéreuses pancréatiques. Ces lésions bégnines ne devraient toutefois pas entrainer de douleurs (chez l'homme le cancer pancréatiques n'est diagnostiqué que très tardivement par des douleurs). Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés qui pourraient entrainer un inconfort ou des irritations locales sur lesquels nous seront particulièrement vigilant. Les produits testés pourraient entrainer une réponse inflammatoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements réalisés. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages de molécules secrétées par les pré-lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les pancréas collectés post-mortem. Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Remplacement

Aucun autre modèle ne permet de reproduire de manière aussi satisfaisante la progression tumorale du cancer du pancréas puisque les tumeurs se développent au niveau du pancréas lui-même. En raison de la nature complexe de la recherche proposée qui vise à évaluer les effets de molécules thérapeutiques au sein de lésions pancréatiques précancéreuses (où des interactions cellulaires complexes prennent place), nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. L’effet des molécules que nous proposons de tester ont toutefois été étudié et validé in vitro sur des lignées cellulaires pour confirmer l’intérêt thérapeutique des travaux que nous proposons.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de Réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation des traitements thérapeutiques testés. 6 à 9 souris par sexe et par groupe devraient nous permettre d’obtenir des conclusions statistiques interprétables entre groupe de traitements. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale sauf en cas de problèmes techniques qui compromettraient l’interprétation de nos travaux. Signalons enfin que les traitements à court et long terme seront réalisés séquentiellement et que les traitements à long terme ne seront mis en place qu’en d’absence d’effets des traitements à court terme. Bien que nous sollicitions 1200 souris sur 5 ans, ce projet ne devrait donc nécessiter qu’un quart de ces animaux (300) pour atteindre nos objectifs.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, perte de poids, irritations liées aux modes d’administrations des traitements réalisés). L’identification de ces signes entraineraient alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir la variabilité des bénéfices thérapeutiques des traitements que nous testerons, ils seront accompagnés de nombreuses analyses des tissues pré-tumoraux post-mortem par des approches histologiques et moléculaires complémentaires qui permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Choix des espèces

Le modèle murin que nous avons choisi pour réaliser cette étude reproduit parfaitement la pathologie humaine. Il est basé sur l’expression conditionnelle dans le pancréas d’une mutation de l’oncogène Kras qui est retrouvée dans plus de 90% des patients atteints de cancer du pancréas. Il reproduit les lésions pré-cancéreuse (PANINs) qui sont décrites chez l’Homme. Ces animaux permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas qui prend place chez l’homme en aval des mutations qui affectent ce gène. L’utilisation d’animaux est de plus essentielle pour la réalisation de notre projet car elle requiert l’analyse des effets de molécules thérapeutiques sur un organisme intégré. Les protocoles de traitements mis en place seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. A cet âge les souris porteuses de mutation Kras ne présentent que de très rares lésions de type PANINs dans lesquelles l'existence de mécanismes de sénescence est déjà bien démontrée.