Cancers

Deux incisions de six millimètres sont pratiquées dans la peau du dos de 164 souris pour déclencher la formation de neurofibromes, tandis que 196 puis 32 autres sont isolées quinze jours en cage individuelle, au sevrage ou à un an. L'effectif déclaré est pourtant de 188 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur peau soit disséquée. Le porteur annonce une douleur aiguë et une baisse d'activité après les incisions, malgré la lidocaïne appliquée au préalable, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il conclut néanmoins que les tumeurs développées par ces souris n'entraînent "pas de phénotype dommageable", au motif qu'elles restent invisibles à l'œil nu, quand les mêmes tumeurs chez les patients humains provoquent, selon son propre texte, démangeaisons et douleurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 3000. Elle se caractérise par l'apparition de nombreuses tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés, qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses de peau. Ces tumeurs, dont le nombre peut atteindre des milliers peuvent causer des démangeaisons et des douleurs et ont un impact majeur sur la qualité de vie du patient. Les mécanismes responsables de leur développement sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. A l’aide d’un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 nous avons récemment montré que (i) le trauma de peau induit le développement de neurofibromes cutanés, (ii) le développement des neurofibromes cutanés est transitoire et suit 3 phases : initiation, progression et stabilisation, chacune caractérisée par des changements cellulaires et moléculaires. En caractérisant ces différentes phases, nous avons identifié deux protéines comme potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les neurofibromes cutanés en phase de progression (croissance) et en phase de progression (croissance) ou de stabilisation (stade mature), respectivement. Le but de la première partie de ce projet est ainsi d’explorer le rôle et potentiel thérapeutique de ces deux protéines dans le développement des neurofibromes cutanés. Pour cela nous utiliserons le modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 développant des neurofibromes cutanés en combinaison avec des outils génétiques ou pharmacologiques. De plus, nous avons observé que dans la peau saine de souris mutantes de la Neurofibromatose de type 1 sans trauma et sans neurofibromes cutanés, la densité de cellules de Schwann (cellules à l'origine des neurofibromes cutanés) était plus importante que dans la peau saine d’animaux sains (contrôles). La deuxième partie de ce projet vise ainsi à caractériser plus en détail la peau saine des souris mutantes pour la neurofibromatose de type 1 et la comparer à celle de souris saines (contrôles).

Bénéfices attendus

Les mécanismes responsables du développement des neurofibromes cutanés sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. Les rôles de deux protéines: la Ténascine-C et la Périostine dans leur développement n’ont jamais été explorés et constituent de nouvelles pistes mécanistiques et thérapeutiques. La peau saine d’individus atteints de la Neurofibromatose de type 1 n’a jamais été caractérisée en détails bien que ce soit une question importante puisque à ce jour, l’hétérogénéité en nombre, taille et localisation des neurofibromes cutanés observée chez les patients reste inexpliquée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale courte (de l’ordre de 10 min) correspondant à l'induction de deux petites lésions incisionnelles manuelles de 6 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur (l'incision est réalisée sur l'épaisseur totale de la peau de la souris qui est très fine, de l'ordre de moins d'1 mm). Cela concerne 164 animaux. Certains animaux seront isolés dans des cages individuelles dès le sevrage à 1 mois, pendant 15 jours avant d’être mis à mort, cela concerne 196 animaux. Finalement 32 animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de l'âge d'un an, pendant 15 jours avant d'être mis à mort.

Impact sur les animaux

Les neurofibromes cutanés développés par les souris mutantes NF1 sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris. Aucun effet nuisible ou indésirable lié à l’absence de Ténascine-C ou à l’inhibition de Périostine n'est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. Des nuisances sont cependant à prévoir suite à l'induction de lésions manuelles (douleur aigüe, diminution des mouvements et de l’activité normale due à l’inconfort), bien que de la lidocaïne soit appliquée préalablement pour en atténuer les effets. Des nuisances liées au stress des manipulations, à la contention des souris, à l’anesthésie générale et aux gestes techniques d’injections sont également à prévoir. Enfin, lorsque les souris seront gardées seules dans des cages isolées, du stress est à prévoir.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour que leur peau puisse être disséquée et analysée.

Remplacement

Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des neurofibromes cutanés et permettant d’évaluer le rôle de ces deux protéines dans ce processus. De plus, il n’existe pas d’inhibiteur pharmacologique pour inhiber l’activité de la Tenascine-C, il est donc nécessaire d’utiliser les animaux mutants pour inactiver la Ténascine-C de façon génétique et évaluer son rôle dans le développement des neurofibrmes cutanés. Enfin, l’hébergement des souris en isolation est le seul moyen de prévenir les morsures et donc les lésions de peau induisant le développement des neurofibromes cutanés.

Réduction

Pour la réduction du nombre d'animaux dans ces procédures expérimentales, nous nous sommes basés sur des expériences similaires déjà documentées dans la littérature. En effet, la connaissance approfondie du modèle de souris NF1, le traitement à la cilengitide, l'inactivation génétique de la Tenascin-C, ainsi que la réalisation de lésions cutanées nous permet d’utiliser des modèles maîtrisés. Cela évite les mises au point préalables, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en se basant sur une analyse statistique, le nombre d'animaux est optimisé pour garantir des résultats statistiquement significatifs avec le minimum d'animaux nécessaires. Cela inclut l'utilisation de techniques comme l'analyse de puissance pour déterminer le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Pour le Raffinement ; de la lidocaïne sera appliquée sur la peau du dos des souris avant la réalisation des lésions afin de limiter la douleur liée à cette procédure. À la suite des lésions, l’état des souris sera évalué une fois par jour pendant une semaine puis deux fois par semaine pour le reste de la durée du suivi (1 mois). Lors de ces visites le poids, l’activité, d’éventuels signes d’inflammation au niveau des points d’injection, une éventuelle paralysie, l’état de stress et de douleur des souris (poils hérissés) seront évalués. En présence de tels signes persistants (plus de 24h), les souris seront mises à mort via une anesthésie générale par dislocation cervicale. Le personnel de l’animalerie nous informe également régulièrement (lors des changements de cages notamment) de l’état de santé des souris. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients atteints de la Neurofibromatose de type 1, les souris mutantes pour la Neurofibromatose de type 1 développent des neurofibromes cutanés dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Les souris gardées seules dans des cages isolées seront hébergées dans un environnement enrichi contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Ces animaux sont également gardés dans des cages transparentes permettant le contact visuel avec les animaux des cages voisines. De plus, les expériences seront réalisées rapidement après isolation, ce qui limitera le temps passé en isolation.

Choix des espèces

Nous avons récemment concu un modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des neurofibromes cutanés et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et le rôle de la Ténascine-C et de la Périostine dans leur développement, ou d'étudier la peau saine mutante NF1. Des animaux adultes âgés de 6 semaines seront utilisés pour qu'ils n'aient pas encore développé de neurofibromes cutanés. Des animaux adultes âgés de 1 an seront également utilisés afin qu'ils aient développé des neurofibromes cutanés matures.

880 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une greffe de cellules de lymphome humain, puis neuf injections de traitement en trois semaines, et des prises de sang au sinus rétro-orbitaire deux fois par mois puis une fois par semaine. À un stade avancé, la tumeur peut se nécroser, le porteur rangeant cette nécrose parmi les nuisances possibles. Le projet est mené avec une entreprise pharmaceutique et des hôpitaux, et vise à amener au moins un des traitements testés jusqu'à un essai clinique de phase 1.

Objectifs

Les lymphomes T cutanés (LTC) sont des cancers relativement rares avec une incidence d’environ 650 nouveaux cas/an en France, qui surviennent chez les personnes plutôt âgées. Aussi, au regard du vieillissement de la population, on peut s’attendre à une augmentation du nombre de cas diagnostiqués par an dans les prochaines années. Dans les formes les plus agressives de la maladie, la survie des patients est faible (entre 20%-30% à 5 ans) car il n’existe pas de thérapie curative excepté la greffe de moelle osseuse mais qui s’adresse à des patients de moins de 60 ans. Afin de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques nous avons pour objectif de tester de nouvelles molécules qui pourront ensuite faire l’objet d’un essai clinique de phase I.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet translationnel en collaboration avec une entreprise pharmaceutique et des hôpitaux dans le cadre d’un projet collaboratif qui permettra d’aboutir à un essai clinique de phase 1 pour au moins un des traitements testés. Notre lien avec nos collaborateurs cliniciens et industriels, nous permettrait d’envisager de proposer au moins 2 nouvelles thérapies seules ou en combinaison.

Procédures

Récapitulatif synthétique des interventions : - 1 injection de cellules tumorales sur souris anesthésiées en début d’expérimentation (2min). - Des prélèvements de sang 2 fois par mois puis une fois par semaine(2min). -9 injections avec les traitements sont réalisées sous la peau ou dans la cavité péritonéale tous les 2 jours sur 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : - La prise de sang 2x/mois puis 1x/semaine au niveau du sinus rétro-orbital - L’inoculation sous-cutanée des cellules tumorales - Les injections des traitements+/-cellules effectrices tous les 2 jours pendant 3 semaines - Le stress dû à la contention/préhension des animaux- A un stade avancé du développement tumoral, une nuisance possible est l’apparition de nécrose de la tumeur.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Dans notre démarche d’établissement de nouveaux modèles d’études des LTC, nous développons en parallèle dans l’équipe de nouvelles approches de culture tridimensionnelles que nous comparons à ceux in vivo afin de les valider. Ce projet financé est en cours de finalisation et permettrait à terme de remplacer en partie l’utilisation d’animaux et de tester des molécules thérapeutiques in vitro. Néanmoins, l’oncogenèse est un processus intégré qui fait intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour compléter nos études.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. La croissance tumorale sera suivie tout au long de l’expérience notamment grâce la détection des cellules dans le sang des animaux ce qui nous permet d’utiliser moins d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les animaux seront hébergés en groupe, recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris non immunocompétentes qui vont permettre la greffe de cellules humaines. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines car à ce stade elles présentent un système hématopoïétique mature (fin puberté) pour permettre un suivi sur au moins 4 semaines post-injection dans de bonnes conditions d’âge de l’animal.

Après des essais menés sur des souris privées de système immunitaire, 50 souris immunocompétentes reçoivent sous la peau des cellules de carcinome pulmonaire à petites cellules. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, maintenues chaque semaine dans un cône de contention en inox pour recevoir en intraveineuse un placebo, un anticorps médicamenteux, une immunothérapie ou les deux traitements associés. Le porteur affirme que ces tumeurs ne sont pas douloureuses chez l'être humain et qu'aucun signe de douleur n'a été observé chez la souris lors des études précédentes, la gravité déclarée restant pourtant modérée. Toutes seront tuées pour peser les tumeurs, mesurer l'infiltration immunitaire et chercher la toxicité sur les organes, en vue d'un essai clinique de phase 1.

Objectifs

Le carcinome à petites cellules du poumon (SCLC), est la forme de cancer du poumon la plus aggressive, avec une survie à 5 ans de seulement 7% avec très peu d'options thérapeutiques actuellement disponibles. L'approbation de nouvelles immunothérapies en association avec un traitement de chimiothérapie conventionnel en première ligne a représenté une nouvelle étape thérapeutique en 2018 avec une diminution du risque de décès d'environ 30% grâce aux réponses prolongées. Cependant, la survie globale à 3 ans reste inférieure à 20 %, dus aux résistances innées et acquises, les options de traitement actuelles restent limitées. Dans ce contexte, notre projet a pour objectif d’utiliser un anticorps médicamenteux qui a montré in vitro son efficacité thérapeutique sur les cellules de cancers cutanés et pulmonaires agressifs mais également in vivo sur un modèle murin immunodéficient (sans système immunitaire fonctionnel). L’objectif du présent projet est d’évaluer l'efficacité du produit étudié seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle murin immunocompétent avant de pouvoir mettre en place un essai clinique chez l’humain.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est l’évaluation du nouveau anticorps médicamenteux Adcitmer utilisé seul ou en combinaison avec une immunothérapie dans un modèle de souris immunocompétentes utilisant une lignée murine de carcinome à petites cellules du poumon. La validation de ce modèle nous permettra d’évaluer le bénéfice d’une bithérapie biomédicament/immunothérapie. L’objectif plus global etant donc d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de contribuer à la mise en place d’un essai clinique de phase 1.

Procédures

Les souris recevront par voie sous-cutanée des cellules de SCLC (cancer à petites cellules du poumon) afin d'établir le modèle tumoral. Les animaux seront injectés une fois par semaine en intraveineuse avec le placebo, le biomédicament Adcitmer, l'immunothérapie Avelumab ou la combinaison des deux traitements. Pour cela les souris seront placées dans un cône de contention le temps de l'application de la pommade anesthésiante et de l'injection en intraveineuse (5-10 minutes par intervention).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress lors des différentes contentions pratiquées : une contention pour l’injection des cellules tumorales en sous cutanée et une contention hebdomadaire en cône de contention pour l'injection en intraveineuse. Une gêne ou légère douleur pourra être subies par les souris lors des injections en sous cutanées ou en intraveineux. Les tumeurs étudiées sont non douloureuses chez l’Homme, chez la souris aucun signe de douleurs n’a été observé durant les études in vivo précédentes.

Devenir

L'évaluation de la masse finale des tumeurs, de l'infiltration immunitaire des tumeurs et l'évalution de la toxicité sur les organes impose la mise à mort de l'ensemble des souris tumorisées.

Remplacement

L’efficacité d'Adcitmer a été préalablement démontrée in vitro en lignées cellulaires de SCLC humaines et sur la lignée murine KP11. L'obtention de données préliminaires in vitro sur ces différentes lignées a permis de limiter le nombre de doses testées dans la recherche d'optimisation des schémas thérapeutiques dans le modèle de xénogreffes de la lignée humaine de SCLC, en modèle souris immundéficient. Grâce à ces expériences préliminaires, nous proposons dans ce projet, d'évaluer la plus-value apportée par une combinaison biomédicament/immunothérapie en testant une dose optimale du biomédicament et non plusieurs.

Réduction

La détermination du nombre de groupes et la dose testée sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Pour les injections en intraveineuse, les souris seront maintenues dans un cône de contention en inox, pour leur générer moins de stress lors de cette manipulation, les souris seront habituées à cette contention 2 fois par semaine avant leur inclusion dans l’étude. De plus, une pommade anesthésiante sera appliquée avant chaque injection en intraveineuse, et une friandise sera donnée aux souris après. Pour limiter toute souffrance des animaux, une grille décisionnelle a été élaborée afin de monitorer l'état de santé des animaux, si l'un des critères de souffrance est atteint, la décision de sacrifier l'animal sera prise. De plus, afin de limiter les souffrances lors de l'euthanasie, un sédatif sera injectée en intrapéritonéal avant le sacrifice.

Choix des espèces

La génération d'une lignée carcinomateuse murine présentant l'ensemble des marqueurs caractérisant les lignées de SCLC humaines, nous permet d'utiliser un modèle de souris immunocompétente pour évaluer notre traitement. Les souris seront receptionnées à 6 semaines de vie, et utilisées à 7 semaines après 1 semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de carcinome et optimal pour évaluer toute toxicité pouvant être liée au traitement par la molécule.

Tuées au plus tard six semaines après la greffe pour que la tumeur soit récupérée et analysée, 3 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de mélanome humain prélevé sur biopsie leur est implanté sous la peau du cou au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes. Une partie d'entre elles reçoit ensuite, huit semaines durant, une injection abdominale quotidienne ou un gavage quotidien cinq jours sur sept, avec irritation possible du tube digestif. La croissance de la tumeur peut provoquer ulcération, changement de respiration, agressivité et mobilité réduite, et la souris est alors tuée dès que le seuil de la grille de score est atteint, seuil que le porteur présente comme une mesure de bien-être.

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau ayant un mauvais pronostic et une incidence croissante, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. De nouvelles thérapies ont permis d’améliorer la prise en charge du mélanome lorsque celui-ci s’est propagé dans d’autres organes, cependant l’inefficacité des molécules thérapeutiques courantes et la toxicité sont des phénomènes très fréquents qui limitent grandement leur bénéfice clinique. Ainsi, l’identification de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces reste un enjeu considérable. Notre projet permettra tout d’abord d’avoir à disposition du matériel biologique en quantité suffisante pour réaliser des tests de molécules thérapeutiques sur des prélèvements de tissus dérivés de biopsie de peau de patients atteints de mélanome. Il permettra également de tester de nouvelles combinaisons de thérapie anti-cancer de la peau dans ce modèle de souris.

Bénéfices attendus

L’inefficacité des molécules thérapeutiques courantes est un phénomène très fréquent chez les patients traités par des thérapies ciblées, notamment dans les cancers de la peau et plus spécifiquement dans le mélanome. La découverte de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces patients sont des enjeux considérables de nos jours. A terme, ce projet va nous permettre de guider la décision thérapeutique chez les patients atteints de mélanome en échec de traitement.

Procédures

La mise en place de ces différents modèles consiste dans un premier temps à implanter un bout de tumeur de peau humaine sous la peau au niveau du cou de la souris. Cette chirurgie se fait sous anesthésie générale et dure environ 30 à 40 minutes. Les souris sont ensuite surveillées sur une cage maintenue à 37°C jusqu’à leur réveil (15 minutes). Une injection sous la peau du flanc d’un anti-douleur sera réalisée afin de limiter la douleur de la souris pendant 72h post-opératoire. Les souris seront euthanasiées au bout de 6 semaines maximum afin de récupérer la tumeur. Pour l’autre partie du projet, nous testerons in vivo (sur un animal vivant entier) la meilleure réponse à une combinaison observée ex vivo (sur des fragments de tumeurs). Pour cela des souris ayant subi les mêmes interventions que décrites précédemment recevront une injection quotidienne (5 jours par semaine) dans l’abdomen ou un gavage une fois par jour (à l’aide d’une sonde de gavage) d’un ou plusieurs inhibiteurs de protéines impliquées dans le développement du mélanome (durée : 30s, sur souris éveillées) pendant 8 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Suite à la croissance des tumeurs et/ou au développement de métastases, une perte de poids peut être observée. Un développement trop important de la tumeur peut également induire une ulcération, un changement de la respiration ou encore une agressivité. Une réouverture de la zone d’implantation de la tumeur ainsi qu’une infection, inflammation ou irritation peuvent être observées. Les souris peuvent présenter une mobilité réduite si la tumeur atteint une taille trop importante. Enfin, la thérapie médicamenteuse peut se révéler légèrement toxique, ce qui se manifestera par une perte de poids principalement ou un gonflement de l’abdomen. Certains traitements étant administrés par gavage (1 fois par jour, 5 jours/7), une irritation du tube digestif est possible.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de collecter la tumeur qui sera analysée et conservée afin de caractériser au niveau cellulaire l’effet de la thérapie

Remplacement

Nous réalisons au maximum des expériences en utilisant des fragments de tumeurs in vitro (sans utilisation d’animaux) qui permettent de déterminer les meilleures combinaisons thérapeutiques. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles animaux vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de nos résultats in vitro sans utiliser un modèle animal entier vivant.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. De plus, les cellules cancéreuses dont le nombre a été augmenté dans la première partie du projet sont utilisées pour trouver in vitro (sans utilisation d'animaux) les traitements les plus efficaces, permettant ainsi de réduire le nombre de groupes de souris utilisées dans la seconde étape du projet.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte la taille de la tumeur, l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. La tumeur sera mesurée deux fois par semaine afin d’anticiper une potentielle souffrance. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée, perte de poids importante) et de tumeur d’une taille importante (définie dans la grille de score) avec ou sans ulcération, la souris sera immédiatement euthanasiée selon une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Les modèles de greffe de tumeurs humaines sur des souris sont bien décrits dans la littérature scientifique et sont pertinents pour l’étude de l’effet de thérapies sur la croissance de ces tumeurs humaines. Le mélanome étant un cancer qui se développe chez l’adulte, ainsi des souris adultes âgées de 5 semaines, âge permettant une prise de greffe efficace seront utilisées dans ce projet.

Deux séances d'irradiation locale du thymus, des injections pratiquées directement dans le thymus ou les ganglions mésentériques après incision de la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries : 9 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour le prélèvement de la tumeur, du foie, des intestins, des ganglions, de la rate et du thymus, le porteur indiquant vouloir obtenir le maximum de prélèvements au cours d'une seule expérimentation. L'équipe veut savoir si des acides biliaires administrés par voie orale rétablissent l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez des patients dont le microbiote a été déséquilibré par des antibiotiques. Elle justifie la souris par des lignées tumorales murines dont l'implantation serait "indispensable" pour étudier l'immunité antitumorale sur un animal vivant et entier.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur. De plus, nous avons montré que les antibiotiques diminuaient le nombre de cellules du thymus (organe d'activation des cellules immunitaires) et que les récepteurs aux acides biliaires étaient exprimés dans cet organe. Nous nous demandons donc si les acides biliaires pourraient restaurer la formation de thymocytes et ainsi améliorer la réponse aux immunothérapies chez les patients.

Bénéfices attendus

Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.

Procédures

Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs sous anesthésie locale (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute). Certains animaux recevront des injections dans les ganglions mésentériques ou dans le thymus : durée maximale 5 minutes sous analgésie et anesthésie générale, une seule fois :utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire ou intrathymique. Certains animaux auront un prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min). Le thymus des souris sera irradié 2 fois localement (durée 7 minutes et 40 secondes), à 5 jours d'intervalle. Certains animaux recevront des injections dans les ganglions mésentériques ou dans le thymus : durée maximale 5 minutes sous analgésie et anesthésie générale, une seule fois.

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne mécanique modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau. L'irradiation locale n'entraîne aucune conséquence pour les animaux dans les conditions où elles sont hébergées. Les injections dans les ganglions ou le thymus entraîneront une douleur légère et transitoire au réveil due à la plaie occasionnée par la section de la peau pour donner accès à ces tissus.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, thymus ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Un médicament analgésique sera administré en cas de douleur. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.

960 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Chacune peut recevoir dix-huit gavages en neuf jours, quatre injections intrapéritonéales, trois injections sous-cutanées, et pour certaines une incision cutanée permettant d'injecter des cellules tumorales dans le foie ou dans le rein, suivie d'une imagerie hebdomadaire sous anesthésie pendant quatre semaines. Le porteur indique que les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids, s'immobiliser ou s'isoler. Il affirme que le microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduit en dehors d'un organisme vivant, et fait de ces modèles un "prérequis nécessaire" avant tout essai clinique.

Objectifs

La vaccination thérapeutique demeure la seule immunothérapie capable d'induire une réponse immunitaire antitumorale spécifique. Cependant la vaccination thérapeutique lorsqu’elle est utilisée en monothérapie s’avère peu efficace. Lors de la progression du cancer, la tumeur développe de nombreux mécanismes d’échappement au système immunitaire tels que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins anormaux (appelée angiogenèse tumorale). Cette angiogenèse empêche l’arrivée des lymphocytes T au sein de la tumeur et favorise un environnement hostile au système immunitaire. Il peut donc être intéressant d’associer la vaccination thérapeutique à des traitements ciblant ces vaisseaux sanguins (appelés traitements antiangiogéniques) afin d’améliorer son efficacité. Des travaux ont montré une forte synergie d’action entre ces deux traitements, et cela, uniquement lorsque la vaccination est initiée à l’arrêt du traitement antiangiogénique. L’objectif de ce projet est à présent de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeux qui pourraient expliquer le bénéfice d’une combinaison administrée de façon séquentielle entre un traitement antiangiogénique et la vaccination thérapeutique. Les bénéfices possible d’une trithérapie en associant cette combinaison thérapeutique à d’autres immunothérapies seront également évalués. Ce projet apportera de meilleures connaissances sur la séquence d’administration de plusieurs traitements thérapeutiques et pourra aider aux développement de nouvelles combinaisons thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’impact des traitements antiangiogéniques lors d’une réponse vaccinale. Notre approche longitudinale nous permettra de déterminer la cinétique d’apparition des modifications angiogéniques et immunitaires associées à cette combinaison thérapeutique. Ces résultats pourraient orienter sur le choix des anti-angiogéniques à utiliser en combinaison dans les essais cliniques. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques telle que des combinaisons entre traitement antiangiogénique et vaccin en association à des immunothérapies.

Procédures

Injection par voie sous-cutanée de cellules ou produit : 3 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Gavage 2 fois par jour tous les jours pendant 9 jours, sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours); durée totale du geste 1-2 min. Chirurgie (incision cutanée latérale) : Injection de cellules tumorales dans le foie (1 fois) ou dans le rein (1fois) sur animaux sous anesthésie gazeuse ; durée du geste : 5 min. Imagerie : Injection en intra-péritonéale (i.p) du produit et Imagerie sous anesthésie gazeuse : 1fois/semaine, durée 30 min. Injection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Prélèvement de sang: 1 fois/souris sur souris anesthésiées ; durée du geste : 1-2 min. Chirurgie terminale sans réveil sur animaux sous anesthésie, durée 20 min.

Impact sur les animaux

L’injection par voie sous-cutanée cause un stress de courte durée et n’est pas connue pour engendrer des nuisances ou douleurs. Le gavage cause un stress et une gêne transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoires, risques d’infection et problème de cicatrisation. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 4 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes en vue de l’analyse de la réponse immunitaire et de l’angiogenèse

Remplacement

L’implication du système immunitaire dans la lutte anti-tumorale et le microenvironnement tumoral sont extrêmement complexes, et ne peuvent être reproduits en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à des modèles animaux qui développent des pathologies qui se rapprochent le plus physiologiquement possible de ceux retrouvés chez l’homme. Ces modèles sont fondamentaux pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements thérapeutiques. Ils sont un prérequis nécessaire avant le lancement d’essais cliniques chez l’homme.

Réduction

Certains paramètres expérimentaux ont déjà été déterminés par des études précédentes, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Un nombre d’animaux minimum pour constituer des groupes statistiquement significatifs a été déterminé. Ainsi pour les procédures n’impliquant pas de chirurgie, des groupes de 10 souris par point d’étude sont nécessaires. Pour les procédures impliquant de la chirurgie, des groupes de 12 souris par point d’étude sont nécessaires pour palier une éventuelle hétérogénéité de la réponse immunitaire après chirurgie et/ou d'éventuelles complications post-chirurgie. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les expérimentateurs effectuent un suivi bihebdomadaire des souris. Le vaccin et les différents traitements sont préparés dans des diluants compatibles pour des applications chez l’animal et ne sont pas connus pour être toxiques aux doses utilisées. Les prélèvements de sang et la chirurgie sont réalisés sur animaux sous anesthésie générale. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pré et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. L’alimentation des souris sera adaptée si besoin afin d’assurer leur hydratation et une prise alimentation: croquettes humidifiées, gel hydratant renouvelée 2 fois/semaine. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal idéal pour l’étude du système immunitaire au sein d’un organisme vivant. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car à cet âge là, le système immunitaire est entièrement développé et mature.

Jusqu'à quatre-vingt-dix administrations de traitement en trois mois, neuf séances d'imagerie de quatre-vingt-dix minutes sous anesthésie et douze prélèvements sanguins par animal : 3 600 souris et 200 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever sang, tumeur et organes. Certains reçoivent une greffe tumorale, et les séances d'imagerie peuvent être précédées d'une mise à jeun de quinze heures. Le laboratoire vend ces prestations d'imagerie et de radiothérapie interne à des équipes extérieures, en mettant en avant des équipements "équivalents voire supérieurs" à ceux de l'imagerie humaine. Une partie des souris est immunodéprimée pour faciliter la prise des greffes de tumeurs humaines, d'autres sont génétiquement modifiées pour développer les pathologies étudiées.

Objectifs

Le laboratoire prend en charge des projets scientifiques en proposant plusieurs techniques d’imageries expérimentales chez l’animal de laboratoire, avec des performances technologiques équivalentes voire supérieures à celles des équipements correspondants pour l’imagerie humaine. Des agents de contraste ou des radiotraceurs sont utilisables pour chacune des modalités, et se caractérisent notamment par leur capacité à marquer les espaces vasculaires et interstitiels, ou des évènements moléculaires et cellulaires spécifiques de pathologies (cancéreuses, cardiovasculaires, rénales, métaboliques, neurologiques). L’imagerie anatomique de scanner par rayons-X est en général choisie pour sa grande résolution spatiale. Elle apporte des informations structurelles dans les pathologies affectant le squelette. En effet, elle est largement utilisée pour étudier la structure et la densité osseuse chez les rongeurs. L’imagerie nucléaire permet-elle de l’imagerie fonctionnelle moléculaire et cellulaire et présente la sensibilité la plus importante pour détecter des tissus dont les caractéristiques métaboliques ou biologiques sont anormales. Elle permet de mesurer l’activité métabolique ou moléculaire d'un organe ou d’un tissu grâce à un produit radioactif injecté au préalable (traceur). Cette approche d’imagerie est non invasive. Le laboratoire propose également la réalisation d’études théranostiques, c’est-à-dire de diagnostic couplé à la thérapie. En effet, une thérapie spécifique peut être envisagée de type chimiothérapie, immunothérapie, hormonothérapie ou bien encore le radiotraceur peut être thérapeutique (thérapie innovante appelée : radiothérapie interne vectorisée). Les études d’imageries pourront permettre de suivre l’efficacité de ces traitements. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir prendre en charge des études nécessitant de l’imagerie anatomique ou nucléaire, couplée ou non à de la thérapie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont a) de réaliser des études d'imageries innovantes et non invasives permettant d'utiliser moins d'animaux pour obtenir des résultats fiables b) d'utiliser ces résultats chez l'Homme pour proposer des thérapies classiques adaptées ou des thérapies très innovantes comme la radiothérapie ciblée qui détruit précisément les cellules malades tout en limitant les effets sur les tissus sains.

Procédures

Les animaux pourront avoir une greffe tumorale (sous anesthésie, 1 fois, 10 minutes). Les animaux seront suivis par imagerie non invasive (sous anesthésie, 3 fois par semaine maximum et au total 9 imageries possible sur tout le protocole, 90 minutes maximum). Ces imageries pourront être précédées d'une mise à jeun de 15h maximum. Ils pourront également suivre une thérapie (animal vigile ou anesthésié suivant la voie de thérapie, 90 fois maximum pendant 3 mois pour certaines administrations, quelques minutes, 24 fois maximum pour d'autres) avec un suivi par prélèvement sanguin (animal vigile, 12 fois maximum pendant 3 mois, quelques minutes). En fin d'étude un dernier prélèvement de sang sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront développer un phénotype dommageable pouvant entrainer une sensibilité accrue aux infections, ou des douleurs modérées ou une réduction de la mobilité. Les animaux seront soumis à des anesthésies (greffe, imageries) qui pourront engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Ils pourront également ressentier de la douleur modérée et une perte légère de mobilité suite à la croissance des tumeurs greffées. L'administration des traitements pourront induire un stress aux animaux. Les injections intrapéritonéales et intramusculaires pourront induire une douleur légère au point d'injection. Les injections intraveineuse pourront induire une douleur légère au point d'injection et une irritation de la queue. Les administrations par voie orale pourront induire une irritation de l'oesophage et une fausse route dans de rares cas. Les traitements pourraient induire une perte de poids avec une altération de l'état général des animaux. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et un hématome dans de rares cas.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements pour analyse (sang, tumeur, organes).

Remplacement

Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.

Réduction

Ce projet nécessitera 3600 souris et 200 rats maximum sur les 5 ans d'autorisation. Ce nombre permettra de pouvoir conclure sur l'interêt d'un radiotraceur ou d'un traitement dans une certaine pathologie grâce à une bonne puissance statistique. Le nombre d'animaux a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.

Raffinement

Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes, ou batonnets à ronger) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettront de suivre le bien-être de l’animal. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant une anesthésie gazeuse pour les actes techniques ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car les greffes de tumeurs humaines sont facilitées et validées sur ces animaux. Nous utiliserons également des souris avec un système immunitaire actif pour les greffes de tumeurs murines. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés suceptibles de développer certaines pathologies afin de les étudier grâce à l'imagerie. Nous utiliserons des rats pour réaliser des tests d'imagerie de radiotraceurs et ou produits de contraste sur des plus gros rongeurs. Les rats seront utilisés à l'âge de 12 semaines au stade de jeunes adultes et jusqu'à 17 semaines de vie maximum. Les souris seront utlisées à l'âge de 4 à 5 semaines au stade de jeunes adultes ou entre 1 et 3 mois de vie suivant le développement du phénotype le cas échéant. Le stade jeune adulte pour les rongeurs facilite la prise des greffes. Pour les lignées transgéniques, l'âge sera justifié par le développement du phénotype (entre 1 et 3 mois).