Cancers

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, incapable de rejeter les cellules cancéreuses humaines qu'on lui greffe et maintenue à l'abri des germes pour ne pas s'infecter. 40 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une injection de cellules de cancer du foie, puis sa tumeur est mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine sous anesthésie, jusqu'à une possible ulcération de la peau au point de greffe. Toutes sont tuées après un dernier prélèvement de sang, pour que leurs tissus servent à mesurer l'effet d'une protéine membranaire sur la croissance de la tumeur.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire afin d’améliorer les thérapies actuelles. Nous avons identifié une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, et particulièrement le carcinome hépatocellulaire. Une expression élevée de cette protéine est notamment associée à un mauvais pronostic chez les patients, suggérant qu’elle pourrait être une cible thérapeutique pertinente dans le carcinome hépatocellulaire. Ce projet a donc pour objectif de comprendre les effets de la variation d’expression de cette protéine sur la croissance tumorale, en utilisant des lignées cancéreuses humaines ou murines dans lesquels l’expression de la protéine est supprimée (perte de fonction) ou surexprimée (gain de fonction). Ces cellules sont ensuite greffées sous la peau des souris, permettant le développement de tumeurs où il nous sera possible de suivre leur croissance. L’objectif à terme est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire et d’ouvrir de nouvelles pistes de traitement.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du carcinome hépatocellulaire. Ce projet pourrait ouvrir vers de nouvelles pistes thérapeutiques pour prendre en charge le cancer du foie, ainsi que les autres cancers exprimant fortement la protéine que nous avons identifiée.

Procédures

Pour étudier l’effet du gain ou de la perte de fonction du récepteur, les animaux seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses du foie. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse sur animal anesthésié, et cette mesure prend moins d’une minute à être réalisée. A la fin de la procédure, les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. Dans certains cas la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée au niveau du site d’implantation des cellules, entraînant une douleur modérée de courte durée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Plusieurs stratégies de remplacement ont été mises en place afin de réduire au minimum le recours à l'expérimentation animale. Nous utilisons également en parallèle des modèles in vitro afin de confirmer notre hypothèse avant de passer sur le modèle animal. Néanmoins, dans les essais de pharmacocinétiques pour toutes substances thérapeutiques, les tests sur animaux entiers ne sont pas substituables par des tests simplifiés in vitro. Cela en raison du besoin de mesurer les variations de concentration de la substance thérapeutique dans le plasma d’un organisme ayant des organes et des systèmes pleinement fonctionnels. Également, les modèles cellulaires ne permettent pas de reconstituer l’effet de l’angiogenèse (formation de nouveaux vaisseaux qui peuvent influencer la réponse thérapeutique en entrainant l’activation de certaines voies de signalisation) ou toute la complexité biologique (interaction des éléments du microenvironnement tumoral avec le système biologique de la souris ou modélisation de l’hétérogénéité cellulaire et génétique d’une tumeur) d’un être vivant sur l’efficacité d’un traitement. La validation de ces dernières nécessite le recours à l'expérimentation animale en raison de sa grande complexité. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe du CHC.

Réduction

Pour garantir la fiabilité de nos résultats tout en limitant le nombre d’animaux, nous avons déterminé, grâce à des calculs statistiques, un effectif minimum par groupe qui nous permet de détecter une différence significative entre chaque condition. Nous avons prévu quelques animaux supplémentaires pour compenser d’éventuelles variations et n’avons pas inclus de groupes superflus. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques reconnues pour valider nos comparaisons.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, et des tunnels kraft pour leur permettre de se cacher. Ils auront accès sans restriction à la nourriture et à l'eau pendant toute la durée de l'expérience. Les animaux immunodéficients seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées en zone exempt d'organismes pathogènes spécifiques, ce qui permet que les animaux immunodéprimés ne développent pas d'infection. Les animaux immunocompétents seront maintenus en groupe sociaux dans des cages ventilées. Les animaux seront manipulés à l’aide de tubes de manipulation afin d’éviter toute préhension stressante par la queue de l’animal. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Une méthode anesthésique sera appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères proches de l’homme. Les phénomènes biologiques mis en jeu chez ces 2 espèces sont très comparables lors d’un traitement anti-cancéreux. Ces modèles ont contribué dans le passé à établir une meilleure compréhension des voies moléculaires impliquées dans la carcinogenèse ainsi que le potentiel curatif de combinaisons thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum, afin de mimer la pathologie qui touche principalement les adultes. De plus, il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Pour vérifier que des modèles de tumeurs imprimés en 3D donnent les mêmes résultats que des souris, 224 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe chirurgicale de tumeur du sein ou de l'ovaire, puis jusqu'à cinq injections hebdomadaires d'une chimiothérapie, avec pesées et mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant neuf semaines. Toutes sont tuées au plus tard soixante-dix jours après l'implantation, ou plus tôt si le volume de la tumeur atteint le point limite. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, utiliser moins d'animaux non-humains grâce aux modèles imprimés, ce qui suppose ici d'en greffer et d'en tuer 224 pour l'établir.

Objectifs

En 2020, le cancer du sein est le deuxième cancer le plus fréquent et le cancer de l'ovaire est le troisième cancer gynécologique le plus fréquent. Ces chiffres soulignent la nécessite de mettre au point de nouveaux médicaments plus efficaces. Pour évaluer l'efficacité de ces nouveaux médicaments, des nouveaux modèles ont été développé par les chercheurs à l'aide d'une imprimante 3D : les modèles 3D bio-imprimés. Pour cette preuve de concept nous avons sélectionné une chimiothérapie efficace pour de nombreux cancers, notamment des cancers du sein et de l’ovaire. Nous émettons l'hypothèse que l'efficacité de ce médicament dans les nouveaux modèles sera comparable à l'efficacité de ce dernier chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait d'utiliser moins d'animaux pour l'évaluation de nouveaux médicaments en ayant recours aux modèles 3D bio-imprimés.

Procédures

Pour chaque souris : 1 injection d’un anti-douleur 30 min avant la chirurgie, 1 implantation de la tumeur par chirurgie sous anesthésie, 1 injection par semaine sur animal vigile du composé testé (durée < 30s) (maximum 5 injections), mesures de la tumeur et pesées (durée < 2 minutes) 2x/semaine (maximum sur 9 semaines). Pour certaines souris : un prélèvement sanguin (durée quelques secondes) sous anesthésie avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

- Douleurs post-chirurgicales après implantation de fragments de tumeurs et suture - Douleur de courte durée lors de l’injection (quelques secondes maximum) - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux et pesées (quelques minutes maximum, 2x/semaine) - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite.

Devenir

Les animaux seront mis à mort au maximum 70 jours post-implantation si aucun point limite n’a été atteint avant.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation de souris afin de récolter les données nécessaires à l’établissement de la preuve de concept sur l’intérêt des modèles 3D bio-imprimés pour l’évaluation des thérapies anti-cancéreuses, afin de réduire l'utilisation des modèles murins. Dans ce projet, les données récoltés à partir des tumeurs de souris seront comparées aux données obtenues à partir de modèles 3D bio-imprimés et de modèles cellulaires 2D.

Réduction

Le nombre d'animaux strictement nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été calculé à l'aide d'un logiciel de statistiques.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux manipulateurs pendant 7 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un anti-douleur sera administré au minimum 30 min avant l’intervention chirurgicale afin de palier à la douleur. Les souris seront anesthésiées avant la chirurgie et avant la mise à mort pour minimiser leur stress. Les animaux seront hébergés en groupe de 6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 70 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs. Afin d’éviter le rejet de la greffe des cellules tumorales humaines, l’utilisation d’une souche murine fortement immunodéprimée est requise. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

96 souris génétiquement modifiées pour développer un cancer de la prostate vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. À six mois au moins, avec un carcinome installé, elles subissent une ouverture de l'abdomen de dix minutes et l'exposition de leur prostate antérieure à une torche à plasma froid, ou à un jet d'hélium pour les témoins, puis sont gardées sept jours avant d'être tuées. L'enjeu déclaré est le traitement des marges chirurgicales lors des prostatectomies robotisées chez l'humain, un domaine que le porteur présente comme une aire de développement technologique de premier plan. Il écrit que les organoïdes et tumoroïdes permettent "de ne pas recourir à l'expérimentation animale", et conclut dans la même rubrique que la souris reste "indispensable".

Objectifs

Le projet est basé sur l’intérêt de l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale (ablation de la prostate) chez des patients présentant un cancer localisé. Il existe aujourd’hui plusieurs appareillages pour le traitement focalisé d’une tumeur mais sans prostatectomie (Ultrasons, lasers, radiothérapie etc.). En revanche, l’utilisation de module spécifique pour le traitement des marges chirurgicales au cours de la prostatectomie est très limitée et encore exploratoire. De plus, la très large majorité des prostatectomies sont aujourd’hui réalisées par assistance robotisée sous coelioscopie. Cette technologie connaît un essor exponentiel et constitue une aire de développement technologique de premier plan dans la chirurgie de la prostate. L’opportunité de traiter avec une source plasma constitue donc une approche nouvelle qui nécessite d’être évaluer in vivo avant tout transfert technologique vers la clinique. La torche à plasma froid est constitué́ de deux électrodes entourant un tube de quartz dans lequel est injecté de l'hélium. Des pics de tension sont appliqués, transformant l'hélium et l'air environnant en plasma (mélange d'ions, de radicaux et d'électrons). Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par plasma sur un modèle de cancer de la prostate induit chez des souris transgéniques. Une étude pilote sur un modèle de souris ayant subi une greffe de cellules tumorales dans la prostate nous a permis d'identifier les paramètres de fonctionnement de la torche à plasma in vivo. Ainsi, deux paramètres seront étudiés, i) l’effet spécifique du plasma comparé à de l’hélium non excité et ii) l'impact du milieu d’imprégnation du tissu pendant son exposition au plasma. Les zones de traitement seront analysées par des approches histologiques et moléculaires. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude pilote sera conduite permettant de vérifier la pertinence du traitement par plasma froid.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser in vivo l'effet d'une exposition d'un tissu tumoral à une source de plasma froid. Nous souhaitons ainsi obtenir, sur ce modèle préclinique, des informations sur le type de lésions engendré: apoptose? nécrose? inflammation? et la profondeur tissulaire atteinte. Ces résultats ont une valeur importante et capitale pour envisager un transfert vers la clinique humaine. Un projet vient d'être accepté dont l'exploration fonctionnelle sur ce modèle vivo fait parti. Par ailleurs, nous avons montré, ex vivo, que le milieu d'imprégnation des cellules tumorales est un paramètre important. Nous allons donc testé 2 milieux caractéritique pour tester l'efficacité de la torche in vivo : un milieu phosphate buffer saline (PBS 1X) de formulation très simple et un milieu de culture plus complexe adapté à la croissance des cellules tumorales prostatiques (RPMI1640).

Procédures

Les animaux subiront une laparotomie et un traitement par plasma froid de la prostate antérieure ou un traitement control (expostion jet Helium). L'ensemble de la procédure opératoire dure en moyenne 10 minutes +/- 2minutes. Les animaux seront maintenus en hébergement pendant 7 jours avant leur mise à mort et le prélèvement des tissus d'interêt. Les animaux pourront être pris en charge par un traitement anti-inflammatoire AINS le cas échéant par injection intraperitonéale. Cette injection, contention de l'animal comprise, durera environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les potentiels effets indésirables sont attendus comme plutôt mineures puisque que le traitement est localisé à la prostate antérieure qui ne constitue pas un organe essentiel à la survie de l'animal. Par ailleurs, la procédure de traitement de la prostate par laparotomie est une procédure exécutée en routine par l'équipe et dont les suites post-opératoires sont completement connues et maitrisées. Toutefois, il est possible que le traitement par le plasma conduisent à une réponse inflammatoire du tissus prostatique. Grâce au suivi renforcé, nous surveillerons les points limites en terme de mal être ou de souffrance qui conduiraient à l'utilisation d'un traitement anti-inflamatoire si cela s'avérait nécessaire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés et prélevés pour analyse du tissu prostatique traité.

Remplacement

La caractérisation des effets du plasma sur les tissus tumoraux sera complétée par des expositions sur des organoïdes et des tumoroïdes permettant ainsi de ne pas recourir à l'expérimentation animale. Ces experiences conduites in vitro permettent de calibrer des paramètres critiques (tension, débit helium, temps d'exposition...) du jet plasma sur des modèles intermédiaire entre culture 2D et modèle vivo. Cette approche permet dans une certaine mesure d'anticiper la réponse in vivo. Pour autant, l'utilisation sur le modèle souris est indispensable pour valider cette technologie sur organisme mammifère entier et envisager un transfert vers la clinique humaine.

Réduction

Ce projet d'exposition au plasma froid fait suite, d'une part, à des travaux réalisés en culture cellulaire qui ont permis de caractériser les paramètres d'utilisation de la torche à plasma froid, et d'autre part, à une expérimentation pilote sur un modèle de greffes orthotopiques intra-prostatiques. Ainsi, toute une partie du projet a été réalisé sur des modèles cellulaires en remplacement du modèle vivo et permet de limiter l'utilsation de l'animal à des conditions expérimentales que nous avons définies au préalable ex vivo. Concernant le nombre d'animaux utilisés pour l'étude, il est justifié pour assurer une puissance statistique suffisante pour l'exploitation des résultats et paramètres biologiques.

Raffinement

Le traitement par plasma froid d'un tissu vivant reste une procédure exploratoire, dont les conséquences restent à établir. Ainsi l'emergence potentielle de mal être ou souffrance de l'animal sera étudiée grâce à un suivi renforcer (visites 2x par jour). Si nécessaire les animaux pourront recevoir un traitement anti-inflammatoire. Enfin, les cages seront soumis à un enrichissement renforcé : cage individuelle avec tube carton et pad-fibre.

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique invalidé pour l'oncosuppresseur PTEN. pas d'équivalent dans d'autres espèces adaptées à l'étude. Nous utiliserons de souris agées au moins de 6 mois qui permettront de traiter un carcinome de prostate installé. (Cinétique de carcinogenèse très largement décrite dans la littérature et maitrisée par l'équipe de recherche).

Des nanoparticules sont injectées à travers la peau, directement dans une tumeur greffée, jusqu'à deux fois par animal, entre des séances d'imagerie sous anesthésie générale pouvant aller jusqu'à huit dans la vie d'une souris. 580 souris Balb/c nude, dépourvues de thymus et donc incapables de rejeter des cellules tumorales humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le RNT reconnaît qu'il n'existe "aucune donnée sur la tolérance des nanoparticules sur des organismes vivants", et présente pourtant ces mêmes nanoparticules comme une innovation prometteuse en cancérologie. Cinquante souris échapperont à la mise à mort immédiate pour être versées à d'autres projets, à condition que la tumeur n'ait pas pris ou qu'elle ait pu être retirée au bistouri.

Objectifs

Le cancer du pancréas, notamment sous sa forme la plus fréquente appelée adénocarcinome canalaire pancréatique, reste aujourd’hui l’un des cancers les plus difficiles à traiter. Les traitements disponibles sont peu efficaces, et le taux de survie à 5 ans après le diagnostic reste très faible. Ce projet propose de tester une nouvelle approche basée sur l’utilisation de nanoparticules innovantes capables à la fois de diagnostiquer et de traiter la tumeur. Ces nanoparticules seront injectées directement dans la tumeur à travers la peau, chez des souris. Cela permettra d’évaluer leur efficacité antitumorale, leur tolérance, leur capacité à rester localisées dans la tumeur, et l’effet sur la croissance tumorale après exposition à des rayons X, qui auront pour effet d’activer l’effet traitement de ces nanoparticules. La conception modulable de ces nanoparticules les rend potentiellement transposables à d’autres types de cancers dits solides, notamment grâce à sa capacité à agir aussi en tant que produit de contraste, ce qui sera également évalué.

Bénéfices attendus

Grâce aux progrès récents dans la compréhension des cancers dits « solides », de nouvelles approches thérapeutiques voient le jour. L’une d’elles consiste à injecter directement les traitements au cœur même de la tumeur, ce qui permettrait d’augmenter leur efficacité tout en réduisant les effets secondaires sur le reste du corps. Le projet présenté ici s’inscrit dans cette dynamique, avec une nouvelle classe de nanoparticules conçues pour être injectées directement dans la tumeur. Elles pourraient offrir une solution pour les patients atteints d’un cancer du pancréas qui ne peuvent plus bénéficier d’une chirurgie, qui reste aujourd’hui le traitement le plus efficace. En réduisant la taille de la tumeur, ces nanoparticules pourraient permettre à certains patients de redevenir éligibles à cette opération. En plus de leur effet thérapeutique, ces nanoparticules peuvent aussi servir à suivre l’évolution de la maladie, ce qui évite de multiplier les examens et les interventions. Cela pourrait améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant les coûts liés aux soins. Enfin, grâce à leur conception, ces nanoparticules pourraient être utilisées à l’avenir pour traiter d’autres types de cancers solides, qu’ils soient facilement accessibles ou situés plus en profondeur dans le corps du fait de ses caractéristiques particulières et activables par rayons X, ce qui en fait une innovation prometteuse dans le domaine de la cancérologie.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale (durée approximative : 5 minutes ; une fois et potentiellement une 2e fois 5 semaines après si la tumeur n’a pas poussé. Ils recevront également des injections sous la peau d’anti-douleur ou anti-inflammatoire, et de solution de réhydratation (en vigile, 30 secondes par animal) selon les procédures. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement pour évaluer la croissance tumorale, à l’aide de mesures simples par pied à coulisse en routine, 2 fois par semaine (en vigile, durée : 1 minute), et des imageries médicales pourront être dispensées (sous anesthésie générale, 3 fois maximum par semaine, dans la limite de 8 fois dans la vie de l’animal, durée : 20 min à 40 min selon les modalités d’imagerie (IRM ou scanner ou échographie)). Sur les animaux qui serviront à la mise au point du modèle et ne pouvant pas intégrer de groupes expérimentaux, une chirurgie pour retirer la tumeur pourra être réalisée (sous anesthésie générale avec anti-douleur, durée : 20 minutes). Des injections directes de nanoparticules dans la tumeur à travers la peau seront réalisées pour tester leur efficacité (sous anesthésie générale avec analgésie, 20 à 30 minutes selon les paramètres d’injection, dans la limite de deux fois dans la vie de l’animal). Des prélèvements sanguins pourront être effectués (sous anesthésie générale légère, durée : 3 minutes, dans la limite de 3 fois dans la vie de l’animal (avant injection intra-tumorale, après injection, et en suivi long terme)).

Impact sur les animaux

Effets indésirables possibles : Souris immunodéprimés Balb/c nudes : susceptibilité de contracter des infections. Croissance de la tumeur : Peut causer un inconfort (gêne, grattage...) ou affecter la locomotion (perte de poids / diminution de la prise alimentaire) et la tumeur peut s’infecter ou s’ulcérer. Stress léger liée à la manipulation des animaux pour la mesure de la tumeur en vigile par pied à coulisse ou par imagerie (anesthésie générale et injection de produit de contraste). Injection intra-tumorale des nanoparticules et/ou imagerie avec produit de contraste : Inconfort transitoire après l’injection et stress léger lié à la contention. Sous anesthésie longue. Aucune donnée sur la tolérance des nanoparticules sur des organismes vivants. Injection de cellules tumorales et analgésiques : inconfort transitoire après injection. Anesthésie générale : Inconfort au réveil de l’animal transitoire, déshydratation due à l’anesthésie et perte transitoire de poids. Prises de sang : Douleur localisée au site de prélèvement et gêne transitoire. Diminution transitoire de la volémie (remplacement par solution de réhydratation). Lésions au site de prélèvement (hématome).

Devenir

Les animaux servant à la mise au point du modèle de pousse tumorale pourront être réutilisés dans d’autres projets après 2 échecs d’induction tumorale (vérification par imagerie, semaine 3 et 5) et que l’animal n’a pas subis d’autres procédures, ou alors seront euthanasiés. Les autres animaux de cette même mise au point (avec pousse tumorale) seront euthanasiés à la fin de la caractérisation. Cependant, si les conditions le permettent, une exérèse peut être pratiquée (si la tumeur ne présente pas d’envahissement et est facilement dissécable) et la souris pourra alors être réutilisée également pour un autre projet. En l’absence de ces conditions, une euthanasie sera pratiquée. Les animaux servant à l’étude d’efficacité des nanoparticules injectées en intra-tumoral seront euthanasiés à la fin des expérimentations. Si les souris ne présentent pas de pousse après la première tentative d’induction, après vérification par imagerie de l’absence de nodules tumoraux (comme précédemment) les souris pourront être réutilisées dans d’autres projets ou euthanasiées (pas de possibilité d’une deuxième tentative d’induction du fait de l’âge trop avancée des animaux pour une étude d’efficacité).

Remplacement

Les nanoparticules pouvant être utilisées dans ce projet auront été testées au préalable sur des cellules en culture (in vitro). Certaines de ces cellules serviront ensuite à la mise au point du modèle de cancérologie sur la souris (in vivo). Ainsi leur tolérance, stabilité, efficacité, et les paramètres physicochimiques auront été testés in vitro au préalable, permettant de tester in vivo les plus pertinentes. Après cette première sélection, il s'agira d'évaluer l'efficacité et la distribution de ces nanomatériaux injectés dans la tumeur. L’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination de la distribution, de l’innocuité et de l’efficacité thérapeutique de nos agents du fait de la multitude de paramètres physiopathologiques (génétiques, immunologiques, structuraux) entrant en jeu dans la genèse et la progression tumorale. Aussi la physiologie générale d’un organisme vivant ne peut pas être mimée in vitro. Il est notamment très complexe de reproduire la physiopathologie de paramètres tels que la perméabilité des barrières cellulaires, la taille, l’état de vascularisation, la tortuosité des vaisseaux, le grade de la tumeur, l’homogénéité et la structure des matrices extracellulaires etc… paramètres clefs pour s’approcher de la pathologie humaine.

Réduction

Conformément au principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), le nombre d’animaux utilisés sera strictement limité aux besoins scientifiques. Une phase de mise au point expérimentale est prévue afin d’évaluer la variabilité du modèle, d’optimiser les conditions expérimentales et de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour l’étude. Le nombre d'animaux sera ajusté en fonction des résultats obtenus lors de la phase de mise au point (taux de pousse tumorale). Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données. L’injection de cellules tumorales sera optimisée pour améliorer la prise tumorale. En cas de résultats insuffisants, d’autres milieux d’injection seront testés pour maximiser l’efficacité de prise tumorale tout en respectant les objectifs scientifiques. La réutilisation des animaux sera envisagée uniquement si l'animal n'a pas vécu de signes cliniques sévères, et après validation vétérinaire. Les animaux sans pousse tumorale pourront être réintégrés dans l’étude sous conditions strictes : absence d’effets secondaires, bonne santé, délai de 5 semaines, et imagerie médicale confirmant l’absence de tumeur. Une seule tentative de réinduction tumorale sera autorisée. Les animaux présentant une pousse tumorale non exploitable pourront faire l’objet d’une exérèse tumorale pour constituer une banque de tissu tumorale en vue d’une phase ultérieure du projet. Cette procédure sera réalisée uniquement si la tumeur est facilement dissécable et sans envahissement. Enfin, les animaux réutilisables pourront être affectés à d’autres projets (sauf oncologie), à des formations, ou à la récupération de matériel biologiques pour des analyses bioanalytiques, contribuant ainsi à la réduction globale du nombre d’animaux utilisés ultérieurement.

Raffinement

Un suivi rigoureux est assuré tout au long des expériences. Les animaux étant immunodéprimés, recevront une alimentation irradiée et de l’eau filtrée. Elles sont pesées tous les quatre jours, puis plus fréquemment selon leur état clinique (jusqu’à deux fois par jour en cas de signes cliniques ou lors du suivi tumoral). Afin de limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation dès la fin de la phase d’acclimatation. Les zones d’implantation sont palpées un jour sur deux, et les tumeurs détectées sont mesurées au minimum deux fois par semaine (en routine) à l’aide d’un pied à coulisse sur animal vigile. Des procédures d’imagerie pourront être réalisées pour documenter la pousse tumorale. Le suivi clinique est assuré au minimum deux fois par semaine et intensifié selon les scores cliniques, évalués à l’aide d’une grille spécifique au projet. Des points limites prédictifs sont définis pour anticiper toute souffrance. Toutes les procédures (greffes, injections, etc.) sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et analgésie. Des analgésiques et/ou anti-inflammatoires non stéroïdiens seront administrés en post opératoire si nécessaire pour une couverture anesthésique complète. Des mesures de confort seront mises en place lors des procédures : gel ophtalmique pour prévenir le dessèchement oculaire, maintien de la température corporelle (tapis chauffant ou système à sonde rectale), réveil sous lampe chauffante ou en couveuse. Les animaux sont surveillés jusqu’à réveil complet avant retour en hébergement. En cas de chirurgie avec sutures, un hébergement individuel temporaire (

Choix des espèces

L’espèce de souris la plus couramment utilisée en recherche en oncologie est la souris commune Mus musculus. De nombreuses souches consanguines (immunodéficientes ou non) sont disponibles, permettant la mise au point et l’utilisation de modèles pathologiques se rapprochant le plus possible de la clinique humaine. De plus, grâce à leur fond génétique se rapprochant de celui de l’Homme, la Souris est un modèle de choix pour des études comparatives et permet une croissance tumorale assez rapide comparativement au Rat. Les animaux seront des jeunes souris Balb/c nude adultes sevrées et sans thymus (ce qui fait d’elles des souris immunodéprimées, en déficit d’immunité) induites à partir de 6 semaines (optimal selon la bibliographie) et jusqu’à 11 semaines. Les souris Balb/c nude sont très majoritairement utilisées dans la littérature. En plus d’avoir une aplasie du thymus qui ne permet alors plus la production de lymphocytes T (cellules immunitaires), elles perdent également la capacité de produire des lymphocytes B (eux aussi impliqués dans l’identification et la réponse immunitaire), phénomène recherché pour éviter tout rejet des cellules tumorales d’origine humaine.

60 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une injection unique de vaccin dans le muscle de la patte arrière, puis entre quatre et treize pesées, et de deux à huit injections de buprénorphine selon son état. Le porteur prévoit une douleur légère à modérée malgré l'analgésie, une gêne dans les déplacements et une inflammation aux points d'injection, le tout pour mesurer la réponse immunitaire à un candidat vaccin contre le cancer du sein triple négatif. Il écarte l'usage d'invertébrés au motif que leur système immunitaire diffère trop de celui d'un vertébré, et se déclare "obligé" de recourir à la souris.

Objectifs

Le développement de vaccins thérapeutiques contre le cancer, ciblant de nouveaux antigènes exprimés à la surface des cellules tumorales, constitue une approche indispensable pour répondre à un besoin médical urgent, notamment chez les patients ne répondant pas aux traitements conventionnels. Un premier candidat vaccin thérapeutique a été évalué chez la souris et a montré des résultats prometteurs. Cependant, son application reste limitée à un nombre restreint de patients. L’objectif de ce projet est de développer un vaccin thérapeutique ciblant un plus grand nombre d’antigènes tumoraux, afin d’élargir la population de patients susceptibles de bénéficier de cette approche. Ce nouveau candidat a été conçu, et nous souhaitons à présent évaluer, dans des modèles murins, sa capacité à induire des réponses immunitaires spécifiques. Ces résultats permettront de valider son potentiel en vue d’un développement clinique chez l’humain.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider un vaccin thérapeutique non personnalisé, qui cible une large partie de la population et qui pourra représenter une nouvelle option de traitement pour les patients ayant épuisé les alternatives thérapeutiques conventionnelles.

Procédures

L’administration du vaccin sera réalisée par voie intramusculaire sur des animaux anesthésiés, avec une contention d’environ 20 secondes par souris. Chaque animal recevra une injection unique. Les animaux seront pesés au minimum une fois par semaine, nécessitant une contention brève d’environ 15 secondes, afin de surveiller leur état général. En fonction de l’évolution de leur état, la fréquence des pesées pourra être augmentée à trois fois par semaine. Le nombre total de pesées effectuées au cours de la procédure sera compris entre 4 (minimum) et 13 (maximum). L’injection sous-cutanée de l’analgésique nécessite également une contention brève, d’environ 20 secondes. Chaque souris recevra au moins deux injections de buprénorphine lors de l’administration du vaccin. En fonction de l’état général des animaux, cette injection pourra être renouvelée jusqu’à un maximum de six injections supplémentaires, en plus de celles effectuées au moment de l’administration du vaccin.

Impact sur les animaux

Suite à l’administration intramusculaire des vaccins dans le muscle de la patte postérieure, les souris pourraient ressentir une douleur légère à modérée, malgré la mise en place d’un traitement analgésique. Cette douleur pourrait entraîner une gêne dans leurs déplacements. L’administration du vaccin ainsi que celle de l’analgésique pourraient également provoquer une inflammation au niveau des sites d’injection. Enfin, les manipulations répétées des souris dans le cadre des injections, des pesées et des surveillances peuvent engendrer un stress transitoire chez les animaux.

Devenir

À l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort conformément aux méthodes réglementaires en vigueur, afin de permettre le prélèvement de certains organes. Ces prélèvements ont pour objectif d’analyser la réponse immunitaire induite par le candidat vaccin.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer et de caractériser un candidat vaccin thérapeutique, potentiellement applicable à un large panel de patientes, en vue de son développement clinique chez l’humain. Conformément aux exigences réglementaires, un produit ne peut pas être évalué en phase clinique sur la seule base de résultats obtenus in vitro. L’évaluation de l’efficacité d’un candidat nécessite donc des essais in vivo dans un organisme entier. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative in vitro permettant de fournir un niveau d’information équivalent pour répondre aux objectifs de cette étude. L’utilisation des invertébrées ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous avons donc recours à un modèle vertébré largement utilisé et reconnu pour ce type d’évaluation préclinique : la souris.

Réduction

Un outil statistique approprié a été utilisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour mettre en évidence une différence significative entre les groupes expérimentaux, tout en garantissant la robustesse des résultats. Par ailleurs, un recueil optimal de données sera réalisé pour chaque animal. Cela permettra de maximiser les informations obtenues par individu et ainsi de limiter le nombre total d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des objectifs scientifiques de l’étude.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés au minimum une semaine dans l’animalerie avant le début des procédures expérimentales. Ils seront hébergés en groupe afin de respecter leur comportement social naturel. L’effet du candidat vaccin sur l’état physiologique des souris sera suivi attentivement. Une observation clinique sera réalisée quelques heures après l’injection, puis quotidiennement, par du personnel formé et compétent. La motricité des animaux sera surveillée après administration du traitement par voie intramusculaire dans la patte. Des points limites précoces ont été définis pour cette étude, incluant des critères d’arrêt de l’expérience cas de souffrance. En cas d’apparition de signes cliniques une prise de température sera effectuée. En cas de fièvre, une administration d’un antalgique sera effectuée.

Choix des espèces

Le modèle murin est un bon modèle pour tester les candidats vaccins car son système immunitaire est bien décrit et proche de l’homme. Des souris femelles adultes de plus de 7 semaines seront utilisées afin de travailler sur des animaux ayant un système immunitaire mature. De plus, les réactifs nécessaires sont largement disponibles. Il n’existe donc pas de méthode alternative susceptible d’apporter le même degré d’information. En effet, l’utilisation des invertébrées ne semble pas judicieuse en raison d’un système immunitaire très différent de celui d’un vertébré. Nous sommes donc obligés de faire appel à un vertébré communément utilisé pour ce type d’étude, la souris.

500 rats vont être utilisés, dix au maximum par groupe, soit une cinquantaine de groupes d'étude, tous tués et autopsiés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection de cellules cancéreuses, humaines ou de rongeur, puis des traitements répétés jusqu'à quatorze semaines après l'injection, avec un prélèvement de sang par semaine sur animal vigile et une ponction de liquide synovial sous anesthésie en fin d'étude. Les produits testés ne sont pas nommés et leur fréquence d'administration reste à définir selon les médicaments de chaque étude, les effets indésirables attendus devant être "abordés avec le client" avant toute mise en œuvre. Les bénéfices annoncés, mieux comprendre les mécanismes d'action et accélérer le développement de médicaments, sont renvoyés au court et au long terme, face à des tumeurs implantées et une mise à mort systématique.

Objectifs

L'objectif du projet est d’évaluer la croissance de tumeur et la réponse à des traitements anticancéreux potentiels en injectant des cellules cancéreuse chez le rat. Les cancers sont des pathologies particulièrement invalidantes dont les traitements ont de lourds effets secondaires et nécessitent d’être constamment améliorés. Les modèles de cancer réalisés chez le rongeur par injection de cellules cancéreuses humaines ou de rongeurs offrent des mesures robustes et reproductibles sur la base de modèles parfaitement décrits, calibrés et admis par la communauté scientifique. L’injection de cellules cancéreuses chez le rongeur permet de mimer différents types de cancers grâce au choix des cellules cancéreuses et à l’endroit où elles sont injectées, et ainsi de tester différents composés pouvant potentiellement réduire ou détruire les tumeurs. Le suivi de l’évolution de la tumeur, de la survie et de l’état général des animaux permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’améliorer la compréhension des mécanismes de résistance au cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés de ce projet de recherche se déclinent à court et long termes. A court terme, ce projet permettra d'obtenir des informations cruciales sur (1) les mécanismes impliqués dans le traitement de différents types de cancers ; (2) la tolérance ou la potentielle toxicité des médicaments testés ; (3) l’efficacité de nouveaux candidats médicament. À plus long terme, ce projet contribuera de manière significative au développement de nouveaux traitements en oncologie. Les données obtenues seront en effet essentielles pour : (1) Affiner la compréhension des mécanismes d'action des nouveaux médicaments ; (2) Guider la sélection des molécules les plus prometteuses pour les essais cliniques ; (3) Optimiser les stratégies des traitements pour une meilleure prise en charge des patients. En fournissant une base solide de connaissances précliniques, avec notamment le suivi de l’évolution des tumeurs, de la survie et de l’état général des animaux, ce projet accélérera potentiellement le processus de développement de médicaments innovants, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques aux patients atteint de cancers.

Procédures

La procédure comporte une injection de cellules cancéreuses : durée de l'opération en fonction du type d’injection 1 minute à 15-30 minutes. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec une gestion appropriée de la douleur pré et post-opératoire. Des radiographies pourront être prises au moment de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et la procédure durera 5 à 10 minutes. Les traitements à tester seront appliqués avant et/ou après l’injection de cellules cancéreuses et répétés tout au long de la durée de l’étude, 14 semaines maximum après l’injection. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon les médicaments utilisés pour chaque étude. Une analyse du sang ou des urines pourra aussi être réalisée au cours de l’étude pour rechercher des marqueurs liés au développement de cancers. Les prélèvements de sang pourront être effectués sur l’animal sans anesthésie et dureront moins de 5 min par animal. Une période minimum d’une semaine de récupération sera nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement, avec au maximum 1 prélèvement par semaine pendant l’étude. Un prélèvement de liquide synovial pourra être réalisé sous anesthésie, à la fin de l’étude uniquement.

Impact sur les animaux

Une observation quotidienne de l’état général des animaux, ainsi qu’une évaluation détaillée 2 fois par semaine du comportement, du poids, seront réalisées tout au long de l’étude afin d’identifier au plus vite une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par les manipulations effectuées. Des nuisances liées au modèle et à l’induction du modèle et au développement de cancer sont attendus dans ce protocole. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer un éventuel traumatisme et une inflammation au niveau des sites d’injections des cellules cancéreuses. Des nuisances liées aux médicaments à tester peuvent être rencontrés, tels qu’une perte de poids, un comportement anormal de l’animal, ou une réaction pendant l’administration. Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avec le client avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique inhérente aux médicaments à administrer.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés. Les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins, urinaires et de liquide synovial seront utilisés pour mesurer la concentration du médicament testé, évaluer sa toxicité ou la réponse de l’animal suite au traitement. Les organes pourront également être utilisés pour mesurer la concentration du médicament, ou regarder la structure des organes par histologie ou imagerie.

Remplacement

De manière générale, les médicaments que nous évaluons in vivo ont fait l’objet d’études préalables réalisées sans animaux, mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des médicaments testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres liés à un individu dans sa globalité. Le cancer étant une pathologie complexe, il n'existe à ce jour aucune méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l'influence de différentes cellules dans le développement de tumeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable pour l’évaluation des composés à testés, tout en prenant en compte le bien-être animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière, enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons des traitements anti-douleurs dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué avec prise de poids 2 fois par semaine et observations de caractéristiques spécifiques au modèle. Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation (ex : au moment de leur pesée et mesure de la tumeur, ou au moment des prélèvements sanguins). Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce au suivi clinique et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié.

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observées chez l'homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de sang parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux agents thérapeutiques.

L'anticorps testé est développé par l'équipe depuis une dizaine d'années et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies, l'enjeu étant ici d'étendre ses indications au cancer du côlon. 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever tumeurs et foie. Chaque animal reçoit une injection unique de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, puis pour certains deux injections d'anticorps par semaine pendant quatre semaines sur animal vigile, avant un prélèvement de sang terminal, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau et une déshydratation. Le porteur écrit que la validation de l'approche exige un "modèle physiologique complet sur animal entier", après des essais déjà menés sur lignées cellulaires et sur tissus de patients.

Objectifs

Le cancer du côlon est la 2ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde et est en augmentation depuis 20 ans. De nouveaux types de traitement faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le côlon. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du côlon. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches au cancer du côlon afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.

Bénéfices attendus

Le cancer du côlon est un grave problème de santé public. Il est très fréquent et ses formes les plus graves se soignent très mal. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et ainsi la survie très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux peut entraîner un stress physique modéré. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané, ainsi que les injections intrapéritonéales répétées d’anticorps, induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre de l’aiguille. Au cours de l’expérience, la croissance tumorale peut occasionner une gêne plus ou moins importante, selon la taille de la tumeur et sa localisation (ventrale, dorsale ou latérale). Dans certains cas, une ulcération cutanée peut apparaître au niveau du site d’implantation des cellules tumorales. De même une déshydratation peut survenir secondairement à la pathologie tumorale.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foie) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble pour le rongement et des tunnels en kraft pour le refuge. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans des cages sur portoir ventilé. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, afin de limiter la douleur et le stress liés à la procédure. Les autres procédures potentiellement invasives ou stressantes seront également effectuées sous anesthésie et/ou analgésie, lorsque cela est nécessaire. Une période d’acclimatation de 14 jours sera respectée avant le début des procédures. Durant cette période, les souris seront laissées sans manipulation pendant les 2 à 3 premiers jours, puis progressivement habituées à la contention au cours de la deuxième semaine. Cette familiarisation permet de diminuer le stress lors des injections répétées et des mesures de suivi (taille tumorale, température corporelle). Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre immédiatement les procédures et de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance excessive

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront âgés au minimum de 8 semaines (adultes) afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Une nécrose, une ulcération de la tumeur ou une paralysie liée aux métastases comptent parmi les effets que le porteur juge possibles, et déclenchent la mise à mort. 400 souris, immunodéprimées ou immunocompétentes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la mamelle, subissent l'exérèse chirurgicale de la tumeur en vingt minutes, jusqu'à quatre prélèvements de sang sous anesthésie et des micro-prélèvements pouvant aller à deux par jour. Le projet sert à caler les conditions de greffe et les fenêtres de traitement pour de futures études de composés, sans qu'aucun traitement y soit encore évalué, à raison de dix souris par groupe et jusqu'à dix études en un an.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. Les études menées dans le cadre de ce projet seront réalisées chez la souris. Les lignées murines utilisées pourront être immunodéprimée ou immunocompétente. L’objectif de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’efficacité anti-tumorale de composés thérapeutiques, consiste à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur en intra-mammaire (dose cellulaire, souche de souris, utilisation de matrice de membrane basale, etc.), leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur intra-mammaire et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de composés thérapeutiques pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

• Sur animal vigile : Administration post-opératoire d’analgésique (2 à 3 fois, 15 s) ; Micro-prélèvement de sang (maximum 2 fois/jour, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) ; Greffe de cellules tumorales (1 injection, 15 s) ; Exérèse chirurgicale de la tumeur (1 fois, 20 min) ; Prélèvement de sang (maximum 4 fois, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal (1 fois, 5 min).

Impact sur les animaux

Douleur légère ou modérée en post chirurgie mammaire. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur, paralysie (dans le cas de métastases).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours ou en fin d’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 10 études sera mené sur 1 an. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule, un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse associée à un anti-inflammatoires non stéroïdiens et un analgésique opioïde. Les conditions d’asepsie en expérimentation animale seront respectées et la température des animaux régulée. Un traitement analgésique adapté sera dispensé jusqu’à 3 jours après l’intervention et une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour s’assurer de la bonne tenue des sutures et de la bonne récupération des animaux. Au-delà de ces jours d’observation post opératoire et dans le cas d’absence de complications, ce suivi sera réalisé, au minimum deux fois/semaine. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur et la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou la mise à mort de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum deux fois/semaine. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée dans la cage pour faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum deux fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral. Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.