Cancers

Les souris utilisées sont immunodéficientes, condition qui permet la prise de greffe des tumeurs et les expose à un risque infectieux accru que le porteur dit surveiller. 256 souris âgées de six semaines reçoivent une injection de cellules tumorales de carcinome de Merkel sous anesthésie gazeuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Suivent deux injections de la thérapie cellulaire testée à une semaine d'écart, des mesures de tumeur au pied à coulisse et des pesées deux à trois fois par semaine, deux prélèvements sanguins et deux examens IRM, sur 45 jours au plus. Toutes sont mises à mort à l'issue, le porteur indiquant que le maintien en vie est impossible du fait de la tumeur induite et que les tumeurs et les organes lymphoïdes doivent être prélevés.

Objectifs

Le carcinome de Merkel est un cancer cutané rare et agressif. Son incidence est en augmentation. Les facteurs de risque de survenue sont : l'âge, la peau claire, le sexe masculin et les antécédents d'immunodépression. 50% des patients ne répondent pas aux traitements les plus récents. Nous avons développé in vitro un traitement par thérapie cellulaire destiné à soigner ce cancer. Nous avons besoin d’étudier l’effet de ces traitements dans un modèle de tumeur chez la souris. Pour cela, nous allons induire chez la souris des tumeurs de carcinome de Merkel, puis injecter aux souris la thérapie cellulaire, en la comparant au traitement de référence actuel. Cette étape est indispensable pour vérifier l'efficacité et la sécurité du traitement avant toute utilisation chez l'être humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de déterminer si cette nouvelle thérapie cellulaire pourrait constituer une option thérapeutique pour les patients atteints de carcinome de Merkel. Les résultats obtenus chez l'animal sont nécessaires pour constituer le dossier réglementaire permettant de demander l'autorisation de réaliser un premier essai clinique chez l'homme.

Procédures

Chaque souris recevra au jour 0 une injection de cellules tumorales, sous anesthésie gazeuse. La procédure dure environ 30 secondes. Si la phase de validation est concluante, les animaux de la phase thérapeutique recevront deux injections d’une minute environ, à une semaine d’écart, sous anesthésie gazeuse, vers J14. Les animaux feront également l’objet de mesures régulières : suivi tumoral au pied à coulisse (deux à trois fois par semaine) et pesées (deux à trois fois par semaine), sans anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J14 et J30 sous anesthésie gazeuse, pour analyses biologiques. Ils dureront environ 20 secondes. Enfin, deux examens IRM seront effectués à J14 et J30 sous anesthésie, pour une durée de 20 à 40 minutes. L’ensemble des procédures s’étend sur une période maximale de 45 jours, avec une surveillance clinique régulière.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées dans le cadre de ce protocole comprennent un stress lié aux manipulations répétées (mesures tumorales, pesées, injections), ainsi qu’une douleur légère et transitoire associée aux injections sous-cutanées et intraveineuses. La croissance tumorale progressive peut entraîner une tension cutanée locale. Compte tenu du statut immunodéprimé des souris, un risque infectieux accru est également pris en considération et fera l’objet d’une surveillance attentive.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés. Le maintien en vie n’est pas possible en raison de la tumeur induite ; de plus, les tumeurs et les organes lymphoïdes seront prélevés pour réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Conformément au principe de remplacement, les thérapies cellulaires développées dans ce projet font l’objet d’une évaluation préalable in vitro, incluant des tests de cytotoxicité, d’activation et de phénotypage des sous-populations lymphocytaires. Toutefois, l’évaluation in vivo demeure indispensable pour appréhender des paramètres biologiques qui ne peuvent être reproduits en culture cellulaire, notamment la vascularisation tumorale, l’infiltration immune au sein du microenvironnement tumoral et la cinétique tumorale systémique. À ce jour, aucun modèle alternatif in vitro ou in silico ne permet de restituer l’ensemble de ces interactions complexes, justifiant le recours à un modèle murin pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le principe de réduction est appliqué à travers une stratégie expérimentale structurée visant à limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Le projet repose sur un design séquentiel de type go/no-go : la phase thérapeutique n’est engagée qu’après validation préalable de la prise tumorale, ce qui évite l’utilisation d’animaux supplémentaires en cas d’échec initial du modèle. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’un calcul statistique préalable intégrant l’effet attendu, la variabilité estimée et la puissance souhaitée, afin de ne pas exposer plus d’animaux que nécessaire. Par ailleurs, la randomisation des animaux est réalisée après homogénéisation des volumes tumoraux, ce qui permet de réduire la variabilité intergroupe et d’optimiser la puissance statistique. Enfin, la définition d’un endpoint principal unique limite les comparaisons multiples et contribue à rationaliser l’effectif expérimental.

Raffinement

Le principe de raffinement est intégré à l’ensemble du protocole afin de réduire au maximum la contrainte et la souffrance potentielle des animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Un tapis chauffant et du gel oculaire sont utilisés pour améliorer le confort de l'animal. Une grille de score clinique standardisée est appliquée tout au long de l’étude, avec une surveillance renforcée et une euthanasie anticipée dès qu’un critère d’endpoint humanitaire est atteint. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé et expérimenté afin de limiter la durée et la répétition des gestes techniques. Les conditions d’hébergement participent également au raffinement. Les souris sont maintenues environnement contrôlé et stable. Un enrichissement du milieu est mis en place afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de réduire le stress : ajout de matériaux de nidification (papier, coton compressé), abris ou tunnels, ainsi que structures favorisant l’exploration. Les animaux sont hébergés en groupe lorsque leur état clinique le permet, afin de préserver les interactions sociales. En cas d’altération de l’état général ou de nécessité vétérinaire, un isolement temporaire peut être instauré. L’ensemble de ces mesures vise à améliorer les conditions de vie des animaux et à minimiser l’impact des procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les modèles immunodéficients permettant la prise de greffe tumorale sont disponibles chez la souris. Les animaux utilisés dans ce projet sont des souris adultes jeunes, âgées de six semaines au moment de leur inclusion dans l’étude. Ce stade de développement correspond à la fin de la période juvénile et au début de l’âge adulte, lorsque la croissance somatique est stabilisée et que les paramètres physiologiques sont matures. Le choix de ce stade présente plusieurs avantages scientifiques et éthiques. D’une part, il garantit une meilleure homogénéité des animaux en termes de poids, de développement immunologique et de capacité de cicatrisation, ce qui contribue à réduire la variabilité expérimentale. D’autre part, l’utilisation d’animaux jeunes adultes permet d’éviter les contraintes associées aux stades néonataux ou sénescents, qui sont plus vulnérables aux stress expérimentaux et aux déséquilibres physiologiques.

Injectées une fois avec des cellules humaines de cancer du sein, sous la peau, dans la veine de la queue ou directement dans le cœur par voie percutanée, 640 souris immunodéficientes entrent dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la tumeur ou la métastase détectable, elles reçoivent jusqu'à trente-trois injections ou soixante gavages, quotidiens ou hebdomadaires selon le traitement, pendant soixante jours au maximum. Le porteur indique que les injections intracardiaques disséminent les cellules tumorales dans tout le corps et peuvent produire des métastases osseuses et cérébrales, avec douleurs et troubles neurologiques. Toutes sont mises à mort pour études sur organes post-mortem.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif constitue une forme particulièrement agressive de cancer mammaire. L’absence d’expression des récepteurs hormonaux et de la protéine HER2 limite les options thérapeutiques ciblées, rendant l’identification de nouveaux biomarqueurs et de cibles thérapeutiques cruciale pour la prise en charge des patientes. Des travaux préliminaires menés au laboratoire ont permis d’identifier deux biomarqueurs d’intérêt, dont l’expression est corrélée à la progression tumorale et au phénotype agressif de ce cancer. Nos approches in vitro ont révélé des cibles thérapeutiques potentielles liées à ces protéines, suggérant leur implication dans des voies critiques de survie et de prolifération. L’objectif principal de ce projet est de valider in vivo le rôle fonctionnel de ces biomarqueurs ainsi que l’efficacité des cibles thérapeutiques associées. Le passage au modèle animal est indispensable pour étudier ces mécanismes au sein d’un microenvironnement tumoral complexe (interactions stroma, vascularisation), ce que les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire. Plus spécifiquement, se projet vise à caractériser l’impact de la modulation des biomarqueurs d'intérêt sur la croissance tumorale et la dissémination métastatique, évaluer l’efficacité des stratégies thérapeutiques ciblant ces voies, seules ou en combinaison avec la chimiothérapie de référence, et à déterminer la valeur prédictive de ces biomarqueurs vis-à-vis de la réponse thérapeutique dans un contexte physiologique global.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein triple négatif est le sous-type le plus agressif et le plus démuni en thérapies ciblées. La validation de l'efficacité préclinique de molécules d'intérêt (seules ou en combinaison avec le Taxol) offrira un rationnel solide pour de futurs essais cliniques. De plus, en corrélant la réponse aux traitements avec le niveau d'expression des biomarqueurs étudiés, ce projet permettra d'en évaluer la valeur prédictive. Ce projet vise ainsi à établir des preuves de concept solides en faveur de l’utilisation de ces biomarqueurs non seulement comme cibles thérapeutiques innovantes, mais aussi comme outils de stratification des patientes. Cela s'inscrit dans la perspective concrète de développer de nouvelles approches personnalisées, maximisant l'efficacité des traitements tout en limitant les toxicités inutiles pour les patientes atteintes de cancer du sein triple-négatif.

Procédures

Les souris recevront une injection unique de cellules de cancer du sein humain. Selon le but de l'étude, cette injection sera réalisée sous la peau (pour former une tumeur locale, n=1, durée 1 minute, anesthésie locale), dans une veine de la queue (n=1, durée 1 minute, anesthésie locale), ou directement dans le cœur par voie percutanée (pour étudier la dissémination des métastases, n=1, durée 1 minute, anesthésie générale). Dès que la tumeur ou la métastase sont détectables (la métastase est détectable par imagerie), les animaux recevront des traitements (chimiothérapie classique ou nouvelles molécules) administrés soit par injection (n=7 à 33, durée 1 minute, anesthésie locale), soit par voie orale (gavage, n=60 au maximum, durée 1 minute, animaux vigiles) quotidiennement ou une fois par semaine selon le traitement. L'évolution de la maladie sera évaluée deux fois par semaine en mesurant la taille des tumeurs (pied à coulisse) et des métastases (Imagerie intravitale). Durée des procédures : maximum 60 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’engendrer des nuisances d’intensité variable. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie locale au niveau du flanc peut induire une douleur légère et transitoire au point d’injection. Le développement tumoral progressif est susceptible d’entraîner une gêne locomotrice, un inconfort, voire perte d'appétit modérés. Les injections intraveineuses par la veine caudale peuvent provoquer un stress lié à la contention, ainsi qu’une douleur légère et transitoire. Ces injections peuvent conduire au développement de métastases, notamment pulmonaires, susceptibles d’induire à terme une détresse respiratoire modérée. Les injections intracardiaques, réalisées sous anesthésie générale, comportent un risque de risque douleur ou d'inconfort au réveil. Elles induisent une dissémination systémique des cellules tumorales pouvant conduire à des atteintes métastatiques multiples (notamment osseuses et cérébrales), pouvant provoquer des douleurs, des troubles neurologiques et une altération de l’état général modérés. L’administration des traitements par voie intrapéritonéale et par gavage oral peut provoquer une douleur transitoire et induire un stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour études sur organes post-mortem.

Remplacement

Dans cette étude, les hypothèses de travail seront au préalable validées par des expériences in vitro. Un modèle de culture en 3 dimensions (sphéroïdes) en présence de matrice extracellulaire a été spécifiquement mis au point au laboratoire. Ce modèle permet de mimer l'architecture tumorale et de se rapprocher des conditions in vivo. Ce modèle se substituera aux modèles animaux pour valider le choix des composés thérapeutiques et de leur combinaison et pour réaliser l'analyse moléculaire de la réponse au traitement. Néanmoins, les expériences in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement complexe de la tumeur intégrée dans un organisme entier (interactions systémiques, vascularisation, métabolisme global), ce qui peut modifier significativement l'efficacité et la biodistribution du traitement. Seules les expériences in vivo permettent de valider les résultats obtenus in vitro, constituant ainsi une étape préclinique indispensable pour un éventuel transfert futur vers la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum requis pour garantir une significativité statistique et une robustesse scientifique des résultats. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé a priori sur la base de nos résultats préliminaires in vitro et de la littérature sur ces modèles précliniques. L’analyse des résultats sera réalisée à l'aide de tests statistiques appropriés pour maximiser l'exploitation des données générées. Outre l'approche statistique, la mesure de la croissance tumorale et le suivi des métastases par imagerie intravitale permettent d'obtenir des données cinétiques répétées sur le même animal. Ce suivi longitudinal permet de réduite le nombre total de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Afin de limiter au maximum les contraintes, la douleur et le stress subis par les animaux, plusieurs mesures de raffinement seront systématiquement appliquées à toutes les étapes du projet. Les procédures potentiellement douloureuses ou nécessitant une immobilité stricte (injection intracardiaque, imagerie par bioluminescence) seront réalisées sous anesthésie générale . Pour les injections répétées, une anesthésie locale sera appliquée et les sites d'injection seront alternés. Pour le gavage, des canules souples de taille adaptée seront utilisées pour éviter toute lésion œsophagienne. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de bonne pratique. L'utilisation de l'imagerie intravitale constitue un raffinement majeur car elle permet un suivi interne longitudinal et non invasif de la progression métastatique. Une surveillance clinique quotidienne pour l'état général et bi-hebdomadaire pour les pesées et les mesures tumorales sera mise en place. Une euthanasie anticipée sera immédiatement pratiquée si un animal atteint l'un des points limites préalablement définis.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris, qui constitue le modèle préclinique de référence pour l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques en oncologie. L'utilisation de modèles de souris immunodéficientes garantit en outre la prise et la viabilité de la xénogreffe cellulaire sans risque de rejet et permet le suivi longitudinal de la croissance tumorale et du développement métastatique. L'âge des animaux au début des expérimentations a été spécifiquement adapté aux contraintes biologiques et techniques de chaque modèle d'étude, afin d'optimiser la réussite des procédures et de limiter le nombre d'animaux nécessaires. Pour les modèles de croissance tumorale (injections sous-cutanées), des souris âgées de 5 à 6 semaines seront utilisées. L'utilisation d'animaux jeunes à ce stade de développement physiologique et immunitaire permet d'optimiser le taux de prise de greffe tissulaire et de favoriser une cinétique de croissance tumorale homogène et reproductible. Pour les modèles de formation de métastases, des souris légèrement plus âgées, de 7 à 8 semaines, seront privilégiées. Ce choix repose sur des impératifs anatomiques et techniques, un développement corporel plus avancé étant indispensable pour faciliter la réalisation des injections intracardiaques ou intraveineuses. Cela permet d'augmenter significativement le taux de succès du geste chirurgical, de réduire le temps d'intervention sous anesthésie, et par conséquent, de minimiser les risques de complications et de mortalité per-procédure pour l'animal.

Les souris sont tuées à partir d'une taille de tumeur fixée à l'avance, mesurée au pied à coulisse deux fois par semaine. 46 souris immunodéficientes NSG vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus et des organes. Elles reçoivent une injection unique de cellules humaines de cancer du sein triple négatif sous anesthésie locale, et la tumeur qui pousse peut provoquer une gêne mécanique et une perte d'appétit. Le projet ajoute deux lignées cellulaires à un projet antérieur mené jusqu'à son terme, pour les tester dans les mêmes conditions et comparer.

Objectifs

Ce projet est la suite d'un projet déjà validé et qui a donné les résultats prévus. Nous avons depuis obtenu deux nouveaux modèles cellulaires (ajout d'un gène déficient) qui nécessitent d’être testés dans les mêmes conditions pour comparaison. Cette demande a donc pour objectif de compléter le projet précédent et renforcer l’analyse biologique associée. Parmi les différents types de cancer du sein, le cancer triple négatif (TNBC) est l’un des plus difficiles à traiter. Contrairement à d'autres formes, il ne répond pas aux traitements ciblés habituels, et la chimiothérapie y est souvent peu efficace. Ce type de cancer est donc particulièrement agressif et a un risque plus élevé de récidive ou de propagation à d’autres organes (métastases). Dans une étude menée par notre équipe, nous avons découvert qu’un certain gène, est quatre fois plus souvent altéré dans les formes avancées et métastatiques de ce cancer que dans les formes précoces. Cela nous a poussés à penser qu’il pourrait jouer un rôle dans la capacité du cancer à se propager. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous avons créé en laboratoire des cellules cancéreuses issues d’un cancer du sein triple négatif reproduisant cette altération génétique. Nous avons observé que ces cellules devenaient plus agressives : elles bougent plus facilement, s'accrochent moins aux autres cellules (ce qui facilite leur dispersion dans le corps), résistent mieux à certains stress, et sont capables de survivre même dans des conditions difficiles (manque de nutriments). Ces résultats suggèrent que les mutations du gène en question pourraient rendre les cellules cancéreuses plus agressives capables de former des métastases plus facilement. Le projet de départ initial comportait trois lignées cellulaires : une lignée normale et deux clones mutés pour le gène d'intérêt. Ce projet a pour objectif de rajouter deux nouveaux modèles cellulaires qui complémentent le gène déficient des deux clones mutés (pour récupération du gène initialement muté). Les informations apportées par ces deux nouvelles lignées seront très importantes pour valider les résultats obtenus par les trois lignées du projet initial. Les résultats attendus viendront compléter nos travaux in vitro pour suggérer que la détection d’altérations du gène d'intérêt dans des tumeurs triple-négaitf est un marqueur de risque accru de dissémination métastatique et de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet de validation préclinique vise à confirmer l’implication des altérations du gène étudié dans la promotion de la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein triple-négatif. Les informations attendues sont essentielles pour passer à la phase suivante de recherche plus translationnelle visant à déterminer si ce gène pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour ce type de cancer très agressif, de mauvais pronostic et aux traitements limités.

Procédures

Injection de cellules tumorales : une fois par animal, durée 10 minutes, anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Le développement du modèle de cancer du sein triple négatif métastatique nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances modérées pour les souris. La greffe des cellules, engendre du stress et une douleur transitoire et légère chez l'animal. Le suivi longitudinal individuel de nos souris (2 fois par semaine puis 5j/semaine si nécessaire) avec la mesure de la taille tumorale peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps par habituation. La tumeur par elle même peut induire une gène mécanique et une perte d'appétit modérées

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). L’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des tumeurs et leur dissémination à d’autres organes distants. Nous avons de solides résultats préliminaires in vitro qui suggèrent que notre gène d’intérêt joue un rôle important dans la dissémination métastatique dans les cancers du sein de type triple négatif. Il est indispensable pour notre projet de tester nos hypothèses in vivo dans un modèle orthotopique et xénogénique de souris.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Les souris sont laissées une semaine en quarantaine après leur arrivée pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Les souris sont hébergées en locaux confinés dans des portoirs ventilés, avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux seront au nombre maximum de 5 par cage, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux sont surveillés et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permet de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Un pied à coulisse est utilisé pour mesurer la taille de la tumeur. Le sacrifice des animaux est effectué à partir d’une taille tumorale limite définie dans la procédure de suivi des animaux. Si une souris semble souffrir, elle reçoit une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Afin de répondre à la directive européenne 2010/63/UE sur les conditions de vie des animaux confinés, de l’enrichissement environnemental a été ajouté dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant à la détection de points limites (suivi régulier de l’état de santé des animaux et contrôle du poids).

Choix des espèces

Nous implanterons des cellules tumorales humaines. Le modèle de souris immunodéficientes NSG sera utilisé pour éviter un rejet de la greffe des cellules humaines. L'espèce souris est l'espèce de choix en oncologie préclinique. Pour ce projet, le fait qu'il soit possible d'utiliser des animaux immunodéficients bien caractérisés dans cette espèce est crucial. De plus, de précédentes études au laboratoire ont été réalisées sur ce modèle de souris avec la lignée MDA-MB-231. Nous devrions faire des mises au point supplémentaires en utilisant un autre modèle et nous utiliserions plus d’animaux pour cela. Enfin, l’animalerie du site n’héberge que des souris. Le cancer étudié apparaissant chez les adultes, les animaux auront entre 7-15 semaines au début des procédures (souris adultes).

Une partie des souris utilisées a le système immunitaire affaibli, ce qui permet d'implanter des cellules tumorales humaines, les autres gardant leurs défenses pour observer la réaction immunitaire à la greffe. 3 868 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, greffées d'un fragment de tumeur ou de cellules cancéreuses sur le flanc, prélevées de sang chaque semaine sous anesthésie et traitées par injection dans le ventre, dans la veine de la queue ou par voie orale. Certaines études imposent en plus des périodes de mise à jeun pour mesurer l'effet des traitements sur le métabolisme. Toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, le porteur écrivant que cette mise à mort respecte les règles de "bien-être animal".

Objectifs

Les cancers ont besoin de grandes quantités de nutriments pour se développer rapidement. Pour survivre et se multiplier, les cellules cancéreuses modifient leur fonctionnement afin d’absorber davantage de molécules essentielles, comme certains acides aminés (par exemple la sérine) ou des lipides tels que le cholestérol. Ces mécanismes d’adaptation représentent des points de fragilité qui pourraient être exploitées pour freiner la croissance des tumeurs. Nos travaux ont montré que certaines tumeurs, notamment les liposarcomes, mais aussi certains cancers du sein agressifs et certains cancers du rein, dépendent fortement de ces nutriments pour se développer. Nous avons également identifié plusieurs protéines jouant un rôle dans l’entrée de ces nutriments dans les cellules tumorales. L’objectif principal de ce projet est de développer et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à empêcher les cellules cancéreuses d’accéder à ces nutriments essentiels. Pour cela, deux types de traitements innovants seront étudiés : - des petites molécules capables de perturber le fonctionnement interne des cellules tumorales, - des anticorps thérapeutiques capables de reconnaître des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses, notamment celle impliquée dans l’entrée de la sérine ou du cholestérol. Ces traitements seront testés dans différents modèles de cancers chez la souris, notamment des modèles de liposarcome, de cancer du sein agressif et de cancer du rein. L’utilisation de la souris est nécessaire car elle permet d’étudier le développement de la tumeur dans un organisme entier, en tenant compte des interactions entre la tumeur, le système immunitaire et le métabolisme. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la façon dont les tumeurs puisent et utilisent leur source d’énergie pour se développer et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes utilisés par certaines tumeurs pour capter et utiliser la nourriture nécessaire à leur croissance. Il permettra notamment d’étudier le rôle de protéines impliquées dans l’absorption de molécules essentielles comme la sérine ou le cholestérol, et de déterminer si leur blocage peut ralentir le développement tumoral. Ce projet contribuera également au développement de nouveaux médicaments innovants, notamment des anticorps thérapeutiques et des petites molécules ciblant spécifiquement ces mécanismes. L’objectif est d’identifier les traitements les plus efficaces et les mieux tolérés afin de préparer de futures études chez l’être humain. À plus long terme, les résultats obtenus pourraient conduire au développement de nouvelles options thérapeutiques pour des cancers rares actuellement difficiles à traiter, tels que les liposarcomes, certains cancers du sein agressifs ou certains cancers du rein, pour lesquels les traitements disponibles restent limités. Enfin, ce projet pourrait contribuer au développement de traitements plus ciblés et mieux adaptés aux caractéristiques biologiques des tumeurs, avec l’espoir d’améliorer l’efficacité des soins tout en limitant les effets indésirables pour les patients.

Procédures

Lors de cette procédure le personnel qualifié sera emmené à réaliser des greffes de cellules (1min par greffe) ou morceaux de tumeurs (4 min par greffe) sur les flancs des souris. Des prélèvements sanguins sous anesthésies (1min par prélèvement) seront réalisés avant la greffe, puis une fois par semaine après la prise de la tumeur jusqu'à la fin de l'expérience. Différents traitements thérapeutiques seront administrés soit par injection dans le ventre (3s par piqure), soit par injection dans la veine (30s contention comprise) de la queue soit par voie orale (10s par manipulation).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules tumorales sous la peau peut entraîner des effets locaux modérés, tels qu’une rougeur, un gonflement temporaire, un petit saignement ou un hématome au niveau du site d’injection. Cette procédure peut également provoquer un stress modéré chez les animaux. Les traitements administrés au cours du projet nécessiteront des injections répétées pouvant provoquer des effets locaux comme des irritations, des hématomes ou une gêne au site d’injection. Dans certains cas, des effets plus généraux peuvent apparaître, notamment une fatigue transitoire ou des réactions inflammatoires. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de mauvaise tolérance. En cas d’apparition d’effets indésirables importants, le traitement sera interrompu et l’animal pris en charge selon les critères établis. Les prises de sang répétées peuvent également entraîner un stress modéré. Elles seront réalisées uniquement par du personnel qualifié et le volume prélevé sera limité afin de préserver le bien-être des animaux. Si l’état général d’un animal est jugé insuffisant, le prélèvement ne sera pas effectué. Certaines études nécessiteront une courte période de mise à jeun afin d’évaluer l’effet des traitements sur le métabolisme. Ces périodes seront strictement limitées au minimum nécessaire et les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Leurs organes seront prélevés afin d’étudier les effets de nos traitements thérapeutiques.

Remplacement

Avant toute expérimentation animale, de nombreux essais ont été réalisés sur des cellules cancéreuses en culture et sur des modèles cellulaires en trois dimensions. Ces expériences ont permis de sélectionner les traitements les plus prometteurs et de limiter le nombre d’expériences réalisées chez l’animal. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, notamment les interactions entre la tumeur, le système immunitaire et le métabolisme. L’utilisation de souris reste donc indispensable pour évaluer l’efficacité et la tolérance des traitements développés dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant le plus possible le nombre de souris nécessaires. Les résultats déjà obtenus sur cellules et lors d’expériences précédentes ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales utiles et d’éviter des essais inutiles. Les groupes expérimentaux ont été conçus pour répondre précisément aux objectifs scientifiques du projet tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées de manière à limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les interventions chirurgicales nécessaires aux greffes tumorales seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet. Après les greffes et pendant toute la durée des expériences, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’altération de leur état de santé. Le poids des animaux et la taille des tumeurs seront contrôlés régulièrement. Des critères d’arrêt précis seront appliqués afin d’éviter une dégradation excessive de l’état des animaux. Les injections et prélèvements seront réalisés par du personnel formé, avec du matériel adapté et en limitant autant que possible les manipulations stressantes. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies favorisant leur bien-être et leurs comportements naturels.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle particulièrement adapté à ce projet car son fonctionnement biologique, immunitaire et métabolique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. Elle permet d’étudier le développement des tumeurs et la réponse aux traitements dans un organisme entier, en tenant compte des interactions complexes entre les cellules cancéreuses, le système immunitaire et le métabolisme. Certaines souris utilisées dans ce projet présentent un système immunitaire affaibli, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines et l’étude de cancers proches de ceux observés chez les patients. D’autres souris possèdent un système immunitaire normal, permettant d’évaluer l’impact des traitements sur les interactions entre la tumeur et les défenses immunitaires. Les expériences seront réalisées sur de jeunes souris adultes, âge auquel leur organisme est stable et adapté à ce type d’étude, tout en limitant les risques liés au vieillissement.

Les souris rejoignent l'évaluation des vaccins une fois leur tumeur parvenue à 150 mm3. 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour tester des vaccins contre le carcinome à cellules de Merkel. Huit servent d'abord à caler la dose de cellules tumorales, les trente-deux autres reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau puis quatre injections vaccinales espacées d'une semaine, avant d'être tuées vingt-huit jours plus tard. Le porteur indique qu'une graine de tournesol ou une cacahuète est proposée après chaque injection, et justifie l'effectif de huit souris par lot par une puissance statistique suffisante, sans donner de calcul.

Objectifs

Le carcinome ? cellules de Merkel (CCM) est un cancer rare et agressif de la peau qui touche principalement les personnes ?g?es de plus de 65 ans et les personnes dont le syst?me immunitaire est affaibli. Sa fr?quence augmente progressivement et la survie des patients ? 5 ans reste limit?e. Lorsque la maladie est avanc?e et ne peut pas ?tre trait?e par chirurgie, les possibilit?s th?rapeutiques restent encore insuffisantes pour obtenir des r?ponses durables chez tous les patients. L'objectif de ce projet est de d?velopper et d'?valuer de nouveaux vaccins th?rapeutiques capables d'aider le syst?me immunitaire ? reconna?tre et ? ?liminer les cellules tumorales du carcinome ? cellules de Merkel. Pour cela, des souris seront utilis?es afin de reproduire la maladie et d'?tudier l'efficacit? de diff?rents vaccins candidats. Apr?s l'apparition des tumeurs, les animaux recevront soit un vaccin candidat, soit une pr?paration contr?le. L'?volution de la taille des tumeurs sera ensuite suivie afin de d?terminer si ces nouveaux traitements permettent de ralentir ou de r?duire leur d?veloppement.

Bénéfices attendus

Cette ?tude vise ? ?valuer une nouvelle strat?gie th?rapeutique pour les carcinomes ? cellules de Merkel (CCM) dus au MCPyV pr?sentant une r?sistance primaire ou acquise aux immunoth?rapies actuellement disponibles. L'efficacit? de cette approche sera appr?ci?e au travers de sa capacit? ? ralentir la croissance tumorale, ? r?duire le volume des tumeurs, voire ? obtenir une r?gression tumorale. Au-del? de ce projet, ce travail permettra de valider le potentiel d?une plateforme vaccinale fond?e sur l'utilisation de la capside du virus de l'h?patite B comme vecteur d'antig?nes. Cette d?monstration de preuve de concept pourrait ouvrir la voie au d?veloppement de nouvelles strat?gies vaccinales th?rapeutiques applicables ? d'autres cancers ou ? des maladies infectieuses.

Procédures

L'ensemble des animaux exp?rimentaux recevront une injection sous-cutan?e de cellules tumorales (proc?dure 1) ou dans le cadre de la proc?dure 2 une injection sous-cutan?e de cellules tumorales et 4 injections sous-cutan?es de pr?parations vaccinales espac?es d?une semaine (J0, 7, 14, 21).

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux au cours de cette ?tude seront principalement li?es au stress occasionn? par les manipulations et les contentions, ainsi qu'? une douleur l?g?re et temporaire associ?e aux injections r?alis?es pour l'implantation des tumeurs et l'administration des vaccins candidats. Ces interventions seront de courte dur?e (moins de 20 secondes par injection et par manipulation). Le volume maximal des tumeurs ainsi que leur localisation ont ?t? choisis afin de limiter autant que possible l'impact sur les d?placements et les activit?s normales des animaux. Toutefois, le d?veloppement des tumeurs peut entra?ner une alt?ration de l'?tat g?n?ral des souris, pouvant se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilit? ou une baisse de la r?activit?. Les animaux feront l'objet d'une surveillance r?guli?re afin de limiter leur inconfort et d'intervenir d?s l'apparition de signes de souffrance.

Devenir

Proc?dure 1 : Les 8 souris utilis?es pour d?terminer la dose de cellules tumorales ? injecter seront euthanasi?es au plus tard ? J28 apr?s l'implantation des cellules tumorales, ou avant ce d?lai si un point limite d?fini dans le protocole est atteint. Proc?dure 2 : Les 32 souris utilis?es pour l'?valuation des vaccins candidats seront incluses dans l'?tude apr?s atteinte d'un volume tumoral de 150 mm?. Elles seront euthanasi?es ? J28 apr?s la premi?re injection de pr?paration vaccinale, ou plus t?t si elles atteignent un point limite exp?rimental. Les pr?l?vements r?alis?s apr?s euthanasie permettront l'analyse des tumeurs et des organes internes afin d'?valuer la r?ponse immunitaire induite et l'efficacit? des traitements.

Remplacement

Malgr? les progr?s r?alis?s dans le d?veloppement d'organo?des int?grant des cellules du syst?me immunitaire, ces mod?les ne permettent pas, ? ce jour, de reproduire l'ensemble des m?canismes impliqu?s dans l'induction et le d?veloppement d'une r?ponse immunitaire adaptative. L'?valuation de l'efficacit? d'une vaccination th?rapeutique n?cessite donc le recours ? un animal immunocomp?tent, seul capable de d?velopper une r?ponse immunitaire int?gr?e, faisant intervenir l'ensemble des populations cellulaires et des m?canismes effecteurs observ?s chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux n?cessaires dans chaque groupe exp?rimental a ?t? d?termin? afin d'obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilis?s conform?ment au principe de R?duction (8/lot)

Raffinement

Les injections r?alis?es par voie sous-cutan?e sont des proc?dures rapides, associ?es ? une douleur faible et transitoire. Le geste technique est parfaitement ma?tris? par les personnels impliqu?s dans la manipulation des animaux, limitant ainsi le stress et l'inconfort li?s aux interventions. Afin de favoriser une exp?rience positive lors des manipulations, une r?compense alimentaire (graine de tournesol ou cacahu?te) sera propos?e aux souris apr?s chaque injection, qu'il s'agisse de l'administration des cellules tumorales ou des pr?parations vaccinales. - Mise en place de points limites grad?s : une grille d??valuation des points limite a ?t? cr??e prenant en compte l?apparence g?n?rale, l?activit?, le poids corporel, le volume et l?aspect de la tumeur, la g?ne locomotrice li?e au d?veloppement de la tumeur et l??tat clinique global. En fonction de l??volution de ces diff?rents signes, la surveillance des animaux sera renforc?e et une prise en charge sera adapt?e.

Choix des espèces

La souris repr?sente l'animal classiquement d?crit dans litt?rature, pour ce type d?exp?rimentation. L'utilisation de ce mod?le nous permettra de valider nos observations dans un syst?me immunocomp?tent ce qui est essentiel pour envisager un d?veloppement chez l'humain par la suite. Les souris arriveront au stade 6 semaines et seront incluses dans l??tude ? 7 semaines apr?s une semaine d'acclimatation. A cet ?ge, le syst?me immunitaire est mature et permet d?avoir des r?ponses immunitaires optimales.

960 souris saines vont être utilisées pour caractériser dix candidats médicaments immunomodulateurs, chacune recevant une injection sous anesthésie puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins, également sous anesthésie, échelonnés de cinq minutes à vingt-huit jours après l'injection. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids, un pelage hérissé, une baisse d'activité, parfois des diarrhées, et dans de rares cas une hypothermie ou une détresse respiratoire. Toutes seront tuées pour le prélèvement d'organes. La réduction revendiquée ramène chaque étude de quatre-vingts à trente-deux souris, pour un total qui reste de 960.

Objectifs

Au cours de la dernière décennie, les approches immunothérapeutiques ont révolutionné le traitement des cancers. Elles visent à rendre le système immunitaire plus à même de reconnaitre les cellules tumorales et de les détruire. Ces traitements ne fonctionnent cependant que chez 10 à 40% des patients en fonction des types de cancer ce qui limite leur portée et la recherche dans ce domaine est toujours très active. Pour améliorer la portée de ces approches, notre laboratoire cherche à produire des candidats médicaments présentant une activité immunomodulatrice, c’est-à-dire qu’ils sont capables de moduler l’activité du système immunitaire. Il a été mis au point une technologie qui nous a permis de produire une série de protéines présentant une telle activité in vitro. Avant d’étudier l’efficacité thérapeutique de candidats qui ont été sélectionnés au moyen d’un crible in vitro, nous devons maintenant caractériser leur devenir (absorption, distribution et métabolisme), leurs effets sur l’organisme (pharmacodynamique) ainsi que leur innocuité chez un animal modèle sain, dénué de pathologie préexistante. Ces travaux permettront de définir les conditions de délivrance les plus appropriées pour tenter d’obtenir un effet thérapeutique optimal avec un risque de toxicité nul ou très limité. L’objectif de notre projet est donc de caractériser ces différents paramètres pour les dix meilleurs candidats médicaments préalablement sélectionnés

Bénéfices attendus

Le projet va nous permettre, pour chacun des candidats médicaments sélectionné, de connaître ses paramètres d’absorption et d’élimination ainsi que l’atteinte des tissus cibles, d’évaluer précisément ses effets sur le système immunitaire, de définir les paramètres de dose (quantité, nombre de fois, voie d’injection) adéquats pour obtenir une persistance et un effet pharmacologique significatif du candidat et enfin d’évaluer son innocuité. Cette étape est indispensable avant toute étude clinique chez l’humain. À terme, la mise au point de nouveaux médicaments immunomodulateurs pourrait avoir un impact majeur pour la prise en charge des cancers. Ils pourraient offrir une alternative thérapeutique aux patients ne répondant pas aux traitements actuels, comme certaines chimiothérapies ou immunothérapies existantes. En diversifiant les mécanismes d’action disponibles, ces nouvelles approches ouvriraient la voie à des traitements plus personnalisés, mieux tolérés et potentiellement efficaces sur un plus grand nombre de types de cancers

Procédures

Une injection d’immunothérapie sera réalisée chez les animaux préalablement anesthésiés (durée approximative de la procédure totale – anesthésie + geste -: 5 minutes). Pour évaluer le devenir dans l’organisme d’un candidat médicament ainsi que son effet sur le système immunitaire, jusqu’à quatre prélèvements de sang seront ensuite réalisés sous anesthésie. Les prélèvements seront réalisées pour des temps compris entre 5 minutes et 28 jours après l’injection (duré approximative total – anesthésie + geste - : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Certains animaux pourraient subir pendant quelques minutes une chute de température liée à l’anesthésie. De plus, une inflammation pourrait apparaître au point d’injection. Les effets indésirables les plus fréquents chez la souris après injection d’immunothérapies sont une perte de poids, un aspect “hérissé” du pelage, une diminution de l’activité et parfois des troubles digestifs (diarrhée). Dans de rares cas, des effets plus sévères de syndrome inflammatoire aigu (hypothermie ou détresse respiratoire) peuvent être observés.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin du protocole afin de prélever différents organes pour des analyses indispensables dans le cadre du protocole, notamment celles de la distribution des candidats médicaments dans les tissus.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les caractéristiques de pharmacocinétique, pharmacodynamique, biodistribution et tolérance de nouvelles immunothérapies dans l’organisme. Ces travaux ne peuvent être réalisée sans se passer de l’animal car aucune technique in vitro ne permet d’évaluer la demi-vie ou la localisation dans un organisme entier. L’utilisation d’animaux de laboratoire représente donc la seule approche permettant une évaluation de la pharmacocinétique, biodistribution et toxicité potentielle d’un candidat médicament.

Réduction

Cette technologie permet de produire de nombreuses protéines à activité immunomodulatrice. Pour réduire le nombre d’immunothérapies testées chez l’animal, nous commencerons par une évaluation in vitro afin d’identifier celles qui stimulent le mieux les cellules immunitaires. Seules les protéines les plus prometteuses seront ensuite testées chez le rongeur, soit environ dix candidats. Les expérimentations sont basées sur des modèles de rongeurs pour lesquels il existe une variabilité interindividuelle. Nous devons tenir compte de cette variabilité ce qui impose d’utiliser un effectif minimal pour garantir une validité statistique. Afin de réduire autant que possible l’effectif minimal, plusieurs stratégies seront mises en place : –jusqu’à quatre prélèvements seront réalisés sur un même animal. Ces prélèvements seront réalisés à des intervalles de temps suffisamment espacés afin de ne pas induire de douleurs –les études de pharmacocinétique, de biodistribution et de toxicité seront réalisées sur les mêmes animaux Grâce à ces approches, pour une étude nécessitant théoriquement quatre-vingt animaux, le nombre pourra être réduit de à trente-deux, tout en maintenant la robustesse scientifique des résultats.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, permettre une manipulation aisée et douce, ceux-ci seront anesthésiés avant l’injection des traitements et des prélèvements. Leur état de santé et l’apparition de signes de souffrance liés à la molécule seront surveillés tout au long de l’expérience par du personnel qualifié de façon à intervenir de manière appropriée, notamment via l’utilisation d’analgésiques ou d’antiseptiques. Une grille de score qui permet d’évaluer précisément le bien-être de l’animal, sera utilisée. Si l’un des indicateurs de cette grille révélait un état anormal, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires, notamment en cas d’atteinte de point limite les animaux seront mises à mort automatiquement afin de limiter la souffrance.

Choix des espèces

Nous réaliserons nos études chez la souris, modèle de référence en recherche biomédicale. Ce rongeur est couramment utilisé par la communauté scientifique, dans les laboratoires académiques comme dans l’industrie pharmaceutique, pour évaluer l’efficacité et la tolérance de nouveaux candidats médicaments. Les modèles murins sont particulièrement pertinents pour l’étude des immunothérapies anticancéreuses, car ils permettent d’examiner de manière contrôlée les interactions entre le système immunitaire et les traitements, et d’obtenir une première validation fonctionnelle avant le passage en clinique. Les souris utilisées seront des animaux sains, sans pathologie préexistante, afin d’éviter toute interférence avec la réponse immunitaire induite par les traitements évalués. Elles auront entre 8 et 12 semaines, âge auquel leur système immunitaire et leur physiologie sont pleinement matures. Ces conditions garantiront des résultats fiables pour l’évaluation de la biodistribution, du devenir dans l’organisme et de l’innocuité des immunothérapies testées.

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un anticorps anticancéreux par perfusion intraveineuse de trente minutes, placé sur une chaise de contention pendant environ quarante minutes. Les trois subissent quatorze prélèvements sanguins totalisant 53 ml en quatre semaines, et les deux qui poursuivent la seconde phase dix-huit de plus, pour 65 ml en cinq semaines. Deux seront tués pour le prélèvement de leurs organes, le troisième gardé en vie et réutilisable après accord du vétérinaire. L'objet immédiat de l'étude est d'affiner les doses et les protocoles d'études réglementaires ultérieures, elles aussi menées sur des primates.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets biologiques ainsi que le devenir dans l’organisme d’un anticorps développé pour cibler et éliminer les cellules tumorales dans le cadre du développement d’un futur traitement anticancéreux destiné à l’homme. Cet anticorps sera administré par voie intraveineuse chez le macaque en administration unique à trois doses distinctes (phase 1) puis selon un schéma d’administrations répétées (cinq injections) à deux niveaux de dose (phase 2). La selection des deux doses pour les administrations répétées sera basée sur les résultats des adminsitrations uniques. Cette étude permettra d’identifier les doses et les modalités d’administration les plus adaptées en vue de la réalisation de futures études à plus grande echelle et réglementaires. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection des doses du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps capable de créer une thérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études à plus grandes echelles puis des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner la meilleure dose et le meilleur schéma d’administration mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Trois animaux réaliseront la phase 1 et à l’issue de cette phase, deux animaux continueront vers la phase 2 Les animaux vigiles recevront un candidat médicament par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (faible, moyenne, haute) lors de la première phase puis deux doses seront selectionnées pour poursuivre les administrations répétées (x5) pour la seconde phase. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Pour la seconde phase, es animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 14 prélèvements de 1 à 5 ml, pour une volume total prélevé de 53 ml sur 4 semaines en phase 1 et 18 prélèvements de 1 à 8,5ml, pour une volume total prélevé de 65 ml sur 5 semaines en phase 2. Les animaux seront vigiles mais une sédation sera envisagée en cas de besoin. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur les cellules de l'immunité, une réaction de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements.

Devenir

Deux doses seront sélectionnées en fin de procédure 1 pour être évaluée dans la procédure 2 (sur 2 animaux). L’animal non utilisé pour la procédure 2 sera gardé en vie et pourra être réutilisé (après accord du vétérinaire). En fin de procédure 2, tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité du candidat médicament.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 3 primates répartis en 3 lots de 1. Il a été réduit au minimum. La période de washout (periode d'elimination de l'organisme du candidat médicament) entre les deux phases permet de réutiliser 2 animaux pour l’évaluation des doses répétées ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique. Des points limites précoces et spécifiques ont été définis et seront utilisés en cas de besoin.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, notamment en ce qui concerne les populations de lymphocytes T γδ et l'expression des cibles impliquées dans le mécanisme d'action du candidat médicament, le macaque a été retenu dans le cadre de ce projet. L’anticorps cible des récepteurs présents chez le macaque mais absents ou très différentes chez les rongeurs. En effet les rongeurs ne possèdent pas de système γδ comparable à celui de l'Homme. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet car certaines études montrent que les animaux matures (>4,5ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont implantées sous anesthésie, les composés testés sont administrés une à deux fois par jour pendant quatre semaines, et chaque souris passe 40 heures seule en cage sans enrichissement pour la mesure de la dépense énergétique. La force musculaire est évaluée par un test d'agrippement sur grille, la composition corporelle par imagerie. L'objectif immédiat reste de vérifier qu'une méthode d'induction de la cachexie par greffe tumorale est reproductible et laisse les souris survivre jusqu'aux mesures, le porteur affirmant que le recours à des animaux non-humains est "indispensable" parce que la cachexie met en jeu des interactions que l'in vitro et l'in silico ne reproduisent pas intégralement.

Objectifs

La cachexie cancéreuse est une complication fréquente des cancers avancés. Elle se caractérise par une perte progressive et importante de poids, notamment de masse musculaire et de masse grasse. Cette perte s’accompagne souvent d’une diminution de l’appétit, d’une baisse de la force musculaire et d’une augmentation des besoins énergétiques de l’organisme. À l’heure actuelle, il existe très peu de traitements efficaces et aucun médicament n’est approuvé en Europe pour traiter spécifiquement cette pathologie. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place et de caractériser un modèle expérimental de cachexie cancéreuse chez la souris, obtenu par l’implantation de cellules tumorales. Ce modèle permettra de vérifier qu’il est fiable, reproductible et qu’il induit une cachexie suffisamment marquée tout en permettant aux animaux de survivre jusqu’aux différents moments de mesure prévus dans l’étude. Un second objectif est de vérifier que ce modèle permet bien d’évaluer l’efficacité de traitements contre la cachexie. Pour cela, nous testerons un médicament qui agit sur un récepteur qui est connu pour stimuler l’appétit et améliorer la masse musculaire dans certains contextes de cachexie. Ce projet vise donc à développer un modèle préclinique robuste et pertinent permettant d’étudier les différents aspects métaboliques, fonctionnels et biologiques de la cachexie cancéreuse ; d’évaluer de nouveaux candidats thérapeutiques ciblant cette pathologie ; et de développer une expertise scientifique et technologique dans le domaine de la cachexie cancéreuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et valider un modèle murin de cachexie cancéreuse intégrant des paramètres fonctionnels, métaboliques et biologiques, ce qui représente un enjeu majeur en recherche préclinique. Les bénéfices scientifiques attendus incluent une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la cachexie, l’identification de paramètres robustes et reproductibles de suivi de la maladie, la validation d’un modèle pertinent pour le criblage de nouvelles approches thérapeutiques. À moyen et long terme, ce modèle contribuera au développement de traitements innovants destinés à améliorer la qualité de vie et le pronostic des patients atteints de cancer. Les connaissances générées pourront également être transposées à d’autres pathologies associées à la cachexie.

Procédures

Les cellules sont implantées sur animal anesthésié. L’injection dure environ 2 à 5 minutes. Le volume tumoral (longueur et largeur) sera mesuré 3 fois par semaine (2 min sur animal vigile). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par toutes les voies possibles, pendant 4 semaines maximum. L’administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 2 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre les paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements visant à quantifier des paramètres biologiques, les animaux pourront être mis à jeun pour une durée de 2h maximum avant le prélèvement. Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille en début et fin d’étude (2 minutes sur animal vigile) La composition corporelle sera mesurée en début et fin d’étude sous imagerie, cela dure moins de 2 minutes sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets indésirables liés à l’implantation tumorale (douleur transitoire, inflammation locale ou risque d’infection au site d’incision, à la progression tumorale (risque de nécrose, possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement de la tumeur), au développement de la cachexie (perte de poids, diminution de la masse musculaire et grasse, anorexie ou déshydratation). Un stress de l’animal peut être provoqué par les manipulation répétées (pesées, mesures fonctionnelles, administrations de traitement). Les prélèvements sanguins peuvent créer une lésion au niveau du site de prélèvements. Les traitements peuvent créer des lésions au niveau du site d'injection. Les mises à jeun (2h) lors de prélèvement de sang, peuvent être une source de stress pour l’animal. Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet pour prélever les organes d'intérêt.

Remplacement

Le recours à l’animal est indispensable dans ce projet car la cachexie est un syndrome systémique (cela signifie qui implique des interactions complexes entre différents paramètres: la tumeur, le métabolisme énergétique, les systèmes musculaires, immunitaires et hormonaux). Cela ne peut être reproduit intégralement par des modèles in vitro ou in silico. Un système de tissu musculaire squelettique ex vivo challengé par du milieu conditionné de cellules tumorales est décrit dans la littérature mais ne permet pas de répondre à l’ensemble des objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés : - utilisation d’un design expérimental optimisé avec groupes témoins mutualisés, - collecte de multiples paramètres sur un même animal (fonctionnels, métaboliques, biologiques), - réalisation d’une phase pilote permettant d’éviter la répétition inutile d’études non optimales, - recours à des techniques non invasives. Ces mesures garantissent une utilisation raisonnée du nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques.

Raffinement

Avant l’implantation des cellules tumorales, les animaux seront manipulés pour les habituer progressivement aux gestes de pesée, prélèvement, administration de traitement. L’implantation de cellules tumorales est réalisée sous couverture analgésique adaptée. Les animaux sont sur tapis chauffant de l’endormissement jusqu’au réveil. Après implantation tumorales, les animaux seront remis en collectif et l’état physique des animaux monitoré et scoré 1 fois par jour tout le long du projet. En cas de déshydratation, une injection de soluté de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Dans le cas d’apparition de nécrose ou tout autres atteintes des points limites, l’animal est mis à mort. Les points limites sont définis de manière conservatrice afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas d’apparition de plaies au cours de l’étude, des soins seront réalisés jusqu’à l’apparition des croûtes. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’isolement de l'animal pendant plusieurs heures se fait la veille de la mise à mort. Une acclimation de 16h la veille à 7h30 le sera réalisée avant le début des mesures.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme espèce animale pertinente pour ce projet en raison de sa large utilisation et de sa validation dans les modèles précliniques de cancer et de cachexie. Ce modèle reproduit de manière robuste les principales caractéristiques de la cachexie cancéreuse observée chez l’Homme, incluant la perte de masse musculaire et grasse, l’anorexie, l’altération fonctionnelle et les modifications métaboliques. La taille de l’animal permet également la réalisation de mesures répétées in vivo (composition corporelle, tests fonctionnels, calorimétrie indirecte) avec un niveau de stress limité. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines (jeunes adultes), afin d’étudier la cachexie cancéreuse sur un organisme mature tout en évitant les effets liés au vieillissement, tels que la sarcopénie, susceptibles de constituer un facteur de confusion.

Irradiées en totalité à faible dose puis injectées de cellules cancéreuses humaines, 87 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque semaine, pendant huit semaines au maximum, elles reçoivent dans le ventre un produit d'imagerie, sont anesthésiées puis photographiées jusqu'à trente minutes, et subissent quatre à cinq prises de sang à la queue. Le porteur annonce une leucémie avec diminution de l'activité, perte de poids et développement possible de petites tumeurs intra-abdominales dans les trois premières semaines, et la mise à mort de toutes les souris au plus tard quatre-vingts jours après l'injection. Il écrit avoir échoué à établir une alternative humaine en trois dimensions, et conclut de cet échec qu'il est "nécessaire" de passer par la souris.

Objectifs

Le but de notre projet est de fabriquer un traitement contre un cancer du sang (leucémie ou lymphome) pour lequel il n’existe pas de traitement pour les patients qui rechutent ou qui ne répondent pas au traitement de chimiothérapie classique, en utilisant les globules blancs du système immunitaire de l’Homme, aussi appelée « immunothérapie ». Nous avons dans un premier temps réalisé des tests en laboratoire, avec des cellules cancéreuses et des cellules thérapeutiques dont les résultats semblent prometteurs et nécessitent maintenant d’être confirmés sur des souris, étape indispensable avant d’envisager des études chez l’Homme. Le projet va se dérouler en 2 étapes (2 tâches) avec d’abord une tâche pour déterminer le nombre de cellules cancéreuses à injecter pour déclencher la maladie puis une deuxième tâche pour tester nos cellules thérapeutiques en présence de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Pour le type de cancer du sang que nous étudions, les traitements basés sur les globules blancs (immunothérapie) ne sont pas encore disponibles pour les patients, en dehors d’essais cliniques précoces, que ce soit pour des adultes ou pour des enfants. Notre « immunothérapie » qui utilise un autre type de globules blancs que ceux habituellement utilisés, permettrait une approche thérapeutique plus efficace et ne présente pas de risque de rejeter le traitement.

Procédures

- Une radiothérapie corps entier de faible dose de chaque animal -Une injection intraveineuse sur animal éveillé, une seule fois en début d’expérience pour 9 souris de la tâche 1, et 2 fois pour 78 souris de la tâche 2. Ces injections se feront avec contention douce et dureront moins d’une minute. - Contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, - Pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (15min max) - A l’issue des 10min d’attente, imagerie du signal lumineux (30min maximum). Ces injections auront lieu toutes les semaines pendant un maximum de 8 semaines. – 4 à 5 prélèvements de sang sur animal éveillé, au niveau de la veine de la queue, après anesthésie locale.

Impact sur les animaux

- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée, et peut induire un saignement léger au point de ponction. - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec une diminution de leur activité, une perte de poids et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans le ventre. Les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur pendant la prise des images. - Le prélèvement sanguin au niveau de la queue sera réalisé avant la prise des images, avec contention douce.

Devenir

Les souris étant dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules cancéreuses, une progression tumorale va se développer. Les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injection, ni en cas de point limite atteint. Elles seront mises à mort à la fin de l’expérimentation.

Remplacement

Nous poursuivons nos expériences sur des cellules afin de valider la fonctionnalité des cellules thérapeutiques et de limiter le nombre d'expériences réalisées sur les animaux. Cependant, à ce jour, malgré nos efforts, nous n'avons pas réussi à établir un modèle humain en 3D. Pour démontrer l'effet thérapeutique des cellules que nous développons à une fin thérapeutique il est nécessaire de mettre en place un modèle animal sur des souris. Par ailleurs tous les modèles de culture cellulaire disponibles pour l'étude du microenvironnement tumoral humain concernent les tumeurs solides et non les cancers liquides, comme les leucémies. À ce jour, aucun modèle in vitro (2 ou 3 dimensions) ni in silico ne permet de reproduire les interactions complexes entre cellules leucémiques et cellules thérapeutiques chez l’humain.

Réduction

Dans une volonté de réduction, la tâche 1 permettra de réduire le nombre d'animaux pour la tâche 2 en connaissant préalablement les bonnes doses administrées aux souris.

Raffinement

Les souris seront logées dans une grande cage suffisamment spacieuse avec des jouets et des matériaux. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être. L’utilisation d’anesthésique et la bonne organisation du plan d’expériences permet de réaliser les expériences dans un temps court afin de limiter le stress et les douleurs des souris.

Choix des espèces

La souris utilisée ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.