Cancers

2 880 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de tumeur des voies biliaires puis jusqu'à quatre séances de traitement sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aux injections et aux quinze minutes d'anesthésie gazeuse s'ajoutent des prélèvements de sang pratiqués sur animal vigile, auxquels le porteur attache un stress et une douleur légère. Le principe consiste à chauffer la tumeur en excitant par laser ou par champ magnétique des nanoparticules injectées sur place, le volume tumoral étant suivi par échographie. Le bénéfice avancé, un traitement local qui réduirait les doses de chimiothérapie et pourrait s'étendre à d'autres cancers digestifs, reste au conditionnel, quand les 2 880 mises à mort, elles, sont programmées.

Objectifs

Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).

Procédures

- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.

Impact sur les animaux

-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.

75 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à treize séances d'imagerie précédées d'une injection, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein humain triple négatif leur sont injectées directement dans le cœur, ce qui les dissémine dans tout le corps, avec des foyers attendus au foie, aux os et au cerveau, et une perte de poids une fois la maladie avancée. Toutes sont tuées à la fin pour analyse des tissus et des organes. Le porteur annonce qu'en cas de succès un brevet sera déposé et une étude clinique de phase I débutera, ce qui situe le bénéfice pour les patientes à plusieurs étapes de distance des métastases osseuses et cérébrales provoquées ici.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif est une forme particulièrement agressive de la maladie, qui représente environ 15 à 20 % des cas de cancer du sein, et de mauvais pronostic avec un risque élevé de rechute et de métastases au cours des trois premières années suivant le diagnostic. Contrairement à d'autres cancers du sein, ses cellules ne possèdent pas les trois récepteurs habituels (comme les récepteurs d'hormones) qui servent de "serrures" pour les traitements classiques. Faute de cible, les options thérapeutiques restent très limitées et il y a donc urgence à trouver de nouvelles armes sur mesure pour les patientes. Pour bloquer l'agressivité de ces tumeurs, le laboratoire a identifié une cible très précise : une protéine modifiée, qui agit comme un accélérateur de métastases. Il a ensuite développé un mini-anticorps capable de se fixer sur cette protéine pour la bloquer. Les premiers tests en laboratoire ( sur cellules in vitro) ont été un succès, le traitement empêchant efficacement les cellules cancéreuses de s'étendre. Pour vérifier si ce traitement fonctionne dans un organisme vivant, l'équipe souhaite tester son efficacité sur un modèle animal spécifique dont le système immunitaire est très affaibli permettant d'étudier précisément le développement de la maladie humaine et la réaction au traitement au plus près de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Si l'efficacité anti-métastatique du vecteur thérapeutique et sa spécificité pour sa cible est démontrée dans ce projet, un brevet sera déposé et une étude clinique de phase I débutera. A terme, cela ouvrira la voie vers une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée anti-métastatique pour les patients ne bénéficiant actuellement d'aucune alternative de traitement et qui sont orphelins de traitement en cas de rechute par métastases à distance (90% des décès par cancers agressifs par métastases à distance).

Procédures

1- Injection de cellules tumorales : 1 injection, durée environ 10 min. 2- Suivi en imagerie : à J1 post greffe tumorale puis 2 fois/semaine pendant 6 semaines maximum soit 13 séances d'imagerie +injections/souris. Chaque séance dure environ 10 min/souris (injection, anesthésie et imagerie).

Impact sur les animaux

Compte-tenu du type cellulaire et de la voie d'administration, les cellules tumorales se répartissent de façon systémique chez l'animal. Des foyers pourront être localisés au niveau du foie, des os et du cerveau entre autres. Une perte de poids est donc attendue lorsque la maladie sera au stade avancé. Concernant les interventions, aucune douleur particulière n'est attendue puisque qu’elles seront réalisées sous anesthésie générale. Le stress potentiel subi par les animaux sera essentiellement consécutif aux administrations sur animal vigile avant l'anesthésie générale lors de la séance d'imagerie. Concernant les vecteurs, une étude antérieure a été conduite dans les mêmes conditions (greffes identiques en termes de voie d’injection et concentration cellulaire) avec une première construction du vecteur thérapeutique. Aucun animal n’a montré de signe clinique autre que ceux observés dans le cas du même modèle tumoral métastatique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyse sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs (cultures ou organoides) ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier, les interactions avec le microenvironnement, la dissémination métastatique, ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme. L’utilisation des modèles in vivo reste donc indispensable. Ce modèle animal va permettre d'étudier l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique faisant actuellement défaut aux patients atteints de cancer du sein triple négatif.

Réduction

Le critère d'analyse de l'activité anti-tumorale du vecteur sera la variation de la radiance (intensité lumineuse) au cours du temps sur l’ensemble des métastases. Les animaux seront répartis en 5 groupes : les valeurs de radiance seront comparées entre les groupes par un test statistique. Dans le cadre d'une injection intracardiaque, la dispersion des données peut être importante car la prise de greffe et le développement des métastases dépendent fortement du passage systémique initial des cellules. Pour cette étude, le calcul de la taille de l'échantillon a été ajusté à la variabilité inhérente au modèle de métastases par injection intracardiaque. Une analyse de puissance a priori a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations seront réalisées en local par application cutanée d'anesthésiant. Tous les gestes seront réalisés par du personnel formé et habilité. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement l'apparition de signes cliniques. Compte-tenu du type de tumeurs, les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine afin de prévenir d'une détérioration de leur état général. Le suivi en imagerie permettra d'observer précocement le développement métastatique au cours du temps. Des points limite précis ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique sera administré. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine comme le modèle MDA-MB-231. La souris NOD-SCID est privilégiée de part son taux de prise de greffe (environ 80%). Les souris seront adultes (6-8 semaines).

Toutes tuées à l'issue pour "récupération et valorisation des tissus", 2 181 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer de l'ovaire humain chimiorésistant, sont transportées entre deux établissements, puis reçoivent des radioligands couplés à un isotope avant 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie et des prélèvements de sang à la veine saphène. Le porteur attend de cette irradiation ciblée qu'elle abîme l'ADN des cellules tumorales, signale que l'accumulation des radiotraceurs dans certains organes peut provoquer une irradiation localisée des tissus sains, et annonce une observation quotidienne du comportement, rupture du lien social et prostration, sans décrire de test comportemental. Sur le remplacement, il écrit qu'aucune puce microfluidique ni aucun organoïde ne restitue la distribution d'un composé dans un "organisme entier", et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris.

Objectifs

Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet multisite se déroulera sur deux établissemnents utilisateurs et vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeur sous-cutanées ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d'intérets étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.

Procédures

Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphène) sous contention : 1 minute.

Impact sur les animaux

Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé. Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - Stress de la préhension des souris pour les implantations des tumeurs : environs 2 min - Inconfort associé au développement tumoral : légère gène au niveau moteur : environ 2 semaines - Au moment du transfert des animaux : environ 3 jours - Injections des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de la préhension pour sédation - Imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévue, car non invasif et réalisé sous anesthésie Les signes de toxicité possibles sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.

Remplacement

Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.

Réduction

Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Concernant l'hébergement, les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de l'aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.

Les souris employées ici portent un marquage fluorescent de leurs fibroblastes, obtenu par modification génétique, pour suivre ces cellules pendant que la tumeur se développe. 2 862 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène chimique identique à ceux du tabac, une fois par semaine pendant dix semaines pour les tumeurs du poumon, ou dans l'eau de boisson pendant quatre à quatorze semaines pour celles de la vessie, et pour une partie d'entre elles une greffe de cellules tumorales introduite dans la vessie par un cathéter urétral sous une heure d'anesthésie, une tumeur trop volumineuse pouvant ensuite obstruer l'organe et provoquer une rétention d'urine douloureuse. Toutes sont tuées, celles dont le génotype ne sert pas au projet dès l'élevage, les autres pour l'analyse de leurs tumeurs après la mort.

Objectifs

Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies

Bénéfices attendus

Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.

Procédures

Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines. (MODIFICATION) Dans une 3ème expérience, les animaux recevront une greffe de cellules tumorales avec ou sans fibroblastes directement dans la vessie via l’urètre. Ce geste provoque uniquement une gêne à l’animal, ce même geste étant appliqué aux patients atteints de tumeurs de vessie pour apporter localement le traitement anticancéreux[VD1.1]. Les animaux seront anesthésiés au début de l’expérience par injection d’un produit non douloureux pour effectuer ce geste afin de les stabiliser pour le succès de la greffe. Les animaux seront anesthésiés pendant 1 heure le temps de garantir l’entrée des cellules dans la vessie et éviter leur sortie à cause d’une potentielle miction des souris.

Impact sur les animaux

Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre) Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle. (MODIFICATION) Une gêne de courte durée peut survenir suite à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre afin d’injecter les cellules tumorales/fibroblastes dans la vessie.

Devenir

Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem

Remplacement

Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. (MODIFICATION) En effet, nous avons montré in vitro que les CAFs issus de tumeurs humaines de vessies favorisent l’invasion des cellules tumorales de stade précoce. Cependant, l’invasion vers le muscle de la vessie étant critique cliniquement et ne pouvant être mimée in vitro, il nous est indispensable d’utiliser des modèles murins pour le montrer. De plus, seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’étudier l’origine et le devenir de ces populations au cours de la progression tumorale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici. Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure. MODIFICATION L’utilisation de l’imagerie permet de réduire le nombre d’animaux utilisés et suivre la progression tumorale in vivo. Une variabilité interindividuelle est attendue, notamment en raison des différences potentielles de prise de greffe et d’implantation tumorale. Ceci nécessite 15 animaux par groupe afin de pouvoir observer des différences biologiquement pertinentes entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. (MODIFICATION) Les souris opérées seront anesthésiées afin de réduire la gêne liée à l’introduction d’un cathéter dans l’urètre. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la greffe et pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite

Choix des espèces

Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.

40 mini-porcs sont utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour la seconde moitié d'un projet déclaré sur deux établissements. Après implantation de tumeurs cérébrales humaines, chaque animal enchaîne une chirurgie et une imagerie sous anesthésie de trois heures au plus, quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, puis deux examens TEP sous anesthésie de quatre heures au plus, l'intubation et la pose d'un cathéter dans une veine de l'oreille venant après une injection intramusculaire de 10 mL décrite comme douloureuse. Le cerveau et les tumeurs sont prélevés après la mise à mort pour caractériser l'expression de l'enzyme ciblée. Sur le remplacement, le porteur écarte organoïdes et organ-on-chip au motif qu'ils modélisent incomplètement les interactions étudiées, et affirme que "L'utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats".

Objectifs

Les mutations de l'enzyme d’isocitrate déshydrognéase (IDH) constituent un marqueur majeur chez certaines tumeurs cérébrales de l’adulte. Leur diagnostic repose actuellement sur une biopsie cérébrale invasive lourde. De plus, la distinction entre progression tumorale et inflammation après radiothérapie demeure difficile. Ce projet sera réalisé sur deux établissements et vise à développer et évaluer des radiotraceurs ciblant spécifiquement cette enzyme IDH mutée afin d’améliorer le diagnostic et le suivi non invasif de ces tumeurs cérébrales. L’évaluation sera réalisée chez le porc immunodéficient porteur de greffes de tumeurs cérébrales IDH mutées issues de prélèvement de patients. Cette phase expérimentale sera conduite sur l'établissement n° 1. Les radiotraceurs seront caractérisés in vivo par imagerie nucléaire au sein de l'établissement n° 2.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront la validation d’un nouvel outil en neuro-oncologie pour l’exploration des gliomes car, à l’heure actuelle, aucun examen non-invasif n’est suffisamment spécifique et sensible. L’étude préclinique fournira des informations essentielles pour la poursuite d’un radiotraceur candidat vers un passage à l’Homme. Le radiotraceur pourra ensuite plus largement être proposé pour d’autres études cliniques ou précliniques à l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant à la thématique. A long terme, l’objectif ultime serait d’avoir, pour les patients, un examen d'imagerie médicale non-invasif permettant à la fois le diagnostic, l’évaluation de l’éligibilité au traitement, le suivi d’efficacité et la détection de rechute. Enfin, les données acquises lors de cette étude permettront alors d'obtenir des financements pour une études chez l'Homme.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale et une analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 3h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des prises de sang seront effectuées 1-2 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes (total de prélèvements de sang = 4). Dans un second temps, deux examens d'imagerie nucléaire seront réalisés sous anesthésie, dont la durée sera plafonnée à 4h, avec injection de radiotraceur.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - la douleur modérée en postopératoire ; - risque d’infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie d’hébergement : développement des signes cliniques de déficits neurologiques focaux. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues. Lors du premier examen avec réveil de l’animal, le porc sera en anesthésie générale, intubé et aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que de la douleur générée par l’injection du mélange (volume de 10 mL). La procédure se poursuit par la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Un défaut d’anesthésie générale pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau et les tumeurs sur lesquels des examens in-vitro histopathologiques seront réalisés afin de caractériser notamment le niveau d’expression IDH dans les tumeurs.

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP-IRM) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants car les interactions physiopathologiques sont incomplètement modélisées par les systèmes in vitro (organoïdes, organ-on-chip). Les équipements d’imagerie (TEP-IRM) sont adaptés au porc. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celles obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’homme.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelles sans avoir à mettre à mort les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de s'affranchir de la variabilité structurale d'un animal à un autre. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés par radiotraceur (n=8) est un maximum. Par exemple, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (e.g. pas de pénétration intracérébrale du traceur), la procédure s’arrêtera immédiatement. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat et réaliser des caractérisations in vitro de la tumeur.

Choix des espèces

Le porc est le modèle non-primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de l’Homme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car l'injection des tumeurs doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Porteurs de greffes de tumeurs cérébrales issues de prélèvements de patients, 40 mini-porcs immunodéficients sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une chirurgie cérébrale et une imagerie sous anesthésie plafonnées à trois heures, quatre prises de sang sous anesthésie, puis deux examens d'imagerie nucléaire sous anesthésie plafonnés à quatre heures, avec un risque d'hémorragie et d'œdème cérébral pendant la chirurgie. L'objectif affiché est de valider un radiotraceur permettant de repérer sans biopsie une mutation présente dans certaines tumeurs cérébrales, et le porteur ajoute que les données acquises permettront d'"obtenir des financements" pour une étude chez l'humain. Il justifie le choix de l'espèce par la taille du cerveau, compatible avec la résolution de la caméra, et par une organisation neurochimique proche de celle de l'humain.

Objectifs

Les mutations de l'enzyme d’isocitrate déshydrognéase (IDH) constituent un marqueur majeur chez certaines tumeurs cérébrales de l’adulte. Leur diagnostic repose actuellement sur une biopsie cérébrale invasive lourde. De plus, la distinction entre progression tumorale et inflammation après radiothérapie demeure difficile. Ce projet sera réalisé sur deux établissements et vise à développer et évaluer des radiotraceurs ciblant spécifiquement cette enzyme IDH mutée afin d’améliorer le diagnostic et le suivi non invasif de ces tumeurs cérébrales. L’évaluation sera réalisée chez le porc immunodéficient porteur de greffes de tumeurs cérébrales IDH mutées issues de prélèvement de patients. Cette phase expérimentale sera conduite sur l'établissement n° 1. Les radiotraceurs seront caractérisés in vivo par imagerie nucléaire au sein de l'établissement n° 2.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront la validation d’un nouvel outil en neuro-oncologie pour l’exploration des gliomes car, à l’heure actuelle, aucun examen non-invasif n’est suffisamment spécifique et sensible. L’étude préclinique fournira des informations essentielles pour la poursuite d’un radiotraceur candidat vers un passage à l’Homme. Le radiotraceur pourra ensuite plus largement être proposé pour d’autres études cliniques ou précliniques à l’ensemble de la communauté scientifique s’intéressant à la thématique. A long terme, l’objectif ultime serait d’avoir, pour les patients, un examen d'imagerie médicale non-invasif permettant à la fois le diagnostic, l’évaluation de l’éligibilité au traitement, le suivi d’efficacité et la détection de rechute. Enfin, les données acquises lors de cette étude permettront alors d'obtenir des financements pour une études chez l'Homme.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale et une analyse d’imagerie : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 3h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux. Cette longue procédure permet d'évaluer un maximum de paramètres sur un seul animal et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des prises de sang seront effectuées 1-2 fois par semaine sous anesthésie avec une durée environ 2 minutes (total de prélèvements de sang = 4). Dans un second temps, deux examens d'imagerie nucléaire seront réalisés sous anesthésie, dont la durée sera plafonnée à 4h, avec injection de radiotraceur.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue chez les animaux est relative à la chirurgie et à la période postopératoire. Il s’agit plus précisément de : - stress de l’anesthésie, hypothermie ; - hémorragique puis possible œdème cérébral au niveau du cerveau pendant la chirurgie ; - la douleur modérée en postopératoire ; - risque d’infection au niveau des points de sutures. La principale nuisance attendue sur la partie d’hébergement : développement des signes cliniques de déficits neurologiques focaux. Pour les prélèvements (sang) : stress de l’anesthésie, légère douleur possible. Une surveillance des paramètres comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de détecter les complications inattendues. Lors du premier examen avec réveil de l’animal, le porc sera en anesthésie générale, intubé et aura un cathéter sur une veine de l’oreille. Les nuisances sont le stress lors de la prémédication et l’injection intra-musculaire d’un mélange de médicaments d’anesthésies sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que de la douleur générée par l’injection du mélange (volume de 10 mL). La procédure se poursuit par la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde. Un défaut d’anesthésie générale pourrait être source de nuisances et avoir comme effets indésirables : myoclonies, mouvements respiratoires spontanés, lutte contre le respirateur, étirement ou agitation des membres, hypertension.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau et les tumeurs sur lesquels des examens in-vitro histopathologiques seront réalisés afin de caractériser notamment le niveau d’expression IDH dans les tumeurs.

Remplacement

Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons étudier le devenir des traceurs dans les tissus. Nous avons donc besoin des organes entiers dans leur environnement ainsi que d’une circulation sanguine efficace pour assurer la biodistribution du traceur dans l’organisme. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP-IRM) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants car les interactions physiopathologiques sont incomplètement modélisées par les systèmes in vitro (organoïdes, organ-on-chip). Les équipements d’imagerie (TEP-IRM) sont adaptés au porc. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celles obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’homme.

Réduction

Chaque animal sera utilisé au cours de plusieurs séances d’imagerie. Ce suivi longitudinal permet de suivre des modifications structurales et fonctionnelles sans avoir à mettre à mort les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de s'affranchir de la variabilité structurale d'un animal à un autre. Il n’existe pas de test de puissance disponible pour déterminer le nombre optimal d’animaux, car il s’agit de nouveaux radiotraceurs dont les caractéristiques ne sont pas encore connues. Par contre, l’étude réalisée pourra servir de base pour les tests de puissance de projets futurs utilisant ce même radiotraceur. Les données seront analysées au fur et à mesure et dès que les paramètres attendus seront obtenus, le protocole s’arrêtera. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés par radiotraceur (n=8) est un maximum. Par exemple, si les paramètres attendus sont jugés non atteignables (e.g. pas de pénétration intracérébrale du traceur), la procédure s’arrêtera immédiatement. Les modalités d’imagerie in vivo ont l’avantage de permettre un suivi longitudinal des animaux, diminuant ainsi leur nombre, chaque animal qui entrera en campagne d’expérimentation aura 3 examens d’imagerie (une IRM et deux TEP).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique. La surveillance est renforcée durant la période post-opératoire et en cas d’apparition de troubles. Pendant la procédure chirurgicale, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Lors des examens d’imagerie, l’animal sera sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée à ce type procédure, permettant à l'animal de ne ressentir aucune douleur. Le cerveau sera prélevé pour alimenter une collection de données en cas de validation d’un radiotraceur candidat et réaliser des caractérisations in vitro de la tumeur.

Choix des espèces

Le porc est le modèle non-primate le plus proche de l'Homme, à la fois anatomiquement et physiologiquement. En effet, la taille de son cerveau est compatible avec la résolution de la caméra sur laquelle seront réalisés les examens d'imagerie et son organisation neurochimique est proche de celle de l’Homme, ce qui favorise l’aspect translationnel du projet. Les porcs utilisés en étude sont de jeunes animaux, car l'injection des tumeurs doit être réalisée chez les miniporcs de moins de 5 mois, période pendant laquelle les sinus ne sont pas encore bien développés.

Une chirurgie de 45 minutes implante des cellules tumorales dans le cerveau de souris, suivie de trois mois de traitement, avec jusqu'à trois administrations par jour, douze séances d'imagerie sous anesthésie et six prélèvements sanguins en 24 heures. 7 320 souris, immunocompétentes ou immunodéprimées, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente le suivi par imagerie comme une méthode "non invasive pour l'animal et sans douleur", alors qu'il décrit par ailleurs l'injection du substrat bioluminescent et la contention comme pouvant "générer du stress et de la douleur légère". Toutes sont mises à mort en fin d'étude pour prélever le sang, la tumeur et d'autres organes, échantillons qui pourront servir à des études ultérieures.

Objectifs

Les glioblastomes sont des cancers du cerveau dont l’incidence augmente avec l’âge mais qui sont également décrits chez l’enfant et l’adolescent. Ces tumeurs se forment à partir des cellules gliales, des cellules qui soutiennent et protègent les neurones dans le cerveau. Il existe trois types de gliomes : l'astrocytome, l'épendymome et l'oligodendrogliome. Le glioblastome représente la forme la plus agressive ; il correspond à l'évolution d'un astrocytome vers un stade de malignité avancé. Le pronostic de ces cancers reste difficile, et leur localisation dans le cerveau rend l'accès à la tumeur particulièrement complexe pour les médecins. Le traitement actuel repose sur trois approches, chirurgicale pour retirer la plus grande partie possible de la tumeur, radiothérapie, et pour certaines tumeurs, chimiothérapie. L'opération seule guérit rarement le patient et d'autres traitements sont souvent nécessaires. Ces raisons nous poussent à nous consacrer au développement de solutions thérapeutiques innovantes. Notre projet vise à évaluer de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. Le cerveau est protégé par la barrière hémato-encéphalique (BHE), un mécanisme physiologique qui restreint l'accès de nombreuses substances présentes dans le sang au tissu cérébral dans le but de le préserver. Afin de reproduire fidèlement cette contrainte, nous implantons les cellules tumorales dans le cerveau de souris, par voie chirurgicale. Cette approche permet de recréer la tumeur dans son environnement d'origine et d'en respecter les spécificités biologiques. L'efficacité des traitements à évaluer est mesurée par bioluminescence, une technique d'imagerie de haute précision permettant de détecter des tumeurs invisibles à l'œil nu. Un suivi hebdomadaire et un suivi clinique quotidien est instauré pour suivre l'évolution tumorale durant 3 mois. En parallèle, nous effectuons des analyses sanguines pour identifier des biomarqueurs et réalisons des prélèvements d'organes en fin d'étude afin de confirmer que les molécules modulent effectivement leurs cibles thérapeutiques. Nous testons ces médicaments en monothérapie ou en association avec les chimiothérapies, en optimisant les dosages et la fréquence d'administration. Notre objectif ultime est d'obtenir une régression tumorale partielle ou totale en développant de nouveaux médicaments efficaces, tout en améliorant significativement la qualité de vie des patients atteints de glioblastome.

Bénéfices attendus

Dans le processus de développement d’un nouveau candidat médicament, ce type d’étude intervient après les phases de présélection in vitro sur des lignées cellulaires et de modélisation informatique in silico. Des études sont préalablement réalisées pour caractériser la croissance tumorale et définir les conditions optimales de greffe (densité cellulaire, sélection de la souche de souris, etc.) dans un autre projet que celui-ci. Ces étapes permettent également de déterminer les fenêtres thérapeutiques optimales pour chacune des lignées tumorales constituant nos modèles de pharmacologie. Dans le cadre de ce projet des greffes de tumeurs humaines ou murines sont réalisées chez des souris immunodéprimées afin d’évaluer l’impact du système immunitaire sur nos candidats médicaments sans risque de rejet de greffe mais également immunocompétentes ce qui pourra nous permettre d’évaluer des candidats médicaments sur des tumeurs humaines. L’objectif à court terme est de pouvoir tester et sélectionner les meilleurs candidats médicaments dans un contexte de passage de la barrière hématoencéphalique. Les bénéfices attendus sont : -A court terme évaluer chez la souris l’efficacité de ces candidats médicaments seuls ou en combinaison pour à moyen terme justifier les choix de dose et de candidats chez l’homme -Etablir une relation entre la quantité de candidat médicaments détecté dans le sang ou la tumeur et l’efficacité observée et ainsi mieux comprendre et exploiter les données générées -Investiguer la persistance d’efficacité du traitement après observation d’une régression tumorale. A plus long terme l’objectif est de mettre à disposition des patients une nouvelle option thérapeutique et d’améliorer leur survie après diagnostic et leur qualité de vie.

Procédures

- Chirurgie : cette chirurgie durera 45 minutes maximum par animal et sera réalisée une seule fois avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, anesthésie, protocole analgésique pré et post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Prélèvements de sang : Faible volume, tout au long de l’étude pour une durée maximale de 3 mois pendant environ 20 secondes/souris. Réalisable plusieurs fois sur un même individu (jusqu’à 6 prélèvements maximum/24h). En fonction de l’intérêt, le prélèvement de sang ou la cinétique peuvent être réitérés à 2 semaines d’intervalle, en respectant les recommandations de la structure chargée du bien-être animal (SBEA). - Imagerie sous anesthésie : Une fois par semaine, 12 fois maximum au cours de l’étude. - Administration d’un composé ou d’une association de composés au maximum 3 administrations par jour (environ 30 secondes par administration, Exceptionnellement 4 administrations/jour avec dans ce cas un suivi par la structure de bien-être animal), durée de traitement de 3 mois maximum. - Prélèvement terminal de sang réalisé sous anesthésie générale profonde en fin d’étude (une seule fois, environ 30 secondes/souris).

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut survenir lors : − de la phase chirurgicale sous anesthésie nécessaire à l’administration des cellules (d’une durée d’environ 45 minutes) et la phase post-opératoire : Stress et douleur modérée durant les 24 premières heures -de la phase de pousse de la tumeur (évaluée durant 90 jours maximum). Stress et douleur légère. L’évolution de la tumeur pourrait potentiellement avoir des effets neurologiques (Stéréotypie , trouble locomoteur) liés à la pousse de la tumeur et la structure cérébrale ciblée, ce qui pourrait engendrer une douleur et un stress légers. - de l’évaluation hebdomadaire par imagerie réalisée après induction d’une anesthésie gazeuse et injection du substrat bioluminescent d’une durée de 20 min à chaque mesure (Stress léger). -des injections nécessaires à l’administration de substrat bioluminescent pour chaque mesure par imagerie et d’anesthésiques et d’analgésiques lors des soins pré- péri-, post-opératoire, et également lors de la mise à mort : chaque contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent générer du stress et de la douleur légère − de l’administration répétée de candidats médicaments testés. La contention de 30s et l’injection d’environ 10s peuvent également générer du stress et douleur modérée − des prélèvements de sang sur animal vigile. La contention d’une durée maximale de 2 min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et une douleur modérée − des signes cliniques observables associés à des effets des composés testés / candidats médicaments étudiés pendant une durée maximale de 3 mois (troubles du comportement, altération de l’état général) qui peuvent générer du stress et une douleur modérée

Devenir

A la fin de chaque étude, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes d’intérêt pour analyse selon la question scientifique posée. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacité et d’engagement de cible.

Remplacement

Ce projet a pour but l’évaluation de l’activité anti-tumorale de composés sur des tumeurs implantées par voie intracérébrale chez la souris immunodéficiente ou immunocompétente. L’implantation des cellules dans le cerveau permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du cerveau présentant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. De plus, cette localisation ajoute une complexité au développement du médicament qui se doit d’avoir des propriétés physico-chimiques spécifiques pour atteindre la tumeur et franchir la barrière hématoencéphalique tout en interagissant avec la cible. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le micro-environnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives. En amont de l’évaluation de l'activité vivo, une sélection in vitro sur culture de cellule sera réalisée, qui a pour objectif de vérifier le passage de la BHE. Les produits capables de passer la barrière seront sélectionnés selon leur devenir dans l’organisme pour être testés in vivo sur des modèles greffés dans le cerveau, site d’origine de la tumeur afin de vérifier leur activité sur les cellules tumorales et la cible. C’est en effet dans un organisme vivant complet que l’on peut mesurer les paramètres pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux et notamment la relation entre le devenir du médicament dans l’organisme et son action biologique.

Réduction

Avant d’être évalués chez l’humain, ces candidats médicaments font l'objet d'une évaluation initiale in vitro en laboratoire, avant d'être testés sur des modèles murins (souris) porteurs de tumeurs. Ces phases de pré sélection in vitro vont permettre d’identifier au préalable les molécules inhibant la cible de manière spécifique et ayant une efficacité antitumorale in vitro importante afin de ne tester in vivo que les composés prometteurs qui ont les bonnes propriétés. • L’évaluation de la capacité du composé à passer la BHE est également un critère évalué afin de restreindre les composés investigués chez l’animal au strict composé remplissant les critères de passage de la BHE. La tolerabilité de ces composés sera également un critère pris en compte afin de réduire au maximum les composés évalués et donc le nombre d’animaux. • Les conditions et cinétique de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminées au préalable dans un projet dédié et permettent de définir les conditions optimales de greffe, la fenêtre de traitement et le nombre d’animaux nécessaires dans chaque groupe après une modélisation statistique rigoureuse. • En fin d’étude, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui seront utilisés pour des études complémentaires (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Des prélèvements de fluides, organes et structures du cerveau seront réalisés également. Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. • De plus, afin d’inclure dans les études toutes les souris greffées, nous utiliserons l’imagerie par bioluminescence pour randomiser les animaux, au fur et à mesure du développement de la tumeur, sur la base d’une croissance tumorale similaire permettant ainsi de maximiser le taux d'inclusion. • Le design expérimental sera revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de souris dans chaque groupe et étude selon la lignée cancéreuse étudiée. L’objectif est d’obtenir des conclusions fiables en utilisant le nombre d’animaux le plus faible possible.

Raffinement

La procédure de greffe dans le cerveau est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie sous anesthésie générale gazeuse et avec analgésie pré, péri et post-opératoire, avec un maintien de la température corporelle dès l’anesthésie jusqu’au réveil total de la souris. • Les souris seront replacées en hébergement groupé après la chirurgie après leur réveil. • Mise en place d’un gel alimentaire nutritif préventif systématiquement 3 à 5 jours avant la chirurgie pour habituation des animaux à cet aliment pour une meilleure prise en post chirurgie et tout au long de l’étude. • L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs comportements naturels et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Les animaux font l’objet d’une observation clinique en post chirurgie et tout au long de l’étude via l’utilisation d’une grille de scoring par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe d’altération de l’état général de l’animal, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la structure de bien-être des animaux et les points limites seront appliqués. • Les animaux peuvent être hébergés dans des cages connectées. Ce mode d’hébergement pourra permettre de suivre, au cours de l'étude, d’éventuelles altérations de l’activité cumulée des souris dans une cage. Avec ce système l’analyse des résultats fournira une meilleure documentation des modèles et du bien-être des animaux mais également des réponses aux médicaments. • Le suivi de la croissance tumorale par l’imagerie sous anesthésie gazeuse est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur qui permet de suivre un même animal tout au long de l’étude sans avoir à euthanasier les animaux à chaque temps de mesure.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe dans le site initial de développement du cancer, donc ici dans le cerveau chez la souris, est couramment utilisée dans les études précliniques visant à étudier les cancers du cerveau. La souris constitue en effet un modèle de choix grâce à l’accessibilité pour l’implantation des tumeurs et la maturité précoce du cerveau murin. Les animaux utilisés seront des souris immunocompétentes ou immunodéprimées pour permettre la prise de greffe de cellules humaines d’intérêt. Le phénotype dommageable lié à l’absence génétique de système immunitaire de ces dernières est maitrisé par les conditions strictes d’hébergement de notre animalerie protégée. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie du fait de l’atteinte d’un poids corporel suffisant pour la récupération post opératoire et de la maturité cérébrale adaptée.