Cancers

Dépourvues de système immunitaire pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, et de ce fait plus fragiles face aux infections, 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue sans anesthésie, une prise de sang par semaine pendant trois semaines, puis une injection de cellules tumorales sous la peau du flanc, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à six mois. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut gêner la souris pour se déplacer et fragiliser la peau, et que la maladie peut entraîner fatigue, perte de muscle et perte de poids. Toutes seront tuées pour prélever leurs organes et leurs tumeurs et mesurer la toxicité de deux candidats médicaments, comparés à un traitement déjà administré à des patients.

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point de nouveaux médicaments « intelligents » pour lutter plus efficacement contre le cancer. Ces médicaments transportent une substance toxique pour s'attaquer aux cellules cancéreuses tout en étant plus stables dans l'organisme. Cette stabilité permet au médicament d'être plus efficace sur la tumeur tout en réduisant les effets secondaires pour le patient. Après avoir testé plusieurs options en laboratoire (test in vitro sur cellules en culture), nous avons sélectionné les deux médicaments les plus prometteurs. Nous allons maintenant vérifier, chez la souris, quelle est la dose maximale que l'organisme peut supporter sans risque (test de toxicité) et mesurer leur capacité réelle à réduire la taille des tumeurs. Nous allons faire le test en comparant ces nouvelles molécules avec un médicament déjà utilisé pour le traitement de patients.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ces médicaments de nouvelle génération représente une piste très prometteuse pour traiter le cancer de manière ciblée. Grâce à des technologies améliorées, cette stratégie permet d'attaquer directement les cellules cancéreuses tout en épargnant les tissus sains, ce qui limite les effets indésirables. Il a déjà été montré que ces agents sont capables de détruire des cellules cancéreuses (notamment issues de cancers du côlon) qui résistent habituellement aux traitements classiques. Nous espérons que cette étude confirmera l'efficacité de ces médicaments pour soigner des tumeurs solides, offrant ainsi aux patients une meilleure espérance de vie et une qualité de vie préservée durant leur traitement.

Procédures

Pour évaluer la sécurité de nos nouveaux médicaments, nous réaliserons une injection unique dans la veine de la queue (souris non anesthésiée, durée: 30s) de souris saines. Durant les trois semaines suivantes, nous effectuerons une prise de sang hebdomadaire pour surveiller leur état de santé (souris non anesthésiée, durée: 30s). Pour tester l'efficacité de nos traitements contre le cancer, nous injecterons des cellules tumorales sous la peau des souris, au niveau du flanc (souris non anesthésiée, durée: 1 min). Une fois que la tumeur aura atteint une taille définie, nous administrerons le médicament par voie intraveineuse dans la queue (souris non anesthésiée, durée: 30s). Nous observerons ensuite l'évolution de la tumeur sur une période pouvant aller jusqu'à 6 mois pour vérifier si le traitement permet de stopper sa croissance ou de la réduire. À la fin de l'étude, un prélèvement sanguin sera effectué (souris non anesthésiée, durée: 30s).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet n'ont pas de système de défense contre les microbes, leur permettant d'accepter l'injection de cellules tumorales d'origine humaine. Par contre, cela les rend plus fragile vis-à-vis des infections. L’administration du traitement et les prélèvements de sang peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire. Le développement de la tumeur sous la peau peut gêner la souris pour se déplacer. La peau au niveau de la tumeur peut également se fragiliser. Comme dans de nombreux cancers, la maladie peut entraîner une fatigue générale, une perte de muscle et de poids. Enfin, le médicament injecté lui-même peut provoquer des effets secondaires, comme des troubles de la digestion ou une baisse de l'activité habituelle de la souris.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem afin d’évaluer la toxicité des molécules sur l’organisme et sur la tumeur.

Remplacement

À l'heure actuelle, aucun test sur des cellules isolées ne permet de reproduire fidèlement les interactions complexes qui existent au sein d'un organisme vivant. Dans le corps, les cellules cancéreuses ne sont pas seules : elles interagissent en permanence avec les cellules du système immunitaire, les vaisseaux sanguins et d'autres tissus environnants. Les modèles de laboratoire actuels sont trop simplifiés et ne permettent pas de simuler cet environnement complexe. Par conséquent, pour vérifier si ce nouveau traitement est réellement capable d'atteindre sa cible et d'agir efficacement sans causer de dommages imprévus, il est indispensable de le tester sur un modèle animal vivant entier, qui est le seul capable de refléter la complexité réelle de la maladie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été précisément calculé à l'aide d'outils mathématiques pour utiliser le strict minimum nécessaire à l'obtention de résultats fiables et solides.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. En raison de leur fragilité, les souris sont hébergées dans une structure répondant aux normes sanitaires requises avec de l’eau et de la nourriture à volonté. Des enrichissements sont mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger) afin que les animaux puissent répondre à leurs besoins primaires. Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux. Trois fois par semaine, l'évaluation de signes cliniques sera réalisée à l’aide d’une grille d'évaluation comprenant différents critères comme l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En fonction de la présence et de la catégorie du critère observé, différentes actions seront mises en place: augmentation du suivi clinique, accessibilité de la nourriture facilité et euthanasie de l’animal en cas d’attente de point limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier l’effet de nouveaux médicaments sur la croissance des tumeurs. Pour ce projet, nous utiliserons des souris n’ayant pas de système immunitaire. Cela est indispensable pour que les cellules cancéreuses humaines puissent se développer chez l'animal et pour que nous puissions tester l’efficacité de nos traitements, qui sont spécifiquement conçus pour reconnaître des cibles humaines. Nous utiliserons des souris adultes pour l'ensemble des tests. Ce choix est important car les cancers que nous étudions touchent principalement des patients adultes ; il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dont le stade de développement correspond à celui des personnes que nous souhaitons soigner à l'avenir.

Les souris sont tuées quand leur tumeur atteint un centimètre cube. Elles sont 210, immunodéficientes, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales et subit dix-huit mesures au pied à coulisse, 150 d'entre elles recevant trente injections intrapéritonéales en un mois et trente autres jusqu'à trente-huit, la tumeur sous-cutanée croissant sur trois à quatre semaines avec dos voûté, activité réduite et pelage moins soigné. Le porteur cherche à savoir si le blocage d'une protéine ralentit cette croissance et présente ces travaux comme une réponse à un "besoin médical pour les patients en impasse thérapeutique", perspective qu'il renvoie à une exploration clinique ultérieure.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la progression du cancer du rein à cellules claires. Pour cela, nous utilisons des modèles expérimentaux murins permettant de reproduire la formation et la croissance de tumeurs afin d’étudier l’impact de cette protéine sur leur développement. L’objectif est de déterminer 1) si l’augmentation de cette protéine conduit à une croissance tumorale plus rapide, 2) si le blocage de cette protéine, à l’aide de nouveaux traitements utilisés seuls ou en association, permet de ralentir la croissance des tumeurs.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient contribuer à développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes à explorer cliniquement, répondant à un besoin médical pour les patients en impasse thérapeutique avec les thérapies actuelles pour le cancer du rein.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur animaux vigiles : 210 animaux : 1 injection de cellules tumorales (2 minutes) + 18 mesures de la taille tumorale au pied à coulisse (1 minute) ; 150 animaux : 30 injections en intrapéritonéale sur 1 mois (30 secondes) ; 30 animaux : 38 injections en intrapéritonéale sur 1 mois (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des effets liés à la croissance de la tumeur sous-cutanée, apparaissant progressivement sur une durée maximale d’environ 3 à 4 semaines. Cette croissance peut entraîner une gêne modérée se traduisant par une diminution de l’activité, une altération de la posture (dos voûté), une diminution de l’état général et un aspect moins soigné du pelage. À un stade plus avancé, des modifications locales au niveau de la tumeur peuvent apparaître, telles qu’une tension cutanée ou une rougeur. Les administrations répétées de traitements peuvent provoquer une gêne légère et transitoire au moment des injections, associée à un stress de courte durée lié à la manipulation des animaux. La contention nécessaire aux manipulations et au suivi peut également entraîner un stress léger et temporaire. Ces effets sont transitoires pour les manipulations et progressifs pour la croissance tumorale, qui constitue la principale source de gêne au cours de l’étude.

Devenir

Les animaux seront mis à morts pour effectuer des prélèvements lorsque la tumeur atteint 1 cm3.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire de manière complète les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle murin reste donc nécessaire pour étudier la croissance tumorale et la réponse aux traitements dans des conditions proches de la réalité biologique. Les approches in vitro sont indispensables en amont mais ne permettent pas, à elles seules, de modéliser l’ensemble de ces interactions.

Réduction

Avant la mise en place du modèle in vivo, toutes nos expériences impliquant la surexpression et l’inhibition génétique ou pharmacologique de notre protéine d’intérêt ont été validées in vitro. Les doses et modalités d’administration ont été choisies sur la base de protocoles publiés et de données expérimentales antérieures, après revue de la littérature. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous appuyons sur ces données pour définir les conditions expérimentales. La planification des expériences inclut également la mutualisation de certains groupes témoins afin d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Les analyses statistiques seront réalisées pour évaluer les effets des traitements, avec des effectifs adaptés pour permettre la détection des différences attendues.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront hébergées en cages ventilées individuellement sur portoirs adaptés afin d’assurer leur protection et de limiter le stress. Les expérimentateurs procéderont à une évaluation régulière (3 fois par semaine) de l’état général des souris à l’aide d’une grille de score, permettant de détecter toute altération du bien-être, notamment des changements de posture, de mobilité, de poids ou d’aspect général. Les points limites sont définis dans chaque procédure afin de permettre une intervention rapide si nécessaire et garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental car elle permet d’étudier la croissance tumorale et la réponse à de nouveaux traitements dans un organisme entier. Ce modèle est largement utilisé en recherche biomédicale en raison de la proximité de certains mécanismes biologiques avec l’humain et de la disponibilité de modèles reproductibles pour le type de cancer étudié. Les animaux utilisés sont des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines à leur arrivée, correspondant à des animaux ayant atteint leur maturité sexuelle et présentant une physiologie stable, ce qui permet de limiter la variabilité entre individus et d’assurer la comparabilité des résultats expérimentaux.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, privées de rate par ablation chirurgicale, et porteuses de cellules immunitaires et tumorales humaines greffées : 297 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la splénectomie viennent une injection intrapéritonéale de cellules immunitaires humaines et une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection intraveineuse d'un photosensibilisateur suivie trois heures plus tard d'une illumination de trente minutes, des injections intraveineuses hebdomadaires d'immunothérapie, des prélèvements de sang chaque semaine et des mesures de la tumeur au pied à coulisse. Dans les groupes témoins et chez les souris que le traitement ne freine pas, le porteur écrit que la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite. Il conclut que "ces nécessités, éthiques et scientifiques" justifient la mise à mort des souris en fin de procédure, après avoir écrit : "Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite".

Objectifs

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est un cancer fortement immunogène. Le traitement de première intention repose sur des thérapies ciblées quand cela est possible ou des chimiothérapies de sels de platines avec ou sans immunothérapies. Cependant certains patients échappent au traitement. Dans ce contexte, il est indispensable de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le CPNPC humain. Les paramètres de PDT-Neptune testées ont préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-Neptune dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Les bénéfices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché un nouveau traitement et d'aider dans la lutte contre le CPNPC. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines (immunitaires en IP avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm) et tumorales SC avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 23G (0.6 x 25 mm). Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intra veineuse du PS Neptune et seront illuminées (extracorporel) 3h après pendant 30 min. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection IV qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine) avec un cathéter 24G (0.7 x 19 mm) dans la veine caudale. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Pour les procédures il s’agira d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection IP du substrat lumineux avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm). Toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera euthanasié, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyse complémentaires

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être relevés sur ce projet lors de nos interventions : - injections / prélèvement sanguins / pesées ; ces actions nécessitent une contention qui peut générer un stress léger de courte durée mais répété - anesthésie; les anesthésies notamment gazeuses à l'Isoflurane peuvent également générer un stress léger de courte durée mais répété - acte chirurgical pour la splénectomie; peut générer un problème lors de la cicatrisation notamment une légère démangeaison pendant un maximum de 5 jours – la croissance tumorale: les cellules tumorales sont injectées en un point précis prévu pour ne gêner en rien le comportement normal de l'animal, un risque de gène du déplacement pourrait être observable au cours des 4 semaines mais cela sera strictement géré (cf. points limites).

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d’une masse tumorale suivi ou non d'un traitement expérimental. Selon l’efficacité des traitements la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient le sacrifice des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester l’efficacité anti tumorale de la PDT-Neptune (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des Immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de la PDT et/ou des Immunothérapies in-vitro ; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in- vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles (PS Neptune seul ; pour la PDT), non traité, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre expérience nous bénéficierons de protocoles déjà approuvés et mis en place au laboratoire, ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à l'outils de l'EDA). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans sacrifice. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnés pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro. Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Raffinement

Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de 5 animaux maximum par cage, dans un environnement enrichi (maison, carré de coton) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycles jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 à 10 jours dans leur salle d'hébergement. Concernant le projet, nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi entrainés en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférine). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faibles quantités. Nous utilisons des souris SCID pour permettre la xénogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires). Par ailleurs le campus dispose d'outils performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phase expérimentales à partir de l’âge de 7 semaines. Elles seront déjà sevrées et sexées. A ce stade de développement elles seront suffisamment robustes pour supporter les traitements et suffisamment grande pour supporter les injections et le développement des cellules tumorales.

Un donneur d'ordre extérieur a déjà obtenu des résultats sur des brebis et souhaite les prolonger : jusqu'à 10 brebis vont être utilisées, 6 si aucune procédure ne doit être interrompue, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une anesthésie de trois heures au maximum, l'ouverture d'un volet crânien, le prélèvement d'un gramme de lobe frontal et la pose d'un cathéter à travers l'os ou dans la veine jugulaire, avant d'être réveillée puis tuée vingt-quatre heures plus tard pour les prélèvements. L'objectif est de comparer les concentrations d'un anticancéreux dans le cerveau selon qu'il est perfusé par voie transcrânienne ou par voie intraveineuse. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire de travailler sur animal vivant" et retient les ovins comme "le meilleur compromis entre la taille du cerveau et la facilité de manipulation".

Objectifs

Le glioblastome est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente. On en dénombre environ 2500 par an en France. Le traitement actuel inclut un retrait de la tumeur, si elle est possible, puis une radiothérapie avec une chimiothérapie concomitante. Malheureusement une récidive survient dans 90 % des cas en moins de 2 ans. Le pronostic après la rechute est catastrophique. Un second retrait de la tumeur est parfois proposée mais il n’a pas d’impact sur la survie car la tumeur récidive localement autour de la cavité opératoire ou à distance. Un traitement post-opératoire efficace serait utile pour diminuer le risque de poursuite évolutive, notamment après un second retrait de la tumeur. Un médicament anticancéreux pourrait être utilisé à cette fin. Ce médicament est traditionnellement délivrée par voie intraveineuse. Cependant le franchissement par ce médicament de la barrière du cerveau est limité. Les principaux objectifs de ce projet sont de : - Etudier la diffusion cérébrale de ce médicament anticancéreux injectée pendant 24h par voie transcrânienne (TC) dans la cavité post-opératoire après un retrait de la tumeur chez le mouton ; - Comparer les concentrations de de ce médicament obtenues dans le cerveau après 24h de perfusion transcrânienne ou intraveineuse pour montrer l’intérêt pharmacologique de la voie TC.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de montrer l'intérêt pharmacologique de la voie TC pour l'administration du médicament anticancéreux dans le cas d'un glioblastome. Ce type d'administration pourrait permettre d'augmenter le succès du traitement tout en limitant les effets secondaires du produit.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie, d'une durée maximale de trois heures. Ils seront ensuite révéillés et mis à mort 24h après. Pour cela ils subiront : - 2 injection intraveineuse de 5 secondes sur animal vigile pour induire l’anesthésie ; - 1 intubation sur l’animal anesthésié pour le maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure, l’anesthésie durant au maximum 3 heures ; - 2 injections de 5 secondes (une IV, et une intradermique) pour l’analgésie sur animal anesthésié ; - 1 procédure chirurgicale d’une heure (maximum 2h) correspondant à la réalisation d’un volet crânien pour un prélèvement d’un gramme du lobe frontale et replacement du volet osseux, et la fixation d’un cathéter au travers du volet osseux pour une moitié des brebis ou pour l’autre moitié des brebis dans la veine jugulaire pour la diffusion du produit ; - 1 injection intraveineuse de 30 secondes sur animal anesthésié pour la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront éprouver un stress lors de l'isolement nécessaire à l'anesthésie. Ce stress sera de courte durée puisqu'il cessera lorsque les brebis seront remises par paire. Les animaux subiront une chirurgie qui pourra entrainer une douleur légère lors du réveil.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure seront mis à mort à la fin de l'unique procédure du projet dans le but de réaliser plusieurs prélèvements afin d'étudier la diffusion du médicament.

Remplacement

Il est nécessaire de travailler sur animal vivant afin d’étudier la diffusion du produit par voie transcrânienne et intraveineuse, car il n’est pas encore possible de modéliser cette diffusion ex-vivo ou in silico. Le modèle ovin est communément utilisé comme modèle préclinique lorsque des chirurgies cérébrales sont requises. Il existe certes des différences avec l’humain, mais les ovins semblent constituer le meilleur compromis entre la taille du cerveau et la facilité de manipulation. De plus, ce modèle ovin présente également l’avantage d’être adulte, ce qui permet d’étudier les réponses sur un stade physiologiquement stable. Enfin, des résultats précédents ont été obtenus sur ovins par le donneur d’ordre. Il est donc intéressant de continuer à travailler sur cette espèce pour pouvoir capitaliser sur ce modèle et comparer les résultats.

Réduction

D’après de précédents travaux, six animaux (trois pour chacun des deux traitements) seront nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dans le cas où la procédure devrait être interrompue pour une ou plusieurs brebis, le nombre total d’animaux dans le projet pourrait être augmenté jusqu’à dix afin d’obtenir une réponse aux objectifs du projet. Si la procédure se déroule sans problème sur les six premiers animaux, seuls six animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux proviendront du même troupeau et arriveront sur place une semaine minimum avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et aux manipulations et ainsi diminuer leur stress. Ils seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2), selon leur poids, dans un box sur litière de paille et disposeront d’une alimentation adaptée à leurs besoins. La chirgurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Un examen préanesthésique sera réalisé avant l’induction de l’anesthésie. Les constantes des animaux sont suivies tout au long de l’anesthésie par la mise en place d’un monitoring. Le site du prélèvement a été choisi, car cette zone ne donne pas de séquelles motrices ou sensorielles chez l’homme. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d’hébergement et au comportement des animaux. Des observations biquotidiennes, basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits, etc.), seront réalisées par une personne formée. Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux et au responsable du projet pour examen approfondi, traitements adaptées et/ou consultation du vétérinaire référent. Des points limites ont été mis en place afin de limiter le risque de souffrance des animaux pendant la procédure et différents traitements ont été prévus en cas d'atteinte de ceux-ci.

Choix des espèces

Le modèle ovin est communément utilisé comme modèle préclinique lorsque des chirurgies cérébrales sont requises. Il existe certes des différences avec l’humain, mais les ovins semblent constituer le meilleur compromis entre la taille du cerveau et la facilité de manipulation. De plus, ce modèle ovin présente également l’avantage d’être adulte, ce qui permet d’étudier les réponses sur un stade physiologiquement stable. Enfin, des résultats précédents ont été obtenus sur ovins par le donneur d’ordre. Il est donc intéressant de continuer à travailler sur cette espèce pour pouvoir capitaliser sur ce modèle et comparer les résultats. Les animaux utilisés seront adultes (physiologiquement stables) et pèseront entre 60 et 80 kg afin de présenter une taille similaire à l'adulte.

912 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 480 irradiées et 64 soumises à une chimiothérapie pour préparer la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent soixante souris nouveau-nées reçoivent une transplantation de cellules, et 128 d'entre elles une seconde neuf à douze mois plus tard. Le conditionnement peut provoquer un amaigrissement et une anémie, le traitement par voie orale une irritation de l'œsophage, et la chirurgie d'injection ajoutée par modification une douleur postopératoire et un défaut de cicatrisation. Les bénéfices annoncés vont de nouveaux essais cliniques à des économies pour les systèmes de santé, tous au conditionnel, quand la mise à mort sert dès maintenant à prélever moelle osseuse, rate et thymus.

Objectifs

La greffe de cellules souches du sang, appelées aussi cellules souches hématopoïétiques (CSH), est le traitement de référence pour de nombreuses maladies du sang, malignes (comme les leucémies ou les lymphomes) et non malignes (incluant les déficits immunitaires, en particulier chez les enfants). Cependant, la maladie du greffon contre l'hôte, les infections et les rechutes sont des obstacles majeurs au succès de cette thérapie. Certains de ces obstacles sont liés à une lente reconstitution du système immunitaire après la greffe de CSH. Dans ce contexte, une nouvelle stratégie thérapeutique a été développé pour améliorer la régénération immunitaire lors des greffes de CSH et augmenter la chance de survie des patients greffés. Cette stratégie repose sur la production in vitro de progéniteurs lymphoïdes et leur greffe, pour favoriser une production rapide de cellules immunitaires. Par rapport à la transplantation de CSH, la transplantation des progéniteurs lymphoïdes à des souris immunodéficientes nouveau-nées conduit à une régénération plus rapide des cellules du système immunitaire qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes et les cellules cancéreuses. Les progéniteurs lymphoïdes transplantés sont immatures, une caractéristique qui confère une grande sécurité à ce produit en termes de risque de maladie du greffon contre l’hôte. Nos objectifs de recherche du projet proposé sont de tester ces progéniteurs T produits in vitro pour leur capacité à régénérer les lymphocytes T de patients âgés. En effet, avec l’âge, le thymus, organe jouant un rôle central dans la production des lymphocytes T, fonctionne moins bien ce qui complique la reconstruction du système immunitaire. De précédentes études expérimentales ont suggéré que l’ajout de progéniteurs lymphoïdes lors de la transplantation de CSH améliorerait le fonctionnement du thymus. Ce processus encore mal compris nécessite une investigation approfondie pour en optimiser les effets dans le cadre de futures applications thérapeutiques de ces progéniteurs chez les personnes âgées. Cela passe par une meilleure compréhension des mécanismes de vieillissement et par l'amélioration du système immunitaire après la greffe, dans le but d'augmenter les chances de survie des patients. MODIFICATION/Le projet a été modifié afin de prendre en compte des ajustements méthodologiques issus des premières observations expérimentales.

Bénéfices attendus

Le projet actuel présente des bénéfices potentiels significatifs, tant à court qu'à long terme. Tout d'abord, les résultats attendus permettront d’approfondir la connaissance du produit de thérapie cellulaire à base de progéniteurs lymphoïdes T. Ce projet permettra d'éclaircir son mode d'action chez les individus âgés, d'affiner ses caractéristiques de qualité et d'évaluer son efficacité au-delà de la simple reconstitution des lymphocytes T. Ces découvertes pourraient déboucher sur de nouveaux essais cliniques ou sur l'optimisation des essais en cours, favorisant ainsi des avancées thérapeutiques. En outre, ce projet ouvre la voie à l'élargissement des applications thérapeutiques du produit, initialement conçu pour traiter l'immunodéficience combinée sévère chez les enfants. Les progéniteurs lymphoïdes pourraient également bénéficier à d'autres groupes de patients, notamment ceux dont la fonction thymique est diminuée, que ce soit en raison du vieillissement, du VIH/SIDA ou de l'exposition aux radiations ionisantes. Cela pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces populations vulnérables. Enfin, d'un point de vue sociétal et économique, les progéniteurs lymphoïdes pourraient réduire les hospitalisations post-greffe de cellules souches hématopoïétiques et diminuer les risques de rechutes, entraînant ainsi des économies substantielles pour les patients et les systèmes de santé. Ces bénéfices contribueront non seulement à l'amélioration des traitements actuels, mais aussi à la réduction des coûts de santé à l'échelle globale. Ce projet vise également à approfondir notre compréhension des processus de vieillissement, de dégénérescence et de régénération du thymus, organe essentiel pour la production de cellules du système immunitaire. Il propose notamment d'identifier des molécules capables d'influencer le vieillissement immunitaire et les altérations du thymus. Une connaissance fine des mécanismes permettrait une régénération de l'architecture thymique dégradée avec l’âge et faciliter une greffe plus efficace des progéniteurs lymphoïdes et une meilleure reconstitution des cellules immunitaires.

Procédures

480 animaux vigiles seront conditionnés à la greffe par une irradiation d'une durée inférieure à 5 minutes. Ce procédé est rapide et non douloureux. 64 animaux vigiles recevront une chimiothérapie de conditionnement pour la greffe, chaque traitement durant environ 1 minute/animal. 96 animaux, sous anesthésie gazeuse, recevront des molécules de régénération du thymus d’une durée de 1 minute/traitement et un seul traitement/animal. 96 animaux vigiles recevront en vigile différentes molécules de conditionnement/régénération du thymus chaque jour pendant 15 jours, chaque traitement durant 1 minute/animal. 704 animaux sous anesthésie gazeuse seront transplantés avec des cellules souches/progénitrices, durée de l’action 1 minute/animal. 160 animaux nouveau-nés vigiles recevront une transplantation de cellules (1 minute/animal). 128 d’entre eux recevront sous anesthésie une seconde transplantation, 9 à 12 mois plus tard, chaque action durant 1 minute, une seule action/animal. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront un prélèvement sanguin juste avant leur euthanasie. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront deux prélèvements sanguins au cours de leur suivi, à au moins 5 mois d’intervalle. Chaque prélèvement sanguin dure environ 1 minute. MODIFICATION/48 animaux recevront une transplantation de cellules par méthode chirurgicale sous anesthésie, durée de l’action 10 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les conditionnements à la greffe (chimiothérapie ou irradiation), nécessaires pour préparer l’organisme à recevoir une greffe de CSH et mimer ainsi les conditions des patients humains, peuvent occasionner chez la souris des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress transitoire. Le traitement par voie orale peut provoquer un stress, une douleur, et une légère irritation au niveau de l’œsophage chez l’animal surtout lors des traitements en continu. L’anesthésie gazeuse générale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. MODIFICATION/ La chirurgie d’injection ciblée peut provoquer une douleur post-opératoire transitoire, un stress lié à la procédure, ainsi qu’un risque de complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation).

Devenir

Afin de mesurer la production des cellules lymphoïdes T humaines après injection, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (Moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou non de l’injection effectuée.

Remplacement

Ce projet n'a pas d'alternative non animale. L’utilisation d’un modèle préclinique in vivo capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’Homme est indispensable pour évaluer et comprendre les effets de la greffe de progéniteurs lymphoïdes sur la reconstitution du système immunitaire. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine

Réduction

Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Toutes les souris sont hébergées en portoir à cages ventilées dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12h/12h. Chaque cage est indépendante des autres, l’air entrant est filtré et l’eau utilisé est filtrée, et donc constitue une entité séparée. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires chez les animaux greffés. Toute irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. Les greffes seront précédées par une anesthésie générale. Lors des greffes chez le nouveau-né, l’expérimentateur transfère l’odeur de la cage sur ses gants en le frottant sur la litière pour ne pas risquer une réaction négative de la mère par rapport à ses petits. En outre, les mères sont isolées durant les greffes afin de diminuer leur stress durant la manipulation des petits. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l’euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes qui reproduisent de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l’Homme. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines normales et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Nous utiliserons les souris âgées entre 9 et 12 mois. Le thymus des souris immunodéficientes âgées ressemble à celui des patients humains atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients. Nous utiliserons aussi les animaux nouveau-nés pour humaniser leur système hématopoïétique sans passer par l’irradiation.

Pour tester le chauffage de tumeurs par nanoparticules sous laser ou champ magnétique, 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement. Elles subissent une chirurgie d'implantation de tumeurs des voies biliaires, des injections dans la tumeur et par voie générale, jusqu'à quatre séances de traitement de dix minutes sous anesthésie, des échographies de suivi et des prélèvements sanguins pratiqués sur animal vigile. Le porteur qualifie de légers et de courte durée le stress et la douleur liés à chaque geste, sans décrire ce que produit la croissance tumorale elle-même. Il indique développer en parallèle des cultures cellulaires en trois dimensions pour trier les molécules en amont, ce qui réduirait le nombre de souris, et conclut que ces cultures ne suffisent pas pour évaluer les effets indésirables ni la réponse immunitaire.

Objectifs

Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).

Procédures

- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.

Impact sur les animaux

-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.

1 000 souris subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour l'injection de cellules cancéreuses dans le lobe hépatique gauche, une partie après douze semaines d'injections intrapéritonéales bi-hebdomadaires destinées à installer une cirrhose. 1 030 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une IRM une à deux fois par semaine sous anesthésie et des séances d'imagerie nucléaire pouvant durer deux heures. Le porteur écrit que les procédures d'imagerie "présentent la seule nuisance d'injecter le radiotraceur dans une veine de la souris", et décrit par ailleurs des péritonites, des lésions cutanées et un stress chronique possibles après les administrations répétées dans l'abdomen. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Le carcinome hépato-cellulaire est la cancer du foie le plus courant et représente le 6ème cancer en termes d’incidence mondiale et le 3ème cancer en termes de mortalité. Son pronostic est donc des plus sombres. De plus, les experts estiment que son indicence devrait doubler d’ici à 2050. Il représente donc un enjeu mondial de santé publique. Le diagnostic du carcinome hépato-cellulaire revêt un caractère primordial dans la prise en charge précoce du patient. Or, les outils actuels ne sont pas assez performants car soient trop invasifs soit pas assez spécifiques ou soient pas assez sensibles. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer différentes molécules associées à un atome radioactif (= radiotraceurs) en imagerie nucléaire pour améliorer le diagnostic. De plus, ces radiotraceurs peuvent aussi donner des informations essentielles aux médecins pour mieux prendre en charge le patient. Les modèles animaux sont primordiaux pour la réalisation de ce projet et doivent refléter au plus près les carcinomes hépato-cellulaire rencontrés en clinique humaine qui se développent généralement dans des contextes de foies cirrhotiques. Sur les modèles murins mis en place, plusieurs molécules ciblant les cellules du cancer du foie seront évaluées et comparées lors d’expérimentations en imagerie nucléaire.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux radiotraceurs pour imager les lésions cancéreuses dans le but d’améliorer la prise en charge des patients. Ces radiotraceurs ont pour but de combler un manque dans le diagnositc actuel de cette pathologie et d’apporter des informations supplémentaires sur les lésions hépatiques dans un but pronostique. Enfin, cette étude permettra d’étudier le potentiel de ces radiotraceurs dans le cadre d’une radiothérapie interne vectorisée.

Procédures

Prélèvements sanguins (1 min/souris) sur souris anesthésiées et en présence d'antalgique (1030 souris). Greffe de cellules cancéreuses dans le foie (30 min/souris) : souris anesthésiées + analgésiées. Chrirugie abdominale en condition d’aséptie. Injection des cellules tumorales dans le lobe hépatique gauche. Sutures des deux plans (1000 souris). Induction chimique d’une cirrhose (15 min/souris) : injection intrapéritonéale bi-hebdomadaire pendant 12 semaines maximum. Imagerie par raisonnance magnétique (IRM) (15 min/souris) : souris anesthésiées et après application d’un gel de protection oculaire. Imagerie 1 à 2 fois par semaine (1030 souris). Imagerie nucléaire (entre 10 et 120 minutes/souris) : injection du radiotraceur dans la veine de la queue sur animal vigil puis imagerie sur souris anesthésiées et après application d’un gel de protection oculaire (800 souris).

Impact sur les animaux

Les procédures visant à imager les animaux présentent la seule nuisance d'injecter le radiotraceur dans une veine de la souris. Des nuisances plus importantes sont envisagées lors de l’induction et de l’installation des cirrhoses hépatiques et lors de la chirurgie mise en place pour la greffe des cellules du cancer du foie dans un lobe hépatique. Le développement des tumeurs peut également engendrer des nuisances. La douleur liée à la chirurgie sera gérée par un traitement analgésique préventif et post-opératoire adapté. L’administration répétée dans l'abdomen de la souris peut engendrer des complications (stress chronique, lésions cutanées, péritonites). L’évolution de la cirrhose peut éventuellement induire des douleurs. Pour toutes ces nuisances et effets indésirables, l’état général sera contrôlé quotidiennement selon une grille de score permettant d’évaluer les différents pallier de douleur. L’administration d’analgésique sera en accord avec les palliers de douleur.

Devenir

Pour toutes les procédures les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

L’imagerie nucléaire s’intéresse à la pharmacocinétique d’un radiotraceur dans un organisme complexe. Il s’agit d’étudier le comportement de molécules radiomarquées une fois injectées dans un organisme. Cela met en jeu tous les organes et de ce fait, ne peut pas être remplacée par des modèles in silico ou in vitro. De plus, les pathologies telles que les carcinome hépato-cellulaire impliquent des processus physiologiques complexes mettant en jeu de nombreuses intéractions entre les différentes cellules de l’organisme.

Réduction

Les radiotraceurs seront d’abord testés in vitro avant d’être injectés chez la souris. Une même souris pourra recevoir plusieurs radiotraceurs permettant ainsi de réduire le nombre de souris nécessaire. Cela sera possible seulement pour les radiotraceurs qui porteront un atome dont la demi-vie radioactive est très courte comme le fluor-18 (110 min ou le gallium-68 (68 min). En revanche, pour les atomes radioactifs à demi-vie plus longue comme le cuivre-64 (12.7h) ou le zirconium-89 (78h), ce multiple emploi ne pourra pas être effectué. Pour chaque étude, le nombre d’animaux utilisés sera réduit à un minimum acceptable pour obtenir des informations robustes et statistiquement pertinentes. Les statistiques seront réalisées sur un logiciel dédié selon un T-test non paramétriques pour les analyses intergroupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par 3 ou 5 avec des frisottis pour pouvoir faire un nid, avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine. Lors de la chirurgie, les souris seront anesthésiées et se verront administrer des antalgiques avant et après l'acte chirurgical. L'ensemble de la chirurgie se déroule sur tapis chauffant et dans des conditions d'asepsie (champs, gants, manchettes, instruments et seringues stériles). Pendant la chirurgie, l'hydratation des souris est maintenue par l'injection de sérum physiologique tiédi à 37°C. Les souris feront l’objet d’une surveillance accrue dans les 24h après la chirurgie. Cette surveillance sera relâchée si la récupération est complète. D’autre part, les animaux seront pesés régulièrement et un suivi quotidien de leur état général sera mis en place selon une grille de score comportant 4 palliers (0 : absence de douleur, 3 : douleur sévère). L’évaluation quotidienne permettra d’ajuster le traitement analgésique. Suite aux greffes et induction de cirrhose, l’imagerie par IRM permettra de bien contrôler l’état du foie et la progression tumorale. Lors de l'étape de greffe des cellules tumorales, les souris sont préalablement analgésiées 30min avant l’intervention.

Choix des espèces

Les dispositifs d’imagerie dont nous disposons dans le laboratoire sont seulement adaptés aux souris ce qui restreint notre choix aux souris. Enfin, des modèles similaires sont rapportés dans la littérature scientifique, des protocoles éprouvés et publiés pourront servir de base pour la mise en place de nos modèles. Les souris seront utilisées à partir de 7 semaines après leur naissance, lorsque les souris ont atteint l’âge adulte, le carcinome hépato-cellulaire ne touchant que les adultes. Pour les souris saines greffées, le suivi de la pathologie par IRM se fera sur 6 semaines maximum après la greffe. Pour les souris cirrhotiques greffées, le protocole nécessite 12 semaines d’injection bi-hebdomadaire de TAA avant la greffe des cellules tumorales. Après cette greffe, le suivi de la pathologie par IRM se fera sur 6 semaines maximum.