Cancers

Une colite est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson pendant six à sept jours, répétée sur plusieurs cycles, avec diarrhées et perte de poids de 5 à 10 %, et des injections dans l'abdomen déclenchent ensuite un cancer du côlon. 5 004 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le dialogue entre cellules épithéliales et fibroblastes du côlon, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur écrit que la colite provoque une douleur qu'il ne peut traiter ni par analgésique ni par anti-inflammatoire, ceux-ci fausseraient les résultats, et détaille par ailleurs les cabanes en carton, la pâtée et le fond musical installés dans l'animalerie.

Objectifs

Le cancer colorectal est le 3° cancer le plus répandu et le 2° cancer qui tue le plus de patients au monde. Les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, telles que la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, présentent un risque accru de développer un cancer du côlon. Les patients atteints d’un cancer du côlon suite à une inflammation présentent un pronostic plus sombre que ceux atteints d’un autre type de cancer du côlon, car l’inflammation chronique augmente leur agressivité. De plus, souvent indolore, il est fréquemment diagnostiqué aux derniers stades de la croissance tumorale, ce qui diminue l’efficacité des traitements proposés aux patients et augmente la résistance des tumeurs à ces mêmes traitements. Malgré l’ampleur de cette pathologie dans la population, les cellules et les molécules responsables du déclanchement et de la progression de cette maladie restent encore mal comprises. En conséquence, un grand nombre de cas ne sont pas efficacement diagnostiqués puis soignés. Notre projet est centré sur l’étude du dialogue entre les deux types de cellules les plus importantes du côlon. Ces deux types de cellules interagissent entre elles pour maintenir la structure du côlon, le réparer et coordonner la réponse immunitaire mise en place en cas d’agressions. Leur nombre est très fortement augmenté en pathologie et notamment lors d’une inflammation ou pendant la progression du cancer. Découvrir le rôle précis de ces deux types de cellules et les molécules qu’elles libèrent, pourrait ouvrir la voie vers de nouveaux traitements. Les modèles animaux de pathologies intestinales (inflammation aigue et chronique ou cancer du côlon) constituent des outils importants pour étudier le déclanchement et le développement de ces maladies. Par exemple, ils permettent de suivre les changements des tumeurs depuis une tumeur bégnine à une tumeur plus agressive comme cela a été observé chez l’homme. Enfin, les modèles animaux permettent aussi de tester de nouveaux traitements et étudier la réponse des tumeurs à ces traitements.

Bénéfices attendus

Notre projet, centré sur l’étude du dialogue entre les deux types cellulaires majoritaires du côlon, permettra de mettre en lumière de nouveaux mécanismes favorisant ou inhibant le développement du cancer colorectal. A court terme, l’utilisation des modèles animaux des colites aigues, chroniques et du cancer colorectal permettront de délimiter les similitudes entre ces pathologies induites chez l’animal et les caractéristiques des maladies humaines correspondantes. A long terme, la description de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans le dialogue entre les fibroblastes et les cellules épithéliales pourront être proposées dans le traitement des patients atteints de cancer colorectal liés à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin.

Procédures

Les seules interventions sur animal vigile prévues dans cette étude sont des injections intrapéritonéales. Ces injections sont soit unique, comme celle d’un agent inducteur de mutation pour induire un cancer ; soit double, à deux jours d’intervalle, pour induire la perte du gène d’intérêt. Étant donné notre expérience, chaque injection ne dure pas plus 2-3 secondes avant que l’animal ne revienne dans sa cage. Tous les prélèvements d’organes seront réalisés après anesthésie et euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les injections en intrapéritonéal représentent le premier effet indésirable attendu chez les animaux. Notre pratique régulière de ces injections nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Les cages restent sous surveillance rapprochée au moins 20minutes après toute injection pour détecter le plus rapidement possible les signes de souffrance chez les animaux (prostration). Les effets indésirables attendus chez les animaux résultent essentiellement de la prise, dans l’eau de boisson, du traitement qui induit une inflammation localisée au niveau du colon. La prise du traitement pendant 6 ou 7 jours induit une altération de la paroi du colon qui provoque une perte de poids entre 5 à10% chez les souris. Cette perte est due à une mauvaise absorbation des aliments et une perte d’eau suite à des diarrhées. Ces effets apparaissent au jour 6 après le début du traitement pour une perte maximale à jour 8 ou 9, puis les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. Nous n’avons jamais observé une prise d’eau augmentée par les souris au cours de cette procédure, qui pourrait révéler une déshydratation des animaux. D’après la littérature et notre expérience de cette procédure, la perte de poids survient majoritairement lors du 1er cycle de traitement car il est courant que les souris perdent moins de poids lors des deux cycles suivants. Enfin, nos observations des projets précédents montrent que les souris sont susceptibles de développer de multiples tumeurs du côlon avec ce modèle, sans que leur mobilité, leur appétit et leurs relations sociales soient altérées. Comme chez l’homme, la présence de polypes intestinaux est souvent asymptomatique.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans chaque procédure de ce projet seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Nous pouvons envisager de faire des expériences in vitro sur des cellules épithéliales intestinales et des fibroblastes isolés du colon pour étudier le caractère autonome des modifications génétiques dans ces deux types cellules. Par contre, Il n’existe pas d’alternative autre que l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour évaluer avec précision et pertinence, le rôle des nouveaux gènes de notre étude dans le dialogue qui peut se mettre en place entre les cellules épithéliales tumorales et les cellules de l’environnement comme les fibroblastes. Nous utiliserons le modèle souris, permettant l’inactivation des gènes d’intérêt.

Réduction

La demande de projet actuelle reprend des procédures déjà réalisée sur d’autres lignées de souris (dans une demande précédente). Ceci nous permet de définir avec précision le nombre de souris suffisant par groupe, pour chaque procédure, afin de générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Ce nombre a été validé par le service de statistique de notre institut pour atteindre un chiffre permettant de valider statistiquement les résultats observés.

Raffinement

Les colites entrainent une douleur pour laquelle il n’est pas possible d’administrer de traitement analgésique ni anti-inflammatoire, qui interféreraient avec le processus de régénération/cancérisation et donc modifieraient les résultats de l’expérimentation. La surveillance des animaux se fera de manière accrue lors de visites quotidiennes. Certaines souris pouvant être gênées plus que d’autres par la colite, de la nourriture pourra également être placée à même le sol de la cage pour s’assurer que toutes les souris puissent se nourrir correctement. De plus, elles auront à leur disposition dans la cage de la pâtée alimentaire en complément de leurs croquettes habituelles pour favoriser leur réhydratation. L’administration des produits permettant l’élimination des gènes d’intérêts ou l’induction du cancer se fera par voie intrapéritonéale, en changeant d’aiguille à chaque souris pour éviter que celle-ci ne s’émousse et provoque de la douleur chez les animaux. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu grâce à l'ajout dans les cages de cabanes en carton et de cotons à décortiquer. Un fond musical est assuré pour éviter les variantions sonores trop importantes entre les périodes d’expérimentation et les périodes de repos ce qui pourraient générer un stress supplémentaire chez les animaux.

Choix des espèces

La disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les molécules que nous étudions justifie l'utilisation de ce modèle pour nos expériences. Le protocole d'induction du cancer colorectal que nous utilisons est bien standardisé chez la souris et largement admis comme le modèle de référence mimant au plus près les étapes du développement du cancer suite à une inflammation chronique. Notre étude porte sur le dialogue entre les cellules épithéliales et les fibroblastes du colon. Pour cela, nous éliminerons des lignées de souris dans lesquelles les gènes d’intérêt seront supprimés soit dans les cellules épithéliales soit dans les fibroblastes. Les gènes que nous étudions ont été démontrés comme : - Impliqués dans d'autres types de cancer que le cancer colorectal. - sur-exprimés ou sous-exprimés chez les patients atteints de cancer colorectal sans que leur fonction soit encore parfaitement déterminée. Les animaux seront utilisés à partir de 2 ou 3 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature ou lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer colorectal ou de colites chroniques.

1 980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales puis une à trois injections de traitement, la tumeur qui pousse sous la peau étant mesurée au pied à coulisse jusqu'à gêner les déplacements de l'animal. Ulcérations, baisse de température, perte de poids et difficultés respiratoires figurent aussi parmi les effets possibles de la croissance tumorale. L'objectif est de documenter une protéine immunomodulatrice déjà repérée par criblage in vitro, le porteur indiquant que ces études chez l'animal sont "requises" pour que le candidat médicament soit autorisé à passer en clinique.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers et constituent un domaine de recherche en plein essor. Les immunothérapies visent à rendre le système immunitaire plus à même de détruire les cellules tumorales. Cependant, la proportion de patients répondant à ce type de médicaments est pour l’instant trop faible. De plus, ces traitements s’avèrent inefficaces pour certains types de cancers (pancréas, glioblastome, etc.). Pour pallier ces limites, nous tentons de créer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques. Nous avons développé une technologie permettant de produire une grande variété de protéines immunomodulatrices, c’est-à-dire capables de moduler l’activité du système immunitaire. Sur la base de tests (cribles) d’activité immunologique réalisés in vitro, nous avons identifié et sélectionné une protéine immunomodulatrice capable de limiter, chez un modèle souris, la croissance tumorale de deux cancers différents. Ce composé pourrait représenter un médicament pertinent pour lutter contre les cancers. Ces premiers résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez des patients atteints d’un cancer. L’objectif de notre projet est de réaliser ces études précliniques approfondies. Nous évaluerons le candidat médicament pour sa capacité à induire les défenses immunitaires et le contrôle d’un large panel de cancers afin de déterminer ceux pour lesquels il pourrait constituer un traitement pertinent. Nous l’évaluerons aussi en association avec d’autres immunothérapies actuellement utilisées chez le patient afin de déterminer le bénéfice de traitements combinés.

Bénéfices attendus

La proportion de patients répondant aux immunothérapies anticancéreuses actuelles est pour l’instant trop faible et l’efficacité de ces traitements varie en fonction du cancer dont le patient est atteint. La caractérisation approfondie de l’efficacité thérapeutique et du mode d’action de notre candidat médicament permettra de progresser dans : i) l’identification des types de cancers pour lesquels il peut s’avérer efficace, ii) l’évaluation du bénéfice procuré par son association avec d’autres immunothérapies déjà commercialisées, iii) la définition d’un dosage optimal pour une efficacité maximale et une toxicité minimale. Les études précliniques réalisées dans ce projet ouvriront la voie à l’évaluation clinique de l’innocuité et de l’efficacité du candidat médicament chez le patient.

Procédures

Les animaux subiront une injection de cellules tumorales, puis une à trois injection(s) des traitements sera(ont) réalisée(s). Deux prélèvements de sang seront réalisés avec un intervalle de six jours. Les injections et prélèvements de sang seront réalisés en quelques minutes. La croissance de la tumeur sous-cutanée sera suivie par mesure au pied à coulisse. Pour éviter tout stress, les animaux seront anesthésiés avant chaque intervention. Les 1980 animaux mentionnés dans la saisine seront soumis à l’injection des cellules tumorales et aux traitements.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une douleur locale liée aux injections et aux prélèvements. La croissance tumorale peut engendrer différents effets chez l’animal. L’effet le plus fréquent consiste en une gêne dans la mobilité liée à l’encombrement de la tumeur. D’autres effets, plus rares, peuvent être rencontrés. Ainsi, les animaux peuvent présenter une température diminuée, iune ulcération des tissus. De plus, de façon encore moins fréquente, les rongeurs peuvent subir une perte de poids, des difficultés respiratoires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de prélever différents tissus ou organes. Ces organes serviront à des analyses précise des tissus et des cellules permettant d’étudier l’état des défenses immunitaire. Ces données permettront de déterminer ainsi l’effet du traitement sur le système immunitaire en lien avec son impact sur la croissance tumorale.

Remplacement

Notre objectif est de développer de nouveaux médicaments immunothérapeutiques pour lutter contre les cancers. Pour cela, nous avons développé une technologie permettant de produire une très grande variété de protéines immunomodulatrices. Nous avons également mis en place des cribles d’activité immunologique réalisés in vitro permettant de se passer d’animaux dans les premières étapes de sélection de protéines présentant les activités immunomodulatrices les plus adéquates. Ces cribles ont notamment permis de sélectionner le candidat médicament qui fait l’objet de ce projet et qui s’est montré capable de contrôler la croissance tumorale chez la souris lors de travaux préliminaires. Ces résultats prometteurs doivent maintenant être complétés par des études approfondies d’efficacité thérapeutique, de mode d’action et d’innocuité, réalisées chez l’animal. En effet, il est requis de fournir ces études pour que le candidat médicament soit ensuite autorisé par les autorités règlementaires à être évalué en clinique, chez le patient atteint d’un cancer. L’évaluation approfondie de l’efficacité immunothérapeutique de ce candidat médicament doit être faite chez l’animal car aucune technique in vitro ne permet de reproduire le lien complexe entre la croissance d’une tumeur et son contrôle par les défenses immunitaires, ces dernières s’établissant dans un premier temps à distance, au sein d’organes immunitaires, pour migrer ensuite vers le site à protéger.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser pour le bon déroulement du projet a été réduit au minimum de deux manières. Premièrement, par la réduction du nombre d’animaux dans chacun des groupes d’étude. Pour cela, une étude statistique préalable a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour la mesure d’un effet thérapeutique significatif. Deuxièmement, par la réduction du nombre de groupes dans les études d’efficacité du candidat médicament en association avec d’autres traitements actuellement utilisés chez le patient. Pour réduire ce nombre, uniquement deux traitements, chacun représentatif d’un type d’immunothérapie, seront évalués.

Raffinement

Les protocoles que nous utiliserons sont classiquement employés chez l’animal. Pour préserver le bien-être des animaux, ceux-ci seront hébergés au calme en respectant des cycles diurne/nocturne. De plus, ils seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, ceux-ci seront anesthésiés avant l’injection des cellules tumorales, des traitements et des prélèvements. Leur état de santé et l’apparition de signes de souffrance liés au développement d’une tumeur seront surveillés tout au long de l’expérience de façon à intervenir de manière appropriée, notamment via l’utilisation d’analgésiques ou d’antiseptiques. Une grille de score qui permet d’évaluer précisément le bien-être de l’animal, des points limites et critères d’arrêt seront utilisés pour décider de l’euthanasie des animaux.

Choix des espèces

Pour évaluer l’efficacité anti-tumorale du traitement ainsi que son mode d’action, nous travaillerons chez la souris. Pour ce type d’étude, elle représente en effet une référence utilisée par la plupart des chercheurs académiques ou de l’industrie pharmaceutique pour étudier l’efficacité de traitements contre le cancer. Les rongeurs auront entre 8 et 12 semaines car ils présentent un système immunitaire et une physiologie pleinement mature qui s’avère cruciale pour évaluer l’effet de l’immunothérapie sur le système immunitaire ainsi que sur la croissance tumorale.

L'objet réel du projet est de préparer le dossier d'un immunostimulant avant un essai chez l'être humain annoncé pour le second semestre 2025. 20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue pour recueillir le maximum de sérum et prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à 21 prélèvements de sang sur animal vigile et trois injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse. Le porteur passe en revue la modélisation informatique, les tests sur cellules, les technologies omiques, les tissus humains et les organes sur puce, et écarte chacune de ces méthodes au motif qu'elles ne reproduisent pas un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet s'intègre dans le cadre du développement d'un immunostimulant du système immunitaire inné en cancérologie. Le but de projet d’étude préclinique chez le lapin est d’évaluer la réponse inflammatoire du produit avant une étude toxicologique qui sera menée chez l’homme au début du second semestre 2025. L’objectif de ce projet est de mesurer l’effet composé injecté aura pour démontrer sa bonne tolérance chez le lapin à travers des prises de sang et la mesure de plusieurs composantes physiologique (cytokinique) et pharmacocinétique.

Bénéfices attendus

Les besoins de nouveau traitement en oncologies sont importants. Malgré des investissements significatifs de nombreux besoins médicaux restent non couvert et nécessite d’explorer de nouvelle voie thérapeutique. La stimulation du système immunitaire est un axe thérapeutique important pour « réapprendre » à l’organisme à éliminer des cellules cancéreuses de manière autonome et efficace. Les points de contrôle immunitaire (Immune-Check points) ont apporté des avancées significatives en oncologie. Ce projet s’inscrit dans cette optique, avec le développement de nouveau immunostimulant du système immunitaire inné. Contrecarrer les mécanismes d’échappement tumorale mis en place par les cellules cancéreuses devrait permettre à l’organisme de pouvoir identifier et éliminer les cellules cancéreuses. Ce type de traitement est d’autant plus efficace qu’il permet une réponse sur le long terme en réduisant les risques de récidives et de rechute des patients.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 21 prélèvements. - Injection intraveineuse (sous anesthésies profonde gazeuse), environ 10 min, 3 injections. - Mise à mort sous anesthésie profonde chimique

Impact sur les animaux

Un léger stress peut être causé : - par les prélèvements rapprochés - par les injections. - par les contentions lors de l’expérimentation D’après les études faites sur d’autres animaux aucune autres nuisances ne nous a été rapporté. Nous resterons néanmoins vigilants à tous effets imprévus.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

L'objectif du projet est de mesurer l'impact d'un candidat médicament le) sur un organisme ayant un système immunitaire complet et mature et chez une espèce présentant une sensibilité similaire à l'homme. Après discussion avec l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) il a été conclu que le lapin était l'espèce la plus pertinente. Nous avons réalisé des premiers essais sur du sang frais de lapin pour analyser la réponse des globules blancs sanguins au LipoLPS. En revanche une évaluation de la réponse du système immunitaire complet ne peut être réalisée que sur un organisme entier et nécessite l'administration à des lapins. Nous avons étudié les alternatives qui n’ont malheureusement pas pu être retenues : Modélisation informatique/ in silico : Ces modèles peuvent prédire comment un médicament diffusera dans le corps humain. Néanmoins les modèles informatiques n’arrivent pas encore à prédire comment une réaction de type inflammatoire pourra être quantifiable car les paramètres sont trop nombreux. Méthodes in vitro : Les tests réalisés sur des cellules en culture, permettent d'évaluer en partie la réponse inflammatoire. Dans le cas de ce projet, les modèles in vitro ne peuvent pas mimer une réponse complexe avec de nombreux types cellulaires différents. Méthodes in omic : Les technologies omiques, comme la génomique, la protéomique et la métabolomique, permettent d'analyser les réponses biologiques à un niveau moléculaire détaillé. Ces approches peuvent fournir des informations précieuses sur la réponse inflammatoire, là encore la complexité de la réponse ne permets d’obtenir un niveau d’information suffisante (durée de la réaction, évolution des concentrations des molécules cibles …) Utilisation de tissus humains : Les tissus humains, obtenus par exemple lors de chirurgies, peuvent être utilisés pour des tests ex vivo. Cette méthode ne permet pas de mimer l’organisme en entier. Organes sur puce : Ce sont des dispositifs microfabriqués qui reproduisent les fonctions des organes humains. Ils permettent de tester des médicaments et d'évaluer les réponses inflammatoires dans un environnement contrôlé mais comme l’utilisation de tissus humain, ces organoïdes ne peuvent pas mimer un organisme complet.

Réduction

Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés nous n'avons prévu que deux groupes d'animaux : un groupe contrôle et un groupe traité. Ceci est possible grâce à des expériences préalables réalisées chez des lapins porteurs de tumeurs et ayant permis de déterminer une posologie sûre dans le cadre d'une administration intraveineuse lente. L'effectif de cinq lapins a été choisi sur la base de la variabilité attendue dans la réponse au médicament. Les comparaisons entre groupe contrôle et groupe traité seront réalisées à l'aide d'analyses non paramétriques de type Mann-Whitney. Nous avons cherché à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés en n'explorant qu'un seul niveau de posologie du médicament. Ceci a été rendu possible grâce à des études préalables montrant qu'une administration veineuse lente n'entrainait aucun effet secondaire sévère ni irréversible.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus, les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Les injections intra-veineuses seront réalisées sous anesthésie et sur un tapis chauffant. Lors du prélèvement les lapins sont bien maintenus et rassurés. La surveillance de la douleur sera réalisée en utilisant une grille de douleur du masque faciale (degré d’ouverture des paupières et d’aplatissement des joues, la forme du museau, la position des vibrisses et celle des oreilles) Des points limites seront mis en place suffisamment précocement pour limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet.

Choix des espèces

Un test de toxicité a déjà été réalisé sur ce modèle (lapin) et cette expérimentation doit donc se poursuivre sur le même modèle avant de poursuivre les essais chez l’homme. L'objectif du projet est de mesurer l'impact d'un candidat médicament sur un organisme immunitaire complet chez une espèce présentant une sensibilité similaire à l'homme. Après discussion avec l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) il a été conclu que le lapin était l'espèce la plus pertinente était le lapin. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum, environ 1.4kg minimum), cela correspond à l’âge requis pour avoir un système immunitaire mature chez le lapin afin de comparer ces résultats avec l’homme adulte.

Jusqu'à dix-neuf injections sous la peau, trois injections dans la veine de la queue et un prélèvement de sang : 80 souris dépourvues de système immunitaire subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur sang et leur tumeur. Chaque animal porte une tumeur humaine greffée sous la peau, mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine pendant huit semaines au maximum. Le projet vise à vérifier chez la souris l'effet de cellules immunitaires modifiées qui ont déjà éliminé des cellules cancéreuses en culture, pour des cancers de l'ovaire et du sein. L'effectif de 80 animaux repose sur un "outil statistique" que le porteur ne nomme pas.

Objectifs

L’immunothérapie dans le domaine du cancer est une approche thérapeutique qui vise à stimuler le système immunitaire du patient pour qu’il puisse éliminer les cellules cancéreuses. Parmi les approches disponibles, il est possible de récupérer certaines cellules immunitaires du patient, de les modifier afin qu’elles reconnaissent spécifiquement les cellules cancéreuses avant de les réinjecter au patient. Cette approche, appelée thérapie cellulaire, a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Nous avons réussi à générer des cellules immunitaires modifiées capables de reconnaître différents types de cancers, tels que le cancer de l’ovaire et un sous-type de cancer du sein très agressif. De plus, nous avons démontré que ces cellules immunitaires modifiées sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier leur potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, l’objectif est d’évaluer la capacité de cellules immunitaires reconnaissant notre cible à éliminer les cellules cancéreuses des 2 types de cancer dans ce modèle de souris.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer, notamment de cancers de l’ovaire et du sein qui ne répondent pas aux traitements standards. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l’unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les injections intraveineuses (1 injection par semaine pendant 3 semaines, soit 3 IV/souris) se feront au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation). Pour la procédure 1, les injections sous-cutanées de la molécule de soutien des cellules lymphocytes ou sérum physiologique seront réalisées trois fois par semaine pendant 8 semaines maximum soit 19 injections sous cutanée au total. La souris est maintenue 15 secondes pour ce geste. Ces injections seront réalisées dans la procédure 2 que si elles démontrent un effet bénéfique sur l’efficacité du traitement. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur animaux vigiles, l’animal est maintenu immobile environ 50 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Les souris seront également pesées deux fois par semaine, la souris est maintenue environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales en sous-cutanée dans le flanc droit de la souris devrait entrainer une douleur temporaire et légère. A la suite de cette injection les animaux développeront des tumeurs localisées sous la peau de l’animal. Le suivi de la croissance tumorale sera effectué par mesure au pied à coulisse et n’entraînera aucune douleur, à l’exception peut-être d’un léger stress temporaire. L’injection sous-cutanée de molécule de soutien des cellules lymphocytes pourrait entrainer un désagrément voire une douleur temporaire légère. L’injection intraveineuse de cellules immunitaires modifiées pourrait engendrer une douleur légère passagère intraveineuse. Le prélèvement sanguin peut entraîner une douleur modérée, qui est atténuée par l’utilisation d’une anesthésie locale.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.

Remplacement

Ce modèle permettra d’évaluer l’efficacité d’une thérapie utilisant des cellules immunitaires modifiées. Les animaux sévèrement immunodéprimés correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité de ce type de traitement, puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires génétiquement modifiées in vivo, ce qui est un des objectifs de cette étude.

Réduction

La première procédure devrait nous permettre de sélectionner la condition expérimentale permettant d’observer le meilleur effet de notre traitement. Cette condition sera utilisée à la fois dans la procédure 2 et, par la suite, pour évaluer d’autres candidats de thérapie cellulaire. Nous avons utilisé un outil statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour garantir la validité scientifique de l’étude. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal, afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaires pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet n’ont pas de système immunitaire, ils sont donc incapables de lutter contre des infections virales ou bactériennes. Ils doivent être hébergés dans un environnement protégé pour éviter toutes contaminations. Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par l’observation quotidienne des animaux par des personnes compétentes, par la pesée des animaux et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Le prélèvement sanguin peut entrainer une douleur, pour pallier cela les animaux sont traités par un anesthésique local quelques minutes avant le prélèvement.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

Les expérimentateurs injectent des cellules cancéreuses dans le coussinet graisseux de la glande mammaire, sans anesthésie, geste qu'ils décrivent comme rapide et précis. 780 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec cinq minutes d'irradiation sous anesthésie par animal. Les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids, une mobilité réduite et des ulcérations traitées localement, la mise à mort intervenant quand l'ulcération ne s'améliore pas en trois jours. Le porteur écrit par ailleurs que l'irradiation externe n'induit pas d'effet indésirable connu chez la souris.

Objectifs

La radiothérapie aide le système immunitaire à combattre les tumeurs en libérant de l'ADN tumoral. Cet ADN est capté par des cellules spéciales qui activent les lymphocytes, des cellules qui éliminent les cellules tumorales. Ce processus se produit même en dehors de la zone irradiée. Cependant, on ne comprend pas encore bien comment l'ADN tumoral stimule le système immunitaire pendant la radiothérapie. Une enzyme appelée DNASE1L3 dégrade l'ADN libre et empêche normalement une réaction immunitaire. Cette enzyme est produite par certaines cellules du système immunitaire. Des études préliminaires ont montré que, chez des souris avec des tumeurs mammaires, l'absence de DNASE1L3 réduit l'efficacité de la chimiothérapie et la réponse immunitaire. Dans le contexte du cancer, DNASE1L3 pourrait aider à renforcer l'effet de l'ADN tumoral libéré par les traitements anticancéreux. Le projet vise à comprendre le rôle de cette enzyme dans la stimulation du système immunitaire par l'ADN tumoral après radiothérapie, en utilisant un modèle de cancer du sein triple négatif. Pour cela, des tumeurs seront greffées sur des souris avec et sans cette enzyme, puis irradiées. Les tumeurs seront analysées pour comprendre l'impact de l'enzyme sur le traitement par radiothérapie.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, notre projet permettra de mieux comprendre le rôle de la DNASE1L3 sur l’ADN tumorale relargué après irradiation. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension de l’effet de l’irradiation sur les tumeurs. A long terme, il permettra d’apprécier de nouvelle piste thérapeutique, plus spécifiquement dans le cadre du cancer du sein triple négatif, qui aujourd’hui reste encore très difficile à traiter par les traitements classiques. Ce projet pourrait déboucher sur un traitement basé sur la supplémentation Dnase1l3 pour les patientes atteintes par ce type de cancer.

Procédures

Tous les animaux seront injectés avec des cellules cancéreuses au niveau du coussinet adipeux de la glande mammaire. Ce geste est rapide et précis, et ne nécessite pas que les animaux soient anesthésiés. Les animaux seront anesthésiés pendant l’irradiation qui durera 5 minutes par souris. Les souris seront maintenues en contentions maximum 1 minute pour la greffe et pour le suivi clinique.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs orthotopiques dans le coussinet adipeux de la glande mammaire peut induire une perte de poids des souris et une mobilité réduite suivant la taille de la tumeur et sa localisation de prise sur la souris. Pour ce modèle, nous avons fixé le volume de tumeur maximum au-delà desquels les souris devront être euthanasiées pour éviter des douleurs importantes. Pour ces raisons, nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation nous permettant de déterminer des points limites suffisamment précoces afin de limiter la douleur au maximum. A cette fin, les animaux seront surveillés quotidiennement. Les tumeurs sont mesurées deux à trois fois par semaine à partir de l’injection des cellules. Aussi, des signes de souffrance manifestes comme la piloérection, une perte de mobilité ou la prostration de l’animal sont également des points limites adaptés. De plus, nous considérons qu’une souris isolée du reste du groupe est un signe de souffrance et un point limite suffisamment précoce. L’irradiation externe n’induit pas à notre connaissance d’effet indésirable chez les souris.

Devenir

Il est nécessaire d’euthanasier les animaux afin de prélever les tumeurs mammaires et de les utilisés à de fins expérimentales.

Remplacement

Afin d’étudier la fonction de la composante d’intérêt dans l’immunité antitumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitements anti-cancéreux nous utilisons des animaux de phénotype sauvage et déficient en cette composante d’intérêt. Ainsi cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été fixé à 15 par groupe afin d’avoir une analyse statistique robuste, tenant compte de l’hétérogénéité dans la prise tumorale. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel statistique. Concernant la colonie nécessaire à ce projet, les souris femelles seront utilisées pour le modèle de carcinome mammaire, tandis que les souris mâles seront utilisées pour d’autre projet faisant l’objet d’une autre DAP dans un autre institut.

Raffinement

Nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures (décrits dans la section procédure) mises en œuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. L’approche des points limites entrainera une surveillance accrue des animaux (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni. Dans les cas d’apparition d’une ulcération au niveau de la tumeur, un traitement local pourra être appliqué pour traiter l’ulcération. Si celle-ci ne s’améliore dans les 3 jours, la souris sera euthanasiée.

Choix des espèces

Les études débuteront quand les souris auront à minima 8 semaines afin de garantir un système immunitaire mature, et dans le cas du modèle de carcinome mammaire ce délais correspond la maturité sexuelle des souris femelles pour l’injection des lignées E0771-HER2, pour une meilleure vraisemblance avec les cancers du sein humains.

Pour tester un anticorps couplé à une chimiothérapie censé tuer les cellules immunitaires régulatrices installées dans les tumeurs, 244 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une injection de cellules tumorales sous anesthésie locale ouvre le protocole, suivie d'une à quatre injections du produit selon les groupes. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une gêne modérée, douleur et perte d'appétit, en fin de procédure quand le traitement reste inefficace, et qu'une toxicité modérée du produit est possible. Les points limites annoncés sont qualifiés de précis et précoces, sans être détaillés.

Objectifs

Une immunothérapie est actuellement approuvée pour le traitement de nombreux cancers localisés et métastatiques. Cependant, de nombreux effets secondaires sont liés à ce traitement. Pour remédier à cela, l'administration intratumorale d'immunothérapies est apparue comme une solution potentielle, visant à atténuer les effets secondaires grâce à une exposition systémique réduite tout en augmentant l'efficacité. Certaines cellules jouent un rôle clé dans la prévention des maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, leur accumulation dans les tumeurs supprime l'immunité anti-tumorale et ils ont donc un rôle délétère dans le traitement des cancers. L'objectif de notre projet est de démontrer qu'un ciblage thérapeutique ciblant et tuant spécifiquement ces cellules intratumorales permettrait de développer des réponses immunitaires anti-tumorales plus spécifiques contre le cancer et moins toxiques pour les tissus sains. Pour cibler ces cellules, nous avons développé une construction comprenant un anticorps (ciblant une protéine spécifiquement exprimé par les cellules immunitaires activées) relié à une molécule de chimiothérapie. Ce médicament pénètrera dans la cellule cible, relarguera la chimiothérapie dans la cellule et entraînera sa mort. Nous avons développé un tel médicament dans le but de cibler et de tuer les cellules d'intérêt. De plus, l'administration intra-tumorale de ce médicament permettrait de maximiser l’efficacité locale du traitement tout en minimisant sa toxicité systémique. L’objectif de ce projet est donc de montrer l’efficacité de notre médicament dans sa capacité à réduire la tumeur, de trouver la combinaison d'anticorps+molécule de chimiothérapie la plus efficce possible et de déterminer la dose minimale efficace dans un modèle murin transgénique humanisé.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de montrer l’efficacité d’un nouveau médicament contre le cancer. En conjuguant un médicament d'immunothérapie à une chimiothérapie, une amélioration du traitement est attendue tout en limitant les effets secondaires. Ce nouveau traitement via son mode d'administration et sa nature pourrait donc être plus efficace et moins toxique que les traitements conventionnels actuels. Par conséquent, les bénéfices attendus sont importants car ce nouveau traitement pourrait avoir un impact significatif sur la vie de nombreux patients. En effet, étant donné que ce nouveau médicament agit sur des cellules immunitaires potentiellement présentes dans tous les types de cancer, il pourrait être utilisé dans de nombreuses indications et changer la vie de nombreux malades.

Procédures

Injection de cellules tumorales, 1 par souris, durée 30 secondes, sous anesthésie locale. Traitement sous anesthésie générale ou locale en fonction des traitements et 4 injections/souris ou 1injection/souris en fonction des groupes. L'injection dure moins de 1 min.

Impact sur les animaux

Les injections de cellules tumorales et les traitements entraîneront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire lors de l’injection du produit. Les injections se feront sous anesthésie locale ou générale en fonction du type d'injection. Les tumeurs peuvent entraîner une gène légère pour les souris recevant des traitements et une gêne modérée (douleur modérée, perte d'appétit potentielle) en fin de procédure si le traitement est inefficace. Une toxicité modérée du traitement pourrait être observée (fatigue accrue, douleurs).

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et les organes seront utilisés pour faire des analyses sur tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité notamment dans le cadre d’injection d’immunothérapies qui font intervenir le système immunitaire et qui nécessitent un organisme vivant entier. L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Cependant, le choix de la chimiothérapie qui va composer l'ADC a été basé sur des études in vitro réalisées sur des lignées cellulaires. Nous étudierons également la toxicité induite par l'ADC ce qui implique l'utilisation de modèles in vivo puisqu'il n'est pas possible d'évaluer la toxicité sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, le taux de prise de ces lignées est estimé à 80%. Cette valeur pourra être affinée lors des premières étapes du projet, pour diminuer le nombre d'animaux utilisés. Compte tenu de la prise de greffe, des critères objectifs d'efficacité de traitement ont été définis. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations intratumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les injections intraveineuses sous anesthésie locale. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limites précis et précoces ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleur sont détectés, un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie. Leur système immunitaire a été très largement caractérisé. L'utilisation d'une souche transgénique pour la protéine d'intérêt permettra de tester notre candidat médicament (composé de l’anticorps humain) sur lequel nous avons déjà fait des études in vitro et de réutiliser ces données dans le cadre d’études in vivo. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte correspondant à un développement optimal du système immunitaire.