Cancers

Greffées de cellules leucémiques puis traitées par des chimiothérapies choisies pour leur toxicité cardiaque, 392 souris reçoivent jusqu'à huit injections par semaine et une échographie sous anesthésie chaque semaine, pendant quatre semaines. Toutes sont déclarées en souffrance modérée et toutes sont tuées, un prélèvement sanguin terminal précédant le prélèvement de leurs organes. Le porteur écrit que les souris ne subiront de leur vivant que des "interventions d'intensité légère à modérée", puis signale, en majuscules, que la greffe de cellules leucémiques peut provoquer paralysie de l'arrière-train, fatigue sévère et amaigrissement. Le projet vise à décrire le métabolisme du cœur soumis à ces traitements, une étape de connaissance dont les patients ne verraient le bénéfice qu'à long terme.

Objectifs

Un grand nombre de traitements utilisés en oncologie sont cardiotoxiques et peuvent aboutir à l’émergence de maladies cardiovasculaires (MCV). Celles-ci peuvent contraindre le corps médical à diminuer voire arrêter le traitement de patients et sont à l’origine de nombreux décès à court et moyen termes. L’amélioration remarquable de la prise en charge thérapeutique de certains cancers a permis une augmentation significative des chances de survie de ces patients. Cela a conduit, pour certains cancers, à ce que les décès liés à la maladie soient dépassés par les décès causés par la cardiotoxicité des traitements. Pour ce projet, nous nous intéresserons à différentes chimiothérapies particulièrement cardiotoxiques utilisées dans de nombreux cancers (leucémies aigues myéloïdes (LAM), pancréas, sein et mélanome). Depuis quelques années, de nombreuses combinaisons thérapeutiques à base de chimiothérapies et d’inhibiteurs métaboliques ont passés le cap des essais cliniques, en particulier dans le cadre des LAM. Ces combinaisons prometteuses semblent permettre une sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements antitumoraux. En parallèle, la recherche sur l’insuffisance cardiaque et les MCV à aussi progressé dans la caractérisation des dépendances métaboliques liés à ces pathologies. Dernièrement, des approches d’inhibition de certaines enzymes du métabolisme ont permis d’obtenir une amélioration des capacités cardiaques dans plusieurs modèles de pathologies aigues ou chroniques. Ce projet a aussi pour objectif de dresser une carte métabolique de la réponse du tissu cardiaque aux traitements antitumoraux afin d’en détailler les dépendances précises. L’objectif final de ce projet est de déceler les dépendances métaboliques communes des cellules cancéreuses et cardiaques afin de sensibiliser les premières au traitement et de protéger les secondes. Pour cela, il est important de comprendre et d’identifier les mécanismes mis en jeux afin de rendre plus favorables la balance bénéfices/risques des traitements antitumoraux. NOUS PRÉCISONS QUE L'AJOUT DE LA SECONDE PROCÉDURE NÉCESSITE LA MISE À JOUR D'UN PROJET DÉJÀ AUTORISÉ AINSI QUE LA MODIFICATION DU NOMBRE TOTAL DE SOURIS QUI PASSE À 392.

Bénéfices attendus

Ce projet mêlant la cardiologie à la cancérologie aura plusieurs objectifs susceptibles de bénéficier à long terme aux patients atteints par ces maladies. Dans un premier temps, ce projet a un intérêt fondamental de par la description et la compréhension du métabolisme cardiaque dans le cadre de l’utilisation de ces thérapies cardiotoxiques. Ces traitements entrainent des mécanismes de toxicité pour les cellules cardiaques connues mais dont on ne sait quasiment rien en termes de perturbation du métabolisme. En décrivant les modulations et régulations du métabolisme des cellules cardiaques nous pourrons aussi mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’émergence de stress (induit ou non par une chimiothérapie) pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. Deuxièmement, nous étudierons les effets bénéfiques potentiels des combinaisons thérapeutiques associant chimiothérapies et inhibiteur métabolique. Ces nouvelles associations de molécules thérapeutiques sont actuellement très étudiées et pourraient fortement modifier les schémas thérapeutiques utilisés en oncologie. Si à travers ce projet nous pourrions montrer un potentiel bénéfice de cardioprotection, nous appuierions alors l’utilisation de ces combinaisons et accélèrerions possiblement leur utilisation en routine. En effet, la validation in vivo de nos hypothèses pourrait bénéficier à de nombreux domaines de la recherche médicale comme en cancérologie ou en cardiologie.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront manipulées de la même manière et uniquement pour des interventions d'intensité légère à modérée de leurs vivant. Un prélèvement de sang sera effectué en terminal (1 minute), directement suivi par la mise à mort des souris. Toutes les interventions que subiront les souris de leur vivant seront des interventions courtes de types injections (8 par semaine maximum, durée quelques secondes) sauf pour l'échographie sous anesthésie (1 par semaine, 10 min). Au total les souris seront manipulées de 1 a 5 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies et de leurs combinaisons sur le cœur dans des modèles murins porteur de tumeurs. Il y aura donc des évènements indésirables, que nous chercherons à réduire à travers l’utilisation des inhibiteurs métaboliques. Ces évènements indésirables, suivis grâce à un scoring rigoureux des souris, peuvent prendre la forme de douleur, de perte de poids, d’inactivité, de stress à la suite des traitement chimiothérapeutiques. LA GREFFE DE CELLULES LEUCÉMIQUES PEUT ENTRAINER DES ÉVÈNEMENTS INDÉSIRABLES SUR LES DERNIÈRES ÉTAPES DE LA MALADIE ; À SAVOIR PARALYSIE DE L'ARRIÈRE TRAIN, FATIGUE SÉVÈRE ET AMAIGRISSEMENT.

Devenir

La mise à mort des souris est nécessaire pour obtenir les résultats voulu pour ce projet. Un grand nombre d'organe seront prélevés à la suite de l'euthanasie pour étudier les mécanismes déclanchés par les traitements anticancéreux toxiques.

Remplacement

Une phase in vitro d’expérimentation a eu lieu avant d’envisager les expériences in vivo. Ces expériences, même si partielles, sont prometteuses et nous motivent à poursuivre nos hypothèses grâce à l’utilisation de modèle murin de cardiopathie induite par des chimiothérapies. Les modèles murins permettent d’avoir un niveau de preuve supérieur de par la complexité d’un organisme vivant en comparaison d’une culture cellulaire maintenue en vie en flasque plastique. Les données que nous mesurerons par échocardiographie sur les souris ne sont pas remplaçables et nécessaires pour démontrer une amélioration des fonctions contractiles du cœur après traitements. De plus, notre projet s'intéressant à l'interraction entre coeur et cancer, cela nous oblige à procéder à des expériences in vivo.

Réduction

Pour chaque combinaison, nous utiliserons un nombre limité de souris (392 au total). Ce nombre reste pourtant élevé de part le domaine de recherche auquel nous appartenons, la cardiologie. En effet, les mesures fonctionnelles faites en échocardiographie nécessitent un nombre assez élevé de souris pour obtenir des résultats robustes et significatifs (8 souris par groupe). En effet, les variations fonctionnelles des paramètres cardiaques mesurés en échocardiographie sont légères (+/-10% parfois) mais ont des conséquences fortes sur l’organisme et peuvent entrainer la mort. Ce nombre de souris necessaire au bon déroulement du projet à été calculé avec l'utilisation d'un logiciel de calcul de cohorte et en utilisant des paramètres rigoureux et des tests statistiques utilisés aussi en clinique. Notre projet vise à étudier l’ajout d’inhibiteurs métaboliques à des traitement chimiothérapeutiques cardiotoxiques. Ces combinaisons sont utilisées dans différents projets d’autres équipes avec qui nous sommes en collaboration. Nous chercherons à mettre en commun certaines expériences pour réduire le nombre de souris engagées dans ce projet. Nous utiliserons au maximum chaque souris et réduirons le nombre de manipulation au strict nécessaire. Chaque souris apportera des données d’échocardiographie, d’histologie mais aussi une analyse complète du sérum et une extraction des cardiomyocytes après traitements. Pour les souris xénogreffées avec des cellules cancéreuses, nous récupérerons aussi les organes touchés par la maladie. Ces analyses s’ajouterons aux expériences initialement prévues par nos équipes collaboratives, permettant d’extraire le plus de données possibles à partir d’un nombre limité de souris.

Raffinement

L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des lanières de papier cartonné sont ajoutées pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les cages possèdent des dômes transparents dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées en rouge de manière à apaiser les animaux. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris (392), d'une souche très étudiée en cardiologie et idéale pour l’étude du cancer de par l’existence de modèles in vivo utilisés couramment à l'internationnal. Nous utiliserons uniquement des souris adultes de 8 à 10 semaines. Ces souris présentent toutes les caractéristiques nécéssaires à l'étude des fonction cardiaque chez l'adulte et ne necessitent pas d'hébergement longue durée que l'on pourrait avoir pour l'étude de souris agées.

Huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et vingt-cinq injections par animal : 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les analyses post-mortem. La douleur attendue vient de la croissance des tumeurs et de la manipulation hebdomadaire. Le projet doit confirmer chez l'animal un résultat déjà obtenu en culture, un agent pharmacologique qui renforce l'activité antitumorale des lymphocytes T. Le porteur situe le bénéfice dans l'élaboration de futures procédures d'immunothérapie, un horizon indéterminé face aux tumeurs et aux injections répétées inscrites dès maintenant au protocole de chaque souris.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, sous anesthésie générale, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes 25 injections sous anesthésie locale, la durée de ce geste est évaluée à moins de 1 minute.

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale. Cette douleur sera modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements et les analyses post-mortem nécessaires à l'étude

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux est indispensable pour valider le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant entier.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps, afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions seront précédées d'une anesthésie locale pour les injections et générale pour les prélèvements, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basées sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

Pour vérifier si un déséquilibre du microbiote intestinal accélère l'apparition de tumeurs cutanées, 32 souris porteuses d'une neurofibromatose de type 1 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la peau de leur dos. Elles boivent des antibiotiques pendant huit semaines au maximum et passent deux fois sous anesthésie pour un rasage, une épilation et des photographies du dos. Certaines sont isolées, un stress social que le porteur dit compenser par des abris et des matériaux de nidification. Il présente ce protocole comme un modèle "plus éthique" et moins invasif que les lésions cutanées jusqu'ici pratiquées, alors que l'objectif déclaré est d'évaluer l'efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique qui touche environ un million de personnes dans le monde. Les signes de cette maladie peuvent varier considérablement d’un individu à l’autre, même au sein d’une même famille. L’une de ses caractéristiques les plus visibles est l’apparition de petites tumeurs bénignes sur la peau, appelées neurofibromes cutanés (NFc), dont le nombre et la sévérité sont très hétérogènes. En plus de l’impact esthétique, ces tumeurs peuvent provoquer des démangeaisons, des douleurs et altérer fortement la qualité de vie. Cette grande variabilité suggère que, outre les causes génétiques, d’autres facteurs, notamment environnementaux, pourraient influencer l’apparition et la gravité des symptômes. Le microbiote intestinal désigne l’ensemble des micro-organismes (bactéries, virus, champignons, etc.) qui colonisent le tube digestif. Il joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions physiologiques, telles que la digestion, l’immunité et l’équilibre métabolique. Un déséquilibre de cette communauté microbienne, appelé dysbiose, est fréquemment associé à des pathologies inflammatoires ou tumorales. Des résultats préliminaires obtenus à partir d’un modèle murin reproduisant la NF1 humaine montrent que l’administration d’antibiotiques, connue pour induire une dysbiose, est associée à un développement des NFc. Le lien de causalité entre cette altération du microbiote et les effets observés reste toutefois à établir. Le projet proposé vise précisément à mieux comprendre ce lien et à identifier les mécanismes sous-jacents.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider et approfondir une observation préliminaire concernant l’effet d’un traitement antibiotique sur l’apparition et la progression des NFc. Il a pour objectif de mieux comprendre les liens entre le microbiote intestinal, l’inflammation et la tumorigenèse dans la NF1, ainsi que d’évaluer si ces effets peuvent être modulés par des interventions complémentaires. Les bénéfices attendus incluent des avancées scientifiques significatives sur le rôle des facteurs environnementaux dans la pathogénie de la NF1. Par ailleurs, grâce à un plan expérimental repensé, ce projet vise également à valider un nouveau modèle d’étude de la NF1 plus éthique, en proposant des protocoles moins invasifs ou stressants pour les animaux et cliniquement pertinent, reflétant davantage la diversité des patients.

Procédures

Les antibiotiques à tester seront administrés aux souris dans leur eau de boisson, pendant une période maximale de 8 semaines. Cette méthode est simple et ne cause aucune douleur ni gêne aux animaux, car elle ne nécessite pas d’anesthésie ni de manipulation particulière. Pour observer l’évolution des NFc, des photographies du dos des souris seront prises après un rasage et une épilation localisés. Ces interventions se dérouleront sous anesthésie générale (moins de 5 minutes par animal), afin d’éviter tout stress ou douleur. Deux séances seront réalisées, espacées de plusieurs semaines, dans des conditions standardisées garantissant la reproductibilité des observations et le respect du bien-être animal.

Impact sur les animaux

Les NFc qui apparaissent dans ce modèle murin sont petits, plats et non douloureux. Des études récentes montrent que, chez les personnes atteintes de NF1, ces tumeurs sont souvent moins sensibles aux sensations de chaleur ou de pression que les zones de peau normales. Dans les observations précédentes, les animaux porteurs de la mutation ne présentent aucun signe de souffrance ni de détérioration de l’état de santé avant l’âge d’un an. Le traitement antibiotique utilisé dans cette étude peut toutefois entraîner des effets secondaires, comme des troubles digestifs ou des modifications du comportement. C’est pourquoi les animaux seront surveillés de près tout au long de l’expérience, afin d’identifier rapidement tout signe de gêne ou d’inconfort. Certaines manipulations, telles que le maintien doux pendant quelques minutes ou l’anesthésie courte pour les prises d’image, peuvent entraîner un stress modéré, maîtrisé grâce à un entraînement préalable à la manipulation. L’épilation occasionnelle peut provoquer une irritation cutanée temporaire, systématiquement contrôlée. Dans les cas où des souris doivent être isolées, des mesures spécifiques seront mises en place pour limiter l’impact du stress social, notamment par l’enrichissement du milieu (abris, matériaux de nidification). L’ensemble des procédures a été conçu pour minimiser les effets indésirables potentiels, dans le respect strict des standards de bien-être animal.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des antibiotiques à accélérer la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de reproduire fidèlement la formation des NFc observés chez les patients atteints de NF1. Le modèle murin utilisé ici reste actuellement le seul outil disponible pour l’étude de cette forme tumorale et pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Réduction

L’inclusion des femelles dans cette étude, et probablement dans les futures — rendue possible par l’induction des symptômes via l’antibiothérapie — permet d’optimiser l’utilisation des portées issues des croisements, tout en réduisant la nécessité de générer de nouveaux animaux. Le nombre total de souris par groupe a été défini à partir de la fréquence attendue des lésions, de leur sévérité et du nombre d’observations nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes. Les protocoles, le suivi et les méthodes d’analyse ont été standardisés à partir d’expériences antérieures, permettant une réduction notable du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Toutes les procédures ont été conçues pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort. L’administration des antibiotiques se fait par l’eau de boisson, sans manipulation directe. Les anesthésies nécessaires (épilations et photographies) sont brèves, réalisées avec précautions (utilisation d’un tapis chauffant et d’un gel ophtalmique). Des soins post-interventionnels comme l’application de vaseline limitent les irritations cutanées. L’isolement temporaire de certains animaux sera compensé par un enrichissement environnemental renforcé. Une surveillance quotidienne est assurée par le personnel technique, y compris les week-ends, avec l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être incluant des points limites. En cas de signe de détresse persistant plus de 24 h, l’animal sera retiré du protocole et mis à mort selon les standards réglementaires. Enfin, ce projet permet de valider un modèle reposant sur la dysbiose intestinale comme facteur déclenchant, sans recours aux lésions cutanées jusqu’ici nécessaires. Cette avancée ouvre la voie à des pratiques plus respectueuses du bien-être animal dans les futures études sur la NF1.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est une lignée murine génétiquement modifiée reproduisant fidèlement les manifestations cutanées de la NF1, notamment l’apparition progressive des NFc. Ce modèle constitue à ce jour l’outil le plus adapté pour l’étude des mécanismes pathologiques de la NF1 et pour le criblage préclinique de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés seront des souris mâles et femelles âgées de 45 jours au début du protocole. Ce stade de développement correspond à la période initiale de formation des NFc dans ce modèle, garantissant la pertinence des observations et l’efficacité du suivi longitudinal.

216 souris privées de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec un volume de tumeur autorisé jusqu'à 1 500 mm3. Cent quarante-quatre d'entre elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas sous la peau, cent huit une injection intraveineuse de nanoparticules, trente-six une injection directe dans la tumeur. Le porteur écrit pouvoir "imaginer" une perte de poids et de motricité chez les animaux dont la tumeur grossit. Aucun traitement n'est évalué à ce stade : les 216 souris sont utilisées pour choisir la souche, la dose et la voie d'administration de l'essai thérapeutique à venir, dont l'effectif n'est pas indiqué.

Objectifs

Le cancer du pancréas est la 12e forme de cancer la plus fréquente, mais l’une des plus meurtrières, avec un taux de survie très faible. En France, environ 15 000 nouveaux cas par an (légèrement plus d'hommes que de femmes) sont diagnostiqués avec une incidence en augmentation depuis plusieurs décennies, en partie à cause du vieillissement de la population et de facteurs de risque (tabac, obésité, diabète, alcool...). La survie du cancer du pancréas reste malheureusement l’une des plus faibles parmi tous les cancers, en raison de son diagnostic souvent tardif et de sa progression rapide. En France la survie nette à 5 ans (tous stades confondus) est Hommes : environ 9 % et Femmes : environ 10 %. L’objectif de ce projet est de faire une étude préliminaire (étude pilote) qui lèvera des verrous techniques (variabilité des modèles, voies optimales d’injection des nanoparticules) et scientifiques pour les choix du projet global à venir par la suite. Il s’agit d’une première partie d’étude préclinique pour le développement de nanoparticules thérapeutiques seules ou chargées dans des cellules qui seraient utilisées comme vecteurs. Ces nouvelles nanoparticules seront utilisées dans le traitement du cancer du pancréas. Plus précisément, les nanoparticules seront utilisées en présence de champs magnétiques et ce afin de valider une approche thérapeutique par hyperthermie magnétique. Ceci sera détaillé lors du dépôt de la seconde DAP dans laquelle le protocole thérapeutique sera détaillé. Le projet se découpe en 2 procédures expérimentales : La première procédure expérimentale vise à caractériser le développement tumoral de deux modèles in vivo chez des animaux immunodéficients. La deuxième procédure expérimentale vise à démontrer la tolérance et la bioaccumulation des nanoparticules dans les tissus en comparant deux voies d’administration.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet global sont de pouvoir valider une nouvelle nanoparticule pour le traitement du cancer du pancréas. Cette première partie, courte et considérée pilote nous aidera dans le choix de souche de souris d'intérêt, le type de cellules vecteurs plus pertinentes, la dose de nanoparticules et la voie d'administration d'intérêt. Cela permettra donc de réduire le nombre de groupes expérimentaux par la suite pour l’étude thérapeutique.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : injection de cellules sous-cutanée de cellules tumorales : 144 souris concernées = 5 min /souris - injection intraveineuse : 72 souris saines + 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris - injection intra-tumorale : 36 souris avec tumeurs = 5 min /souris

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Afin d’éviter cela, nous avons prévu un volume maximum de tumeur à atteindre de 1500mm3. L’inoculation de tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs, juste après l’inoculation. Pour la deuxième procédure, l’injection des particules véhiculées dans les différents types cellulaires est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Dans le groupe avec une tumeur, les douleurs dues à l’inoculation de la tumeur en sous-cutanée peuvent apparaître juste après l’inoculation.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer de pancréas afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui-même est une étude pilote pour établir le bon choix de souche de souris, de modèle tumoral et de voie d’administration de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers du pancréas. Une suite est prévue une fois ces informations traitées.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur ainsi que la voie d’administration et les doses optimales à utiliser pour l’utilisation des nanoparticules dans les cellules vectrices. De plus, des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature complétées par des simulations à l’aide d’outils en ligne régulièrement utilisés en recherche.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de trois individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Il s'agit d'animaux OGM, au système immunitaire affaibli. Ils sont donc hébérgés en animalerie spécifique, en environnement controlé afin d'éviter tout risque d'infection et donc éviter un phénotype dommageable.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales qui peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris au système immunitaire déficient « SCID » qui sont considérées les plus pertinentes dans l’étude de tumeurs pancréatiques. Nous utiliserons des mâles et des femelles, tenant compte que la prévalence du cancer du pancréas touche aussi bien les hommes que les femmes. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Les souris qui atteignent un point limite de la grille de score sont mises à mort avant la fin. 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 d'entre elles réutilisées ensuite. Elles reçoivent un candidat médicament puis subissent des prélèvements sanguins répétés, veine caudale, saphène ou sinus rétro-orbital, avant un prélèvement terminal de grand volume qui peut provoquer un arrêt cardiaque. Le projet mesure le devenir sanguin de composés anticancéreux, afin de caler les doses des futurs essais chez l'humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole sont "reformées" vers l'entraînement aux gestes techniques, puis mises à mort.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de caractériser les paramètres pharmacocinétiques (PK), c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme et son temps de demi-vie dans la circulation sanguine. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Afin de maximiser la robustesse des données tout en respectant les principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement), une stratégie d’échantillonnage ainsi que des groupes satellites (groupes supplémentaires pouvant être ajoutés pour divers prélèvements) optimisés seront mis en œuvre. Celle-ci permettra d’obtenir l’ensemble des points de la courbe pour un suivi PK à partir d’un nombre réduit d’animaux, tout en assurant la qualité scientifique des résultats.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance ainsi qu'à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : #Lors de l’injection par intraveineuse ou par d’autres voies d’administration (par exemple : intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, per os…) des candidats médicaments (t-0). # Lors de chacun des prélèvements sanguins. Pour tous les types de prélèvements envisagés (e.g. veine caudale, saphène, submandibulaire, Sinus rétro orbital (SRO)…), l'anesthésie générale n'est pas nécessaire, mais une contention efficace est requise, excepté pour les prélèvements SRO. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale, ou surdosage d’anesthésique (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) éventuelles anesthésies (fixe ou gazeuse s'il y a lieu pour prélèvement terminal). # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection des candidats médicaments et (2) de chacun des prélèvements sanguins aux différent temps (par exemple, 10 minutes, J1, J7, J14, J21 et /ou J28 post traitement). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à cette dose. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. Enfin, de grands prélèvements de sang peuvent induire des problèmes de volémie et d'hématocrites chez les animaux en fonction des volumes et des fréquences de prélèvement de sang. Ici, des volumes toujours inférieurs à 7,5% du volume sanguin circulant sur une semaine glissante ou 10% sur deux semaines glissantes pourront ainsi être prélevé en toute sécurité pour l‘animal. En fonction des besoins de l’étude, un prélèvement terminal, pouvant induire un arrêt cardiaque, pourra être effectué.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure. Un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie pourra être réalisée. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entraînement aux gestes techniques (DAP_FormationHabilitation) avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le projet a été conçu dans une logique de réduction rigoureuse du nombre d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R. Cette réduction repose sur une approche expérimentale optimisée, combinant une planification statistique préalable, une connaissance approfondie des composés testés, et une stratégie d’échantillonnage raisonnée. Avant toute mise en œuvre, chaque candidat médicament fera l’objet d’une caractérisation approfondie (données générées in vitro, propriétés physico-chimiques), permettant de définir avec précision les points de cinétique les plus informatifs. Cette sélection ciblée des temps de prélèvement permet de réduire le nombre de points nécessaires à la modélisation pharmacocinétique, tout en conservant la robustesse des paramètres estimés. Le nombre d’animaux a été choisi en fonction des statistiques adaptées au petit nombre ainsi que de nos connaissances sur la classe thérapeutique de ces candidats médicaments, garantissant une significativité suffisante tout en évitant la surutilisation d’animaux. Lorsque cela est possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur les mêmes individus à plusieurs temps, grâce à l’utilisation de volumes adaptés (micro-échantillonnage ou volumes standards dans la limite des 7,5 % hebdomadaires, ou 10% sur deux semaines glissantes), ce qui permet d’éviter la constitution de groupes satellites pour chaque point de temps. L’ensemble de ces mesures vise à maximiser l’information obtenue par animal, tout en respectant les contraintes éthiques et réglementaires liées à l’expérimentation animale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (cellulose pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Les souris dépourvues de système immunitaire ne seront pas infectées du fait du statut sanitaire préservé de l'animalerie et des manipulations et hébergement en conditions aseptiques. Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période minimale de 5 jours dans le but de limiter leur stress. Afin de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement ainsi qu’à chaque prélèvement. Les animaux seront également pesés avant chaque manipulation ainsi qu’au minimum deux fois par semaine en suivi régulier. Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Pour le prélèvement à l’œil une anesthésie gazeuse ainsi qu’une crème anesthésique locale permettra de diminuer la douleur liée au prélèvement. En fonction des besoins, une exsanguination terminale pourra être effectuée (en fin d’expérience ou en cas d’atteinte de point limite), par ponction intracardiaque ou incision sous-claviculaire de l’artère subclavière ou prélèvement à l'oeil, sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. A la fin du prélèvement, la mort sera assurée par dislocation cervicale ou surdosage d’anesthésique afin de conserver les organes intacts en cas de besoin. Les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation ainsi qu’en cas d’atteinte des points limites. Les analyses statistiques seront appliquées sur l’ensemble de la courbe et non uniquement sur chaque temps indépendamment, augmentant ainsi considérablement la robustesse de ces statistiques. Les souris non entrées en protocole seront utilisées pour l’entraînement à des gestes (DAP_FormationHabilitation) permettant la formation du personnel. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (abacs permettant une allométrie comparative de ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. Nous utiliserons préférentiellement la souche CD-1, plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Cependant d’autres souches de souris (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) pourront être utilisées en fonction des modèles utilisés lors des études d’efficacité anticancéreuse, ainsi qu’en fonction de la structure et du profil des candidats médicament qui seront testés. Les animaux seront livrés à partir de 7 semaines et inclus en expérience à partir de 8 semaines (après un minimum de 5 jours d’acclimatation dans l’EU). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Les souris CD1 seront préférentiellement utilisées. A titre d’exemple le poids de ces animaux sera compris entre 30 g et 37 g au moment de l’inclusion. Cette échelle de poids permet un prélèvement sanguin compris entre 157 µL et 222 µL par semaine (soit un maximum de 7,5% du volume sanguin circulant pouvant être prélevé en toute sécurité par semaine glissante). Si d’autres souches (avec un système immunitaire entier telles que Balb/c, C57BL/6, C3H, Tg32, ou avec un système immunitaire réduit telles que SCID, Nude…) sont utilisées, le volume de sang prélevé sera toujours déterminé selon les recommandations internationales.

436 souris transgéniques humanisées vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à douze prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis une à quatre injections d'un anticorps couplé à une chimiothérapie, censé tuer les lymphocytes régulateurs installés dans la tumeur. Le porteur prévoit une gêne modérée, douleur et perte d'appétit, en fin de procédure pour les souris chez qui le traitement n'aura pas fonctionné, et retient un taux de prise de greffe de 80 % pour dimensionner l'effectif. Toutes sont tuées à l'issue, porteuses de tumeurs, pour des analyses sur tissus, tandis que les bénéfices annoncés restent au conditionnel, un traitement qui "pourrait" être plus efficace, moins toxique et "changer la vie de nombreux malades".

Objectifs

Une immunothérapie est actuellement approuvée pour le traitement de nombreux cancers localisés et métastatiques. Certaines cellules jouent un rôle clé dans la prévention des maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, leur accumulation au sein des tumeurs inhibe l'immunité anti-tumorale, exerçant ainsi un effet délétère sur le traitement des cancers. L'objectif de notre projet est de démontrer qu'un ciblage thérapeutique ciblant et tuant spécifiquement ces cellules intratumorales permettrait de développer des réponses immunitaires anti-tumorales plus spécifiques contre le cancer et moins toxiques pour les tissus sains. Pour cibler ces cellules, nous avons développé une construction comprenant un anticorps (ciblant une protéine spécifiquement exprimé par les cellules immunitaires activées) relié à une molécule de chimiothérapie. Ce médicament pénétrera dans la cellule cible, libérera la chimiothérapie à l'intérieur de celle-ci et induira sa mort. Nous avons développé un tel médicament dans le but de cibler et d'éliminer spécifiquement les cellules d'intérêt. L'objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité de notre médicament injecté par voie intraveineuse pour réduire la tumeur, d'identifier la combinaison optimale d'anticorps et de molécule de chimiothérapie, de déterminer la dose minimale efficace, et d'étudier les toxicités associées dans un modèle murin transgénique humanisé. Nous procéderons également à une comparaison de notre médicament avec le traitement actuellement utilisé en clinique

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un nouveau médicament contre le cancer. En conjuguant un médicament d'immunothérapie à une chimiothérapie, une amélioration du traitement est attendue tout en limitant les effets secondaires. Ce nouveau traitement pourrait être plus efficace et moins toxique que les traitements conventionnels actuels. Par conséquent, les bénéfices attendus sont importants car ce nouveau traitement pourrait avoir un impact significatif sur la vie de nombreux patients. En effet, étant donné que ce nouveau médicament agit sur des cellules immunitaires potentiellement présentes dans tous les types de cancer, il pourrait être utilisé dans de nombreuses indications et changer la vie de nombreux malades.

Procédures

Injection de cellules tumorales, 1 par souris, durée 30 secondes, sous anesthésie locale. Traitement sous anesthésie locale et de 4 à 1 injections/souris en fonction des procédures et des groupes. L'injection dure moins d'1 min. Prélèvements de sang sous anesthésie locale, nombre maximal de 12, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections de cellules tumorales et les traitements entraîneront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire lors de l’injection du produit. Les injections se feront sous anesthésie locale ou générale en fonction du type d'injection. Les tumeurs peuvent entraîner une gène légère pour les souris recevant des traitements et une gêne modérée (douleur modérée, perte d'appétit potentielle) en fin de procédure si le traitement est inefficace. Une toxicité modérée du traitement pourrait être observée (fatigue accrue, douleurs).

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et les organes seront utilisés pour faire des analyses sur tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires ou de modélisation mathématique substitutifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité notamment dans le cadre d’injection de traitement ciblant des populations cellulaires immunitaires du microenvironnement tumoral. L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Les modèles animaux décrits vont permettre d'étudier une nouvelle stratégie de traitement ciblant des populations immunitaires immunosuppressives. Des analyses in vitro ont déjà eu lieu sur un modèle cellulaire. Egalement, le choix du composé a été basé en partie sur les résultats de nos études in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, le taux de prise de ces lignées est estimé à 80%. Cette valeur pourra être affinée lors des premières étapes du projet, pour diminuer le nombre d'animaux utilisés. Compte tenu de la prise de greffe, des critères objectifs d'efficacité de traitement ont été définis. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations intratumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les injections intraveineuses sous anesthésie locale. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleur sont détectés, un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie. Leur système immunitaire a été très largement caractérisé. L'utilisation d'une souche transgénique pour la protéine d'intérêt permettra de tester notre candidat médicament (composé de l’anticorps humain) sur lequel nous avons déjà fait des études in vitro et de réutiliser ces données dans le cadre d’études in vivo. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit 6-8 semaines, correspondant à un développement optimal du système immunitaire.

129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sous la peau du flanc, puis dix injections de prodrogue étalées sur cinq semaines, ou la chimiothérapie de référence cinq jours de suite tous les 28 jours, avant une séance d'imagerie sous anesthésie de moins d'une heure et la mise à mort. Une partie d'entre elles est immunodéprimée, ce qui les expose à un risque d'infection, et les molécules administrées peuvent provoquer une perte de poids et une gêne à la locomotion quand la tumeur devient encombrante. Le porteur annonce une prodrogue active uniquement dans la tumeur, donc "sans effets secondaires" sur les tissus sains, affirme qu'aucun modèle alternatif n'existe, et dit tirer de ses essais antérieurs des arguments en faveur d'une "efficacité redoutable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie plus efficace que la chimiothérapie de référence. Pour cela notre stratégie en deux temps repose sur l’utilisation de nouvelles molécules, délivrant de manière ciblée un agent chimiothérapeutique au sein même des glioblastomes. Cette prodrogue activable transporte une molécule de chimiothérapie sous sa forme inactive, et n’est activée uniquement au sein de la tumeur, présentant donc une efficacité maximale, sans effets secondaires, sur les tissus sains où elle reste sous sa forme inactive. Nous validerons cette approche chez l’animal immunocompétent, permettant d’évaluer sa réponse immunitaire contre le cancer, et chez l’animal immunodéprimé pour évaluer la réponse sur une tumeur humaine. Notre approche s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement.

Bénéfices attendus

L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs.

Procédures

Les animaux recevront une unique injection de cellules tumorales sous la peau (durée 2 minutes). Pour tous les groupes traités en deux temps par la prodrogue, le traitement sera administré 1 fois tous les 7 jours pour 5x2 injections au total (durée de l’acte

Impact sur les animaux

Pour ce protocole, l’implantation tumorale sur le flanc des souris entrainera un léger stress à l’implantation, et sera réalisé sous anesthésie volatile. Chez ces animaux, il est possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer. Les animaux immunodéprimés présenteront un risque faible d’infection. Les protocoles d’imagerie entraineront un stress bref et modéré lié à l’injection des agents d’imagerie à des animaux vigiles. Les administrations de molécules thérapeutiques entraineront un stress bref et modéré lié à l’injection des molécules à des animaux vigiles. Ces molécules thérapeutiques (chimiothérapie de référence et prodrogue d’intérêt) pourraient provoquer une légère perte de poids dans les jours suivants les administrations.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider l’efficacité de la thérapie au niveau cellulaire.

Remplacement

Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider la supériorité en termes d’efficacité de la prodrogue pour la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vitro et in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis d’avoir des arguments en faveur d’une efficacité redoutable sur les tumeurs.

Réduction

Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser cette prodrogue pour la prise en charge du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 129 animaux.

Raffinement

L’existence de points limites, basés sur un scoring clinique, comportemental et adaptés à ces modèles tumoraux, seront utilisés afin de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie, d’une durée inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal. En ce qui concerne le phénotype dommageable des animaux immunodéprimés, ces animaux seront hébergés en environnement stérile (boite, litière, boisson et nourriture) et la manipulation des animaux se fera sous hotte. Nous utiliserons des lignées de cellules tumorales murines qui seront implantées chez des animaux ayant un phénotype non-dommageable lorsque possible.

Choix des espèces

Les études précédentes utilisant notre chimiothérapie activable ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression de l'enzyme d'intérêt au niveau tumoral et ainsi déclencher l’activation de notre molécule. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques similaires aux tumeurs humaines. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.