Cancers

1 080 souris vont être utilisées dans le premier volet du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées pour la greffe d'un fragment tumoral pancréatique, elles reçoivent une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, une radiothérapie quotidienne pendant cinq jours, et cinq séances d'IRM d'une heure trente. Le bénéfice avancé tient à des marqueurs d'imagerie que le porteur juge "facilement transposables" en clinique, quand la perte de poids et la croissance tumorale sont, elles, décrites comme attendues. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du milieu tumoral, et compte l'IRM comme une réduction puisqu'elle évite de tuer des souris à chaque temps d'imagerie.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,

Procédures

Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées

Remplacement

Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.

Choix des espèces

Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.

La lignée de souris retenue est dépourvue de certaines cellules immunitaires, ce qui écarte le rejet des cellules cancéreuses greffées. 50 de ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe tumorale sur les deux flancs, dix d'entre elles se voyant en plus implanter une pastille d'hormones quatre jours plus tôt, et les tumeurs sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur écrit que les animaux sont tués à l'issue parce qu'ils "servent d'individu receveur de greffe" et ne serviront pas à d'autres projets, cette étude pilote visant seulement à choisir le modèle qui sera utilisé ensuite.

Objectifs

La sénescence cellulaire est un programme cellulaire déclenché en réponse à divers stimuli tels que des dommages à l’ADN. Les cellules sénescentes sécrètent un cocktail de molécules appelé SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) qui peut modifier l’architecture de la tumeur et ainsi promouvoir la croissance tumorale, l’évasion immunitaire et les métastases. La compréhension des interactions entre cellules sénescentes, leur SASP et les cellules cancéreuses offre l’opportunité de découvrir de nouvelles thérapies efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets des cellules sénescentes et les molécules qu’elles sécrètent sur plusieurs types de cancer (cancer du poumon, du sein ou du foie). Cette étude pilote nous permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour la suite de notre étude in vivo.

Procédures

Toutes les souris recevront une greffe de cellules cancéreuses sur chaque flanc (deux au total par animal) qui formeront des tumeurs solides. Chaque greffe sera réalisée sous anesthésie générale qui durera moins de 5 minutes, le temps d'une piqure d'aiguille. Pour les souris receveuses de greffe de cellules de cancer du sein : chaque animal (10 au total) recevra la greffe d'une pastille d'hormones 4 jours avant la greffe de cellules pour que la tumeur se forme. Cette intervention durera moins de 5 minutes sous anesthésie générale. Après une semaine d'acclimatation et trois fois par semaine jusqu'à euthanasie : l'état global de chaque animal sera observé et pesé (10 secondes par pesée), le volume de chaque tumeur sera mesuré avec un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Nous allons greffer des cellules cancéreuses à des souris et le suivre le développement de tumeurs. Le greffes seront réalisées sous anesthésie légère qui durera moins 5 minutes pour chaque animal. Les procédures que vont subir les animaux peuvent causer du stress et de légères douleurs. Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après la greffe ou lorsque la tumeur atteindra une taille limite. Certaines souris (10 au total) recevront la greffe d'une pastille d'hormones qui durera moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale. Cette procédure peut causer du stress et de légères douleurs au niveau de la zone de greffe. Le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive, le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par mesure avec un pied à coulisse et seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude 3 fois par semaine. Les possibles nuisances liées aux gestes et intervention que vont subir les animaux : stress dû à l'anesthésie, douleur au niveau de la zone de greffe de cellules, douleur au niveau de la zone d'incision pour la pastille d'hormone, stress dû à la manipulation régulière.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils servent d'individu receveur de greffe et ne serviront pas pour d'autres projets.

Remplacement

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas les cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées.

Réduction

Les effectifs de 5 animaux par groupe ont été choisi. Chaque animal recevra deux greffes identiques (une sur chaque flanc), cela nous permet d’obtenir un grand nombre de tumeurs en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Nous obtiendrons une réponse statistiquement significative et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. En raison du déficit immunitaire partiel des souris choisies, des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. La nourriture ansi que l’eau sera desinfecté ou stérilisé. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 3 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas certaines cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées. Nous utiliserons des souris âgées de 5 à 6 semaines. C'est un âge où l'animal est considéré adulte et peut supporter au mieux la greffe de cellules.

Anesthésiées pour recevoir une greffe de tumeur pancréatique, les souris reçoivent ensuite une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis une radiothérapie de cinq minutes par jour pendant cinq jours, avant cinq passages en IRM d'une heure trente sous anesthésie. 1 080 souris vont être utilisées dans ce volet du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre deux établissements, ce que le porteur compte parmi les sources de stress, et développent des tumeurs entraînant une perte de poids. Toutes sont tuées à l'issue pour que les tumeurs soient analysées.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,

Procédures

Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées

Remplacement

Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.

Choix des espèces

Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.

Les autorités réglementaires exigent des données pharmacologiques avant tout essai clinique, et c'est ce qui conduit à utiliser 1 048 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation sur animal vigile, des injections dans le sinus orbital sous anesthésie, dans la veine caudale en tube de contention et dans le péritoine, un gavage quotidien pendant trois semaines, et pour 400 d'entre elles une greffe de cellules tumorales sous la peau suivie de mesures au pied à coulisse trois fois par semaine. La mise à mort sert à prélever les organes. Le porteur affirme que ces études précliniques "ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro", et décrit le système immuno-hématologique de la souris comme "très similaire" à celui de l'humain.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques. Le projet se déroulera sur deux EU différentes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle. AMENDEMENT : Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des progéniteurs lymphoïdes qui pourront avoir un éventuel effet antitumoral.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois (EU1). 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris (EU1) 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal. AMENDEMENT : L’injection sous-cutanée de tumeurs peut entrainer un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. La manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. Le transport entre les deux animaleries peut également engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles). AMENDEMENT : L’utilisation de l’imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale en évitant la mise à mort sequentielle d’animaux.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal. AMENDEMENT : Des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Lors du transfert, les souris seront transférées dans des boites de transport avec de l’enrichissement et de la nourriture, les 2 établissements étant sur le même palier. Des mesures analgésiques adaptées seront mises en œuvre avec le vétérinaire pour limiter la douleur.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.

Comparer les concentrations sanguines d'un candidat médicament selon qu'il est injecté dans la veine, avalé, glissé sous la peau ou envoyé dans la cavité abdominale : 3 600 rats vont être utilisés pour cela, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique puis jusqu'à huit prélèvements de sang sous anesthésie, sur une période allant de quinze minutes à un mois. Le porteur liste parmi les effets possibles des signes de douleur sur la face, des constrictions abdominales, du sang dans les urines, une perte de poids et une hypothermie, et annonce un arbre décisionnel fondé sur des points limites qu'il ne détaille pas. La mise à mort tient à l'âge : les rats ayant entre 6 et 12 semaines, il écrit qu'une seconde procédure ne peut pas être envisagée.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés par comparaison des concentrations sanguines après administration par voie intra veineuse (injection dans la circulation sanguine), qui est la voie de référence, versus une administration par voie autre qu’intra veineuse : orale (administration dans l’estomac), sous cutanée (injection sous la peau) ou intra péritonéale (injection dans la cavité abdominale). L’étude de la biodisponibilité a pour objectif de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la forme galénique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme galénique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les animaux sont administrés par voie intra veineuse (injection dans la circulation sanguine sur animaux anesthésiés), par voie orale (administration dans l’estomac sur animaux vigiles), voie sous cutanée (injection sous la peau sur animaux anesthésiés) ou voie intra péritonéale (injection dans la cavité abdominale sur animaux vigiles) Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique et sous anesthésie. 8 prélèvements maximum sont réalisés par animal (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. - Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin d’obtenir des données expérimentales robustes et des faire des statistiques, un minimum de 3 animaux pas lot sera utilisé (molécule, voie d’administration, dose, formulation) avec 2 lots nécessaires pour calculer les paramètres pharmacocinétiques (comparaison de l’administration directement dans le sang à celle hors circulation sanguine), soit un minimum de 6 animaux. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires et les recommandations (décret officiel et FC3R (société francaise des 3R : Remplacer, Réduire, Raffiner)) . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des rats est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les rats à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix du rat dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiquement de cette tranche d'âges permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches.

Un fragment de tumeur humaine glissé sous la peau, puis un traitement administré par voie orale chaque jour pendant quatre à huit semaines : 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Trois fois par semaine, la tumeur est mesurée au pied à coulisse sur animal contenu. Le sang est prélevé sous anesthésie juste avant la mise à mort, pour savoir si l'ajout d'une molécule à une combinaison déjà utilisée en clinique améliore la réponse dans le mélanome muté. Les souris sont immunodéprimées pour éviter le rejet de la greffe, et utilisées dès cinq semaines parce qu'à ce stade leur système immunitaire est encore peu actif, ce qui favorise la prise tumorale.

Objectifs

Le projet présenté vise à étudier chez la souris l’efficacité anticancéreuse d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans le cas de deux types de mélanome humains (cancer de la peau) non résécable présentant une mutation génétique spécifique. En effet, la moitié des patients atteints de mélanome présentent une mutation d'un gène entrainant un développement incontrôlé des cellules cancéreuses. Un des traitements donnés à ces patients repose sur une combinaison de deux traitements qui vont aller agir de manière différente pour empêcher ce développement incontrôlé des cellules cancéreuses. Même si cette combinaison a pu montrer des résultats prometteurs : 60% de patients répondeurs au traitement dont 10-20% de réponses complètes, rémission, le taux de réponse au traitement et les effets indésirables peuvent encore être améliorés. Nous souhaitons dans ce projet étudier un nouveau traitement qui pourrait ralentir également ce développement incontrôlé, en combinaison avec le traitement déjà utilisé, afin de voir si cette nouvelle combinaison pourrait améliorer la réponse au traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace dans des cancers de la peau.

Procédures

Une implantation de bouts de tumeurs en sous-cutané par chirurgie sous anesthésie gazeuse (5 minutes). Administration quotidienne orale de traitement de quelques secondes pendant 4 ou 8 semaines selon le modèle. Des mesures tumorales au pied à coulisse et des pesées 3x/semaine (quelques secondes). Un réallotement durant quelques minutes induisant un changement d'environnement mais qui restera ensuite le même jusqu'à la fin d'étude. Un prélèvement sanguin submandibulaire ante mortem sous anesthésie (quelques secondes), les animaux anesthésiés sont directement mis à mort par la suite.

Impact sur les animaux

Une rapide chirurgie, qui consiste à glisser sous la peau le bout de tumeur, sera faite sous anesthésie, ce qui entrainera un stress au réveil, la douleur étant traitée via analgésie. L’administration orale journalière pendant plusieurs semaines des traitements va entrainer du stress à la prise en main et de la sensibilité/gêne peut être ressentie à l’injection. Le réallotement des animaux entraine un stress suite au changement d'environnement et de groupe social. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention/prise de l'animal et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort lors de l’atteinte d’un point limite ou si non atteinte d'un point limite,à J100.

Remplacement

Les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et l'environnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles de cancer en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade exploratoire, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur une tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de pouvoir conclure de façon fiable quant à l’efficacité de notre nouvelle combinaison thérapeutique. Nous avons besoin d’un nombre d’animaux qui nous permet d’avoir la possibilité de détecter une différence de volume tumoral significative entre le groupe traité à la combinaison déjà utilisé en clinique et celui traité avec la nouvelle combinaison testée . Connaissant bien ces types de cancer, nous avons recours à un logiciel statistique calculant le nombre d'animaux nécessaire pour arriver à notre objectif.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation pour s'habituer à leur nouvel environnement et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début du projet nous habituerons les animaux à la manipulation. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et les expérimentateurs remplissent une grille plus détaillé si nécessaire afin d’étudier le bien être de l'animal plus précisément et de réagir tout de suite si quelque chose ne va pas pour limiter toute souffrance. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 4 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, batonnet à ronger).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec des animaux présentant un système immunitaire affaibli (immunodéprimé) pour éviter le phénomène de rejet. L'utilisation d'une souche murine immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter ce phénomène. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche immunodéprimée étant un modèle qui permet une bonne réussite de développement de tumeurs à partir de bouts de tumeurs issus de cancers humains. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 semaines afin de favoriser la prise tumorale, car à ce stade les souris n'ont pas encore un système immunitaire très actifs.

Des cellules cancéreuses humaines sont implantées sous la peau du flanc droit de souris anesthésiées, qui reçoivent ensuite une injection intraveineuse par semaine pendant deux à six semaines, avant une ponction intracardiaque terminale. 674 souris NMRI nude, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles changent d'établissement entre la greffe et les irradiations. Le porteur écrit vouloir s'assurer que les animaux ne subissent aucune souffrance, dans un protocole qui repose sur la croissance d'une tumeur greffée, des injections hebdomadaires et une irradiation.

Objectifs

La sénescence est un processus biologique naturel qui intervient en protégeant les cellules contre des stress cellulaires comme le raccourcissement des télomères, les dommages à l’ADN ou encore le stress oxydatif. Durant certains processus naturels, comme par exemple l’embryogénèse, la senescence a un rôle fondamental. Cependant, l’accumulation de ces cellules sénescentes dans l’organisme au cours du temps conduit à l’émergence de pathologies que l’on retrouve majoritairement chez les personnes âgées. Par exemple, les fibroses comme celle du foie, des poumons, des reins ou du coeur, le cancer, les maladies neurodégénératives ou l'arthrose sont des pathologies directement liées à l’accumulation de ces cellules sénescentes. L'objectif de ce projet est la mise au point de thérapies innovantes capable d'éliminer les cellules sénescentes dans les tumeurs. Il s'agit d'un projet multisite.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de valider l'efficacité de nouveaux composés dans le traitement du cancer. Ces thérapies ciblées permettent d'éliminer spécifiquement les cellules sénescentes tumorales responsables des mécanismes de résistance aux drogues et de la formation des métastases. De plus, le ciblage des cellules sénescentes cancéreuses permettra de limiter les effets secondaires associés aux traitements classiques comme la radiothérapie comme par exemple la formation de tissus fibrotique.

Procédures

Les animaux seront greffés en sous-cutané avec des modèles de lignées cellulaire humaines tumorales. Au début du protocole, les souris seront anesthésiés puis des cellules cancéreuses seront implantées sous la peau au niveau du flanc droit. Puis, les animaux se verront injecter différents produits par intraveineuse, une par semaine, durant 2 à 6 semaines consécutives en fonction de la progression des tumeurs. En fin de protocole, les souris seront anesthésiées afin de permettre une ponction intracardiaque puis euthanasiées. L'EU1 sera en charge des xénogreffes sur les animaux ( environs 20 jours de charge) avant leur transfert vers l'UE2 qui prendra en charge les irradiations ainsi ques les injections d'AEDC (30 jours environ).

Impact sur les animaux

Plusieurs éléments peuvent nuire au bien être des animaux et engendrer un stress et une douleur notamment lors des greffes sous cutanées des cellules tumorales et lors des injections intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le protocole expérimental seront mis à mort soit en fin de procédure. En effet, les animaux présentant une tumeur dans le flanc ne pourront être réutilisés ou inclus dans un autre protocole.

Remplacement

Ce projet a pour but le développement de potentielles thérapies ciblées pour la traitement du cancer. Ces études in vivo font suite à de nombreux résultats in vitro qui nous permettent d'affirmer que nos nouveaux ADC présentent un réel intérêt thérapeutique. Cependant, à ce stade du développement de nos recherches, l'utilisation de modèles complexes, comme des modèles de xénogreffes, est requise pour pouvoir prouver l'efficacité thérapeutique de nos candidats. De plus, pour le développement préclinique de nos ADC, nous devons apporté la preuve d'une efficacité sur des modèles complexes en plus d'étude de pharmacocinétique précise des molécules en développement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum tout en maintenant la possibilité d'une analyse statistique des résultats. Etant donné que l'originalité de nos ADC, ces expériences n'ont jamais été faites précédemment dans la littérature.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin de s'assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance. L'apparition de signes évocateurs de souffrance, de mal-être comme la prostation, un comportement erratique ou une altération de l'état général de la souris permettra rapidement, en fonction de la gravité des observations, de procéder soit à une prise en charge de l'animal (administration d'un antalgique) soit à la mise à mort de l'animal concerné. Lors du transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2, nous utiliserons des boîtes de transport de type Novopac opaque (1 seule fenêtre permettant de contrôler les souris ) contenant différents éléments d'enrichissement brique de bois, sciure et nourriture humidifiée (gel diet).

Choix des espèces

La souche NMRI nude athymique sera utilisée dans l'étude de modèles de xénogreffes de cellules humaines cancéreuses en greffées en sous-cutanée. Il s'agit d'un modèle immunodéprimé avec une courbe de poids homogène et couramment utilisée dans la littérature associée à la recherche en oncologie. Ce souche permettra l'évaluation de l'effiacité anti-tumorale de nos candidats médicaments dans des modèles de xénogreffes exprimant les cibles d'intérêts thérapeutiques. Les souris NMRI athymique nude seront âgées de 6-7 semaines lors de la greffe sous-cutanée pour garantir une prise tumorale homogène.